里氏木霉qm6a及其衍生株中與交配損傷相關(guān)的基因/遺傳元件及其鑒定方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及鑒定里氏木霉QM6a菌株或其衍生菌株中與交配損傷相關(guān)的基因/遺傳元件的方法，所述方法包括：a)提供第一菌株，所述菌株是具有MAT1?2基因座的里氏木霉QM6a菌株或其衍生菌株；b)使所述菌株與第二菌株進(jìn)行有性雜交，所述第二菌株是具有補(bǔ)充的基因座(即MAT1?1基因座)的里氏木霉(紅褐肉座菌)菌株的能交配菌株；c)使來自b)中的雜交或其回交中的MAT1?1子代與a)中的第一菌株進(jìn)行反復(fù)回交，直到獲得與所述第一里氏木霉QM6a菌株或其衍生菌株基本上相同，但是攜帶MAT1?1基因座并且能夠交配以與里氏木霉QM6a或其任何MAT1?2子代雜交的菌株；d)從步驟c)選擇能夠交配以與具有MAT1?2基因座的里氏木霉(紅褐肉座菌)雜交的子代；以及e)通過將步驟d)中所選的子代的基因組和a)中第一菌株的基因組序列進(jìn)行比較，來鑒定與交配損傷相關(guān)的基因/遺傳元件，其中在第一菌株中所述基因/遺傳元件完全或部分缺失，或者以突變形式或具有缺失和/或插入的形式存在，因此是里氏木霉QM6a菌株或其衍生菌株中與交配損傷直接或間接相關(guān)的基因或遺傳元件；本發(fā)明還涉及修正里氏木霉QM6a菌株或其衍生菌株的交配損傷的方法，所述菌株具有MAT1?1基因座并且不能與具有MAT1?2基因座的里氏木霉QM6a菌株或其衍生菌株交配，其中如上鑒定的一個或多個突變的或者完全或部分缺失的基因和/或遺傳元件是被相應(yīng)的功能性基因和/或遺傳元件替代或補(bǔ)充。此外，本發(fā)明涉及由此獲得的木霉屬真菌菌株在工業(yè)育種和目的產(chǎn)物的生產(chǎn)中的用途。此外，本發(fā)明涉及與里氏木霉QM6a和其衍生菌株的交配損傷相關(guān)的基因，并且涉及里氏木霉QM6a和其衍生菌株的交配所必需的基因。
【專利說明】
里氏木霉QM6A及其衍生株中與交配損傷相關(guān)的基因/遺傳元 件及其鑒定方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ] 本發(fā)明涉及與里氏木霉(Trichoderma reesei)QM6A菌株或衍生菌株的交配損傷 (mating impairment)相關(guān)的基因/遺傳元件。本發(fā)明還涉及用于鑒定與里氏木霉QM6A及其 衍生菌株的交配損傷相關(guān)的基因/遺傳元件的方法。所述方法使得能夠快速并有效鑒定與 交配損傷相關(guān)的基因/遺傳元件。因此，本發(fā)明涉及促使操作里氏木霉的工具朝向改良和便 利的菌株育種的方向發(fā)展，從而能夠通過經(jīng)典遺傳方法改良工業(yè)生產(chǎn)菌株的方法。這不僅 在菌株育種和維持方面增加了其他工具，還允許引入來自里氏木霉的其他菌株(紅褐肉座 菌(Hypocrea jecorina))的遺傳性狀，或者允許去除菌株的不想要的基因突變和/或不想 要的基因（例如賦予抗生素抗性的基因，標(biāo)記基因，以及次級代謝、色素形成、不想要的酶的 基因等)。
【背景技術(shù)】
[0002] 絲狀真菌能夠生成大量胞外蛋白質(zhì)。但是，在天然存在的菌株中任何目的蛋白質(zhì) 的生產(chǎn)水平通常太低而無法用于商業(yè)開發(fā)，這使實(shí)質(zhì)性的菌株改良方案至關(guān)重要(Punt 2002)。在工業(yè)絲狀真菌中，這常規(guī)上是通過經(jīng)典誘變和/或靶基因操作結(jié)合蛋白質(zhì)工程來 實(shí)現(xiàn)。所述方法基本上由以下步驟組成:使真菌接受亞致死劑量的誘變劑(通常使用例如， 通過紫外線或電離輻射照射，添加化學(xué)誘變劑例如亞硝基甲基胍、甲基磺酸乙酯或溴化乙 錠），以及隨后篩選存活菌株中所需產(chǎn)物的改良的生產(chǎn)。這種方法顯然僅與選擇方法一樣 好。
[0003] 里氏木霉(有性型紅褐肉座菌）是酶的工業(yè)生產(chǎn)的主要生物。通過使用隨機(jī)誘變， 學(xué)術(shù)和工業(yè)研究項(xiàng)目在幾十年中已經(jīng)制備了酶產(chǎn)率比"原始"里氏木霉菌株QM6a高出數(shù)倍 的里氏木霉菌株，所述"原始"里氏木霉菌株QM6a于1944年從所羅門群島的美軍帳篷帆布中 分離（LeCrom et al.2009)。
[0004] 但是，使用隨機(jī)突變進(jìn)行菌種改良的主要限制源于以下事實(shí):通過定義可知，其不 能被引導(dǎo)作用于獨(dú)特的靶基因。因此，突變可能不僅是有利的并且改良或破壞靶基因，還可 能影響其他基因，導(dǎo)致不想要的附加損傷，導(dǎo)致例如菌株穩(wěn)定性的限制、生長速率降低或氨 基酸和/或維生素營養(yǎng)缺陷型。盡管重組技術(shù)通過引入靶向焦點(diǎn)而克服了所述問題，但是它 們可能不適用于由未知基因或多個基因或大基因組片段引起的復(fù)雜遺傳性狀。
[0005] Seidl等人(2009)首先記載了里氏木霉進(jìn)行有性繁殖的能力。在分類學(xué)上，里氏木 霉（以及其有性型紅褐肉座菌）屬于子囊菌綱（Ascomycetes)(奠殼菌綱 (Sordariomycetes))，并且在該組中屬于作為異宗配合的那些真菌。異宗配合的意思是，成 功進(jìn)行有性繁殖所必需的兩種交配型基因座MAT1-1和MAT1-2存在于不同菌株，并且不可能 進(jìn)行自體受精。
[0006] 在有性繁殖過程中，里氏木霉生成子囊殼，其由包含產(chǎn)囊體的卷曲結(jié)構(gòu)或各種獨(dú) 特結(jié)構(gòu)開始。所述產(chǎn)囊體是在交配中接受細(xì)胞核并繼續(xù)生成雙核菌絲系統(tǒng)的細(xì)胞。在所述 卷曲（coil)內(nèi)細(xì)胞中的一個作為產(chǎn)囊體發(fā)揮作用，其余細(xì)胞保持不活躍狀態(tài)或產(chǎn)生會分枝 并增殖以包圍整個結(jié)構(gòu)的菌絲。在許多情況下，周圍的菌絲也會包封所述卷曲。所述周圍的 菌絲最終聯(lián)合形成子囊殼的外壁或包被（peridium) (http : //website · nbm-mnb · ca/ mycologywebpages/NaturalHistoryOfF ungi/SordariomycetesDiscussion.html)(圖3)〇 [0007]里氏木霉子囊殼的形成出現(xiàn)囊子實(shí)層(ascohymenial)，意味著子囊果形成是從產(chǎn) 囊體的受精開始。原基隨后直接從有生殖力的產(chǎn)囊菌絲分化成真正的子實(shí)層。因此，所述囊 子實(shí)層發(fā)育是從生殖菌絲的受精和分化開始，然后是子囊果發(fā)育。因此，在有性繁殖中，子 座(子實(shí)體)是由作為雌性發(fā)揮功能的伴侶形成。
[0008] 由于現(xiàn)在用于工業(yè)中的里氏木霉的所有菌株都可以追溯到菌株QM6a，它們同菌株 QM6a-樣全部攜帶MAT1-2基因座。因此，目前不可能使不同工業(yè)菌株相互雜交以通過引入 有利的性狀或去除菌株的基因突變或不想要的基因（例如，賦予抗生素抗性的基因，編碼其 存在會干擾調(diào)控需求的不想要的產(chǎn)物的基因）來進(jìn)一步改良菌株。
[0009] 克服不能使不同里氏木霉突變菌株雜交的問題的可能性是，將配型基因座與同一 基因組基因座上的相反交配型基因座交換。對里氏木霉QM6a而言，這表示將MAT1-2基因座 與MAT1-1基因座交換。
[0010] Kang等（1994)已經(jīng)證明，其中MAT基因座發(fā)生交換的稻瘟病菌（Magnaporthe grisea)菌株在與相反交配型菌株的雜交中是能育的（即，其中的MAT1-2基因座被MAT1-1基 因座替代的菌株在與原始MAT1-2攜帶菌株的交配中是能育的）。還記載了粗糙鏈孢霉 (Neurospora crassa)的交配型基因座的成功交換(Chang, 1994)。
[0011] W0 2011/095374涉及使用交配型轉(zhuǎn)換以改良絲狀真菌菌株的性行為。公開了鑒定 黑曲霉(Aspergillus niger)和塔賓曲霉(Aspergillus tubigensis)的交配型以將黑曲霉 轉(zhuǎn)化為異宗配合真菌，即具有相反交配型的絲狀真菌個體，產(chǎn)生一對或多對具有兩種相反 交配型的菌株。
[0012] Seidl等（2009)將補(bǔ)充的交配型基因座異位引入里氏木霉菌株QM6a，從而生成攜 帶兩個交配基因座(MAT1-1和MAT1-2)的菌株。所述菌株在與攜帶MAT1-1或MAT1-2基因座的 里氏木霉有性型紅褐肉座菌的野生型菌株的雜交中是能育的。但是，該菌株在與菌株QM6a 及其衍生菌株(全部是MAT1-2)的雜交中是不育的。
[0013] 根據(jù)這些結(jié)果--攜帶兩種交配型的QM6a菌株能夠與紅褐肉座菌的MAT1-1和 MAT1-2菌株形成子實(shí)體，但是不與QM6a形成子實(shí)體--可得出結(jié)論:里氏木霉QM6a能夠作 為雄性伴侶發(fā)揮作用但是無法生成子實(shí)體，并且因此是雌性不育的。在沒有用于保持交配 能力的選擇壓力的情況下，其在實(shí)驗(yàn)室中維持60年以上，這可能導(dǎo)致對于有性重組來說所 必需的基因中的一個或多個中的突變。
[0014]因此，在現(xiàn)有技術(shù)中需要允許快速并有效鑒定與里氏木霉QM6a菌株的所述交配損 傷相關(guān)的基因的方法。迄今為止，尚既未鑒定也未表征里氏木霉QM6a基因組中與交配損傷 相關(guān)的基因。其原因主要是由于以下事實(shí)：由于里氏木霉QM6a的自體不育性，尚未建立用于 里氏木霉QM6a的使用有性雜交的經(jīng)典遺傳方法。此外，尚不知曉哪個基因促成或?qū)е翾M6a 的自體不育性。迄今為止，完全不知曉QM6a基因組（34. lMbp)9143個注釋基因 （annotated gene)中哪個與其自體不育性相關(guān)。在Martinez et al. (2008)中公開了里氏木霉QM6a的基 因組。所述里氏木霉的核苷酸序列和注釋數(shù)據(jù)已經(jīng)以登錄號AAIL 00000000保存于 GenBanko
[0015] 本發(fā)明人最近將QM6a的MAT1-2基因座用同一基因組位置上的相反交配型基因座 (MAT1-1)局部替代，但是所得到的MAT1-1菌株與里氏木霉QM6a衍生的MAT1-2菌株的雜交不 成功，說明了自體不育性。
[0016] 因此，本發(fā)明的目的是鑒定并提供與里氏木霉QM6a菌株及其衍生菌中的交配損傷 相關(guān)的基因/遺傳元件。
[0017] 本發(fā)明的另一個目的是提供快速并有效鑒定與里氏木霉QM6a中的交配損傷相關(guān) 的基因的方法。本發(fā)明的另一個目的是提供恢復(fù)里氏木霉QM6a及其衍生菌株的交配能力的 方法。本發(fā)明的另一個目的是提供里氏木霉QM6a及其衍生菌株的能交配形式（mating competent form)。本發(fā)明的另一個目的是提供有性重組里氏木霉QM6a及其衍生菌株的遺 傳信息的方法。本發(fā)明的另一個目的是制備具有有性周期的里氏木霉QM6a菌株或其衍生菌 株。
[0018] 本發(fā)明人出乎意料地發(fā)現(xiàn)，里氏木霉QM6a菌株或其衍生菌株的交配損傷是由所述 生物的確定的基因/遺傳元件以及確定的基因/遺傳元件中的突變導(dǎo)致，并且可通過修正或 消除所述突變來進(jìn)行修正，即如通過用功能性對應(yīng)物來替代相應(yīng)的基因/遺傳元件，或者通 過插入完全或部分缺失的基因/遺傳元件。所述基因/遺傳元件的功能性對應(yīng)物是恢復(fù)里氏 木霉QM6a交配能力的基因或遺傳元件。通過修正表3中所示突變以達(dá)到使所述基因或遺傳 元件在交配過程中發(fā)揮其功能的程度，而將所述能力賦予所述基因/遺傳元件。優(yōu)選地，改 正所述各個基因/遺傳元件的所有突變。
[0019] 還發(fā)現(xiàn)，對于里氏木霉QM6a菌株或其任何衍生株而言，可有利地利用回交技術(shù)來 鑒定與里氏木霉QM6a菌株或其任何衍生株中的交配損傷相關(guān)的基因或遺傳元件(雌性不育 性基因）。此外還已發(fā)現(xiàn)，某些基因中的突變與里氏木霉QM6a中的交配損傷相關(guān)。所述突變 可以是簡單的點(diǎn)突變、插入或缺失，其中所述缺失可以是現(xiàn)有基因內(nèi)部的缺失或者是基因/ 遺傳元件本身的完全或部分缺失。
[0020] 以上基因或遺傳元件/遺傳信息可促成里氏木霉QM6a中的交配損傷，或者可單獨(dú) 或結(jié)合地導(dǎo)致里氏木霉QM6a中的交配損傷。因此，所述基因/遺傳元件/遺傳信息可與所述 生物的交配損傷直接或間接相關(guān)。
[0021] 與里氏木霉QM6a及其衍生株的交配損傷直接相關(guān)的基因或遺傳元件/遺傳信息通 常是這樣的基因：即該基因的全部或部分功能缺失導(dǎo)致在與對應(yīng)的生物雜交時子實(shí)體形成 的減少或完全缺失。術(shù)語"交配損傷"涉及交配能力所有程度的損傷或減弱。減弱的交配能 力還可在相當(dāng)長的時間里被觀察到，直到可看見帶有存活的子囊孢子的成熟子實(shí)體。對應(yīng) 的基因和/或遺傳元件對直接影響里氏木霉QM6a及其衍生株的交配能力的任何器官或代謝 機(jī)制具有直接影響，例如編碼信息素受體的基因或編碼成功交配所需器官的基因。遺傳元 件包括不被翻譯為蛋白質(zhì)但是與里氏木霉QM6a或其衍生株的交配行為直接或間接相關(guān)的 遺傳信息。所述遺傳信息可以是控制或調(diào)控蛋白質(zhì)表達(dá)所必需的。遺傳元件可以是啟動子、 增強(qiáng)子、激活子、調(diào)控因子或表達(dá)控制序列。
[0022]與里氏木霉QM6a及其衍生株的交配損傷間接相關(guān)的基因/遺傳元件是這樣的基 因，即其不與所述生物的交配損傷直接相關(guān)，但是涉及間接影響里氏木霉QM6a及其衍生株 與相應(yīng)生物交配的能力的形態(tài)結(jié)構(gòu)或代謝機(jī)制相關(guān)?；颍ɡ?，與菌絲細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)或菌絲 分枝相關(guān)的基因）中的突變可對里氏木霉QM6a及其衍生株的交配能力產(chǎn)生間接影響。所述 基因的功能可通過所述基因編碼的蛋白質(zhì)來執(zhí)行。所述基因/遺傳元件還可以是表達(dá)或調(diào) 控相應(yīng)蛋白質(zhì)所必需的（例如，啟動子、增強(qiáng)子、激活子、調(diào)控因子、起始因子、表達(dá)控制序 列)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0023]因此，本發(fā)明涉及鑒定與里氏木霉QM6a菌株或其衍生菌株中的交配損傷相關(guān)的基 因/遺傳元件的方法，所述方法包括以下步驟：
[0024] a)提供第一菌株，所述菌株是含有MAT1-2基因座的里氏木霉QM6a菌株或其衍生菌 株；
[0025] b)使所述菌株與第二菌株進(jìn)行有性雜交，所述第二菌株是具有補(bǔ)充的MAT1-1基因 座的能交配的里氏木霉(紅褐肉座菌)菌株；
[0026] c)使來自b)中的雜交或其回交的MAT1-1子代與a)的第一菌株進(jìn)行反復(fù)回交，直到 獲得與所述第一里氏木霉QM6a菌株或其衍生菌株基本上相同，但是攜帶MAT1-1基因座并且 能夠交配以與里氏木霉QM6a或其任何MAT1-2子代雜交的菌株；
[0027] d)從步驟c)選擇能夠交配以與具有MAT1-2基因座的里氏木霉(紅褐肉座菌）雜交 的子代；以及
[0028] e)通過將步驟d)中所選的子代的基因組和a)中第一菌株的基因組序列進(jìn)行比較， 來鑒定與交配損傷相關(guān)的基因/遺傳元件，其中在第一菌株中所述基因/遺傳元件可完全或 部分缺失，或者以突變形式或具有缺失和/或插入的形式存在，因此是與里氏木霉QM6a菌株 或其衍生菌株中的交配損傷直接或間接相關(guān)的基因或遺傳元件。
[0029] 本發(fā)明還涉及如以上所述的方法，所述方法還包括以下步驟:將能交配菌株的功 能性基因和/或遺傳元件--其對應(yīng)于上述特征e)鑒定的與交配損傷相關(guān)的基因/遺傳元 件--插入到具有MAT1-1基因座的里氏木霉QM6a或其衍生菌株中，并使所述菌株與具有 MAT1-2基因座的里氏木霉QM6a或其衍生菌株雜交，從而由具有MAT1-1基因座并具有插入的 以上鑒定的基因和/或遺傳元件的里氏木霉QM6a或其衍生菌株形成子實(shí)體，表明所述基因/ 遺傳元件與所述交配損傷直接相關(guān)。
[0030] 本發(fā)明還涉及鑒定與功能性基因和/或遺傳元件一一其對應(yīng)于根據(jù)上述特征e)鑒 定的與交配損傷相關(guān)的基因/遺傳元件一一相關(guān)的能交配表型的方法，所述方法包括以下 步驟:a)提供能交配的里氏木霉QM6a MAT1-1菌株;b)使上述功能性基因或遺傳元件不具備 功能；以及c)測量所述里氏木霉QM6a MAT1-1菌株的交配能力，其中所述里氏木霉QM6a MAT1-1菌株的陽性交配能力表明所述基因或遺傳元件對能交配表型而言是非必需的，并且 其中所述里氏木霉QM6a MAT1-1菌株的陰性交配能力表明所述基因或遺傳元件對能交配表 型而目是必需的。
[0031] 本發(fā)明還涉及使不能交配的里氏木霉QM6a菌株或其衍生菌株恢復(fù)自體交配能力 (self-mating competence)的方法，其中與交配損傷相關(guān)的一個或多個突變基因或者完全 或部分缺失的基因被對應(yīng)的功能性基因替代或補(bǔ)充。本發(fā)明還涉及通過所述方法獲得或可 獲得的能夠自體交配的里氏木霉QM6a菌株或其衍生菌株。
[0032] 此外，本發(fā)明涉及適用于目的產(chǎn)物的工業(yè)生產(chǎn)的木霉屬（肉座菌屬)真菌菌株，其 中所述菌株是里氏木霉QM6a或其衍生菌株，其中已按照上文所述修正了所述交配能力，并 且已經(jīng)用靶基因和/或編碼目的產(chǎn)物的基因進(jìn)行了轉(zhuǎn)化。
[0033]此外，本發(fā)明涉及通過上述方法獲得的與里氏木霉QM6a菌株中的交配損傷相關(guān)的 基因/遺傳元件，其具有所附序列表中SEQIDN0:8-155和SEQIDN0:163-174的序列，還涉 及由于遺傳密碼的簡并性、同源性和/或同一性而與所述序列相關(guān)的序列，只要其發(fā)揮相同 功能。
[0034] 本發(fā)明還涉及野生型生物紅褐肉座菌的對應(yīng)基因，所述基因就交配能力而言是功 能性基因，并且適用于恢復(fù)里氏木霉QM6a的雌性能育性。
[0035] 具體而言，本發(fā)明涉及SEQ ID N0:8-155和SEQ ID N0:163-174的功能性對應(yīng)物， 即SEQ ID N0:8-155的序列，其中表3中所列的至少一個或優(yōu)選全部突變已經(jīng)被修正。此外， 本發(fā)明涉及所述被修正的基因的變體和突變體，以及涉及SEQ ID N0:163-174的缺失基因 的變體和突變體，只要其保持了交配能力。變體和突變體可包含沉默或非沉默突變、插入、 缺失或序列添加。所述突變優(yōu)選地為保守性突變。
[0036] 本發(fā)明還涉及紅褐肉座菌的所述基因的功能性對應(yīng)物，條件是所述基因仍然具有 恢復(fù)里氏木霉QM6a的雌性能育性的能力。所述功能性對應(yīng)物可以是其中只有賦予不育性的 突變被修正的基因。
[0037] 本發(fā)明具體涉及具有SEQIDN0:40、SEQIDN0:110、SEQIDN0:112和SEQID N0:134的基因的功能性對應(yīng)物，g卩SEQIDN0:216、SEQIDN0:218、SEQIDN0:220和SEQ ID N0:222或從其衍生的功能上等價(jià)的序列。
【具體實(shí)施方式】
[0038]所述基因和推定的編碼蛋白質(zhì)本身的序列是已知的，并在Martinez et al . (2008)中公開，但是迄今為止尚未證實(shí)它們與交配損傷相關(guān)的功能。此外，可以通過序列表 中說明的登錄號和對應(yīng)基因的進(jìn)一步鏈接，從NCBI數(shù)據(jù)庫中檢索到所述基因的序列。SEQ ID 勵:26、72、82、84、94、96、100、70、106、120、130、140和154最近已經(jīng)被注釋。此外，尚未知 曉所述基因中的突變與交配損傷相關(guān)，具體而言是與所述生物中的雌性不育性相關(guān)。但是， 從所述數(shù)據(jù)庫中不能看出，所述序列是里氏木霉QM6a或其衍生菌株中的突變序列，因此與 所述生物中交配能力的部分或完全缺失相關(guān)，以及如何將所述基因替代為功能性基因。 [0039]但是，尚不知曉所鑒定的基因與里氏木霉QM6a中的交配損傷相關(guān)。還已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，由 于突變、插入或缺失，所述基因與里氏木霉QM6a的交配損傷相關(guān)。用非突變和/或完整形式 的基因替代所述基因?qū)⑿拚锸夏久筈M6a的交配無能(mating inability)，因此允許通過 有性雜交來生產(chǎn)工業(yè)上重要的QM6a菌株。因此，本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了修正里氏木霉QM6a MAT1-1不能與里氏木霉QM6a MAT1-2交配的問題的基因。本發(fā)明人已經(jīng)能夠在里氏木霉 QM6a中定位基因，所述基因以其被認(rèn)為是突變形式的現(xiàn)有形式是與所述生物的交配損傷相 關(guān)。本發(fā)明人還已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，里氏木霉QM6a缺失若干基因，所述基因的存在與交配能力相關(guān)， 并且所述基因的完全或部分缺失與交配損傷相關(guān)。所述交配損傷涉及里氏木霉QM6a與里氏 木霉MAT1-1生物交配能力的任何形式的完全或部分缺失，特別是涉及所述生物的雌性不育 性。因此，所述基因還可以被認(rèn)為是與里氏木霉QM6a菌株雌性不育性相關(guān)的基因。通過比較 所述基因與上述方法中最終能夠交配的子代的對應(yīng)基因，能夠找到對應(yīng)的功能性基因。所 述對比揭示出哪個基因偏差或基因缺失與觀察到的所述生物的交配損傷相關(guān)。因此，可將 與交配能力(具體而言是雌性交配能力）相關(guān)的基因用作模板，用于修改里氏木霉QM6a中分 別與交配損傷和雌性不育性相關(guān)的對應(yīng)基因。
[0040] 術(shù)語"交配損傷"涉及里氏木霉QM6a及其衍生株與對應(yīng)生物交配的任何形式的能 力損傷。所述交配損傷可以是里氏木霉QM6a及其衍生株的完全或部分交配損傷。所述交配 損傷優(yōu)選地涉及里氏木霉QM6a及其衍生菌株的雌性不育性。交配損傷可涉及如圖3所示的 子囊菌有性周期中任何部分或結(jié)構(gòu)(例如受精、精子發(fā)生或性別決定)的缺陷。
[0041] 以上鑒定的基因和/或遺傳元件與里氏木霉QM6a菌株或其衍生菌株直接或間接相 關(guān)。這意味著所述基因和/或遺傳元件可以促成或?qū)е赂鞣N類型的交配損傷。所述基因突變 形式中的突變、插入或缺失同樣如此。所述與功能形式的偏差可導(dǎo)致或促成交配損傷。 [0042]因此，本發(fā)明涉及被鑒定為與里氏木霉QM6a菌株的交配損傷相關(guān)的SEQ ID NO:8-155和SEQIDN0:163-174的基因/遺傳元件。序列表中的序列SEQIDN0:8-155被認(rèn)為是突 變序列，如表3所示的所述序列的改變、插入和/或缺失與交配能力提高相關(guān)。
[0043]本發(fā)明還涉及SEQ ID N0:163-174的基因/遺傳元件，其僅存在于紅褐肉座菌中并 且在里氏木霉QM6a中沒有對應(yīng)物。所述序列及其對里氏木霉QM6a交配損傷的作用之前是未 知的。與所述基因序列相關(guān)的根據(jù)本發(fā)明的進(jìn)一步功能性含義在表4中給出。
[0044]通過對應(yīng)的功能性基因可單獨(dú)或結(jié)合地修正或替代上述基因，以恢復(fù)里氏木霉 QM6a的完全交配能力。所述對應(yīng)的完全功能性對應(yīng)物存在于野生型紅褐肉座菌MAT 1-1中， 并且通過里氏木霉QM6a MAT 1-2中所鑒定的基因和/或遺傳元件的序列分別與里氏木霉 CBS1/A8_02 MAT 1-1、里氏木霉CBS2/A8-11或野生型紅褐肉座菌MAT 1-1中對應(yīng)基因和/或 遺傳元件的序列的對比而獲知。通過本身已知方法測序所述基因來提供序列?？蓡为?dú)或結(jié) 合地插入根據(jù)SEQ ID N0:163-174的里氏木霉QM6a中缺失的基因，以恢復(fù)里氏木霉QM6a的 交配能力。所述基因的插入可與上述對突變、插入或缺失的修正相結(jié)合。
[0045] 優(yōu)選地，用對應(yīng)的非突變/完整基因替代/補(bǔ)充以下基因 ：SEQ ID N0:16、SEQ ID N0:50、SEQ ID N0:70、SEQ ID N0:86、SEQ ID N0:94、SEQ ID N0:96、SEQ ID N0:106、SEQ ID N0:120、SEQ ID N0:128、SEQ ID N0:163、SEQ ID N0:165、SEQ ID N0:169、SEQ ID NO: 171。其他優(yōu)選的被修正/補(bǔ)充的基因的組是：SEQ ID N0:8、SEQ ID N0:11、SEQ ID N0:12、 SEQ ID N0:132、SEQ ID N0:134、SEQ ID N0:150、SEQ ID N0:152、SEQ ID N0:18、SEQ ID N0:14、SEQ ID N0:126、SEQ ID N0:130、SEQ ID N0:154、SEQ ID N0:167、SEQ ID N0:168、 SEQ ID NO:173和SEQ ID NO:174。
[0046] 更優(yōu)選地，用對應(yīng)的非突變/完整基因替代/補(bǔ)充以下基因 ：SEQ ID NO: 36、SEQ ID N0:40、SEQ ID N0:56、SEQ ID N0:58、SEQ ID N0:60、SEQ ID N0:66、SEQ ID N0:68、SEQ ID N0:72、SEQ ID N0:82、SEQ ID N0:92、SEQ ID N0:100、SEQ ID N0:110、SEQ ID N0:112、SEQ ID N0:118、SEQ ID N0:120、SEQ ID N0:122、SEQ ID N0:124、SEQ ID N0:134、SEQ ID NO: 138、SEQIDN0:144、SEQIDN0:146、SEQIDN0:148和SEQIDN0:152。
[0047] 最優(yōu)選地，用對應(yīng)的非突變/完整基因替代/補(bǔ)充以下基因 ：SEQ ID N0:40、SEQ ID N0:110、SEQIDN0:112和SEQIDN0:134。
[0048] 進(jìn)一步優(yōu)選的與交配能力相關(guān)的序列是：SEQ ID N0:224、SEQ ID N0:226、SEQ ID NO:228或SEQ ID NO:230。
[0049] 本發(fā)明特別涉及里氏木霉QM6a或其衍生菌株的交配能力所必需的以下基因 ：SEQ IDN0:216、SEQIDN0:218、SEQIDN0:22(^PSEQIDN0:222。
[0050] 本發(fā)明還涉及所述序列的功能上等價(jià)序列，例如由于遺傳密碼的簡并性而相關(guān)的 序列或與所述序列有一定程度的同源性(例如80%，優(yōu)選90%，更優(yōu)選95%或98%)的序列。
[0051] 本發(fā)明還涉及由被修正的基因/遺傳元件編碼的多肽，所述基因/遺傳元件被鑒定 為與里氏木霉QM6a菌株或其衍生菌株中的交配損傷相關(guān)。
[0052] 特別地，本發(fā)明涉及由SEQIDN0:220的核苷酸888-2790、SEQIDN0:218的核苷 酸 1263-2726、SEQ ID N0:222的核苷酸990-3107或SEQ ID N0: 216的核苷酸919-6039編碼 的多肽。所述多肽與交配能力相關(guān)并且對應(yīng)于SEQ ID勵8:221、219、223和217。本發(fā)明還涉 及與交配能力相關(guān)，并且與SEQ ID N0:220的編碼序列、SEQ ID N0:218的編碼序列、SEQ ID N0:222的編碼序列或SEQ ID N0:216的編碼序列具有至少80%，優(yōu)選至少90%，更優(yōu)選至少 95%，甚至更優(yōu)選至少98%的同一性程度的多肽，只要保持對所述突變的修正并且所述序 列與交配能力相關(guān)。
[0053]優(yōu)選地，通過以下方式確定序列同一性的程度:確定參與比對并且在其他序列中 有"對應(yīng)的"對應(yīng)物的較短序列的殘基數(shù)。對于本發(fā)明中，優(yōu)選地通過使用常規(guī)算法以常規(guī) 方式確定同一性。根據(jù)本發(fā)明，用于比對的僅為cDNA或各個成熟蛋白質(zhì)的氨基酸。同樣，本 發(fā)明優(yōu)選地通過已知的計(jì)算機(jī)程序，將相同的序列對應(yīng)物確定為同源序列。所述程序的實(shí) 例是Clone Manager Suite程序，其包括程序部分Align Plus，并由Scientific& Educational Software(Durham，NC，U. S·A)發(fā)布。根據(jù)FastScan-MaxScore方法或根據(jù) Needleman-Wunsch方法，在局部比對選項(xiàng)下(保持默認(rèn)值)對以上確定的兩個DNA序列或氨 基酸序列進(jìn)行比對。根據(jù)本發(fā)明，特別使用具有功能"Compare Two Sequences/Local Fast Scan-Max Scores/Compare DNA Sequences" 或者對氨基酸而言的 "Compare Two Sequences/Global/Compare Sequences as Amino Acids" 的程序版本"Clone Manager 7Align Plus5"來計(jì)算同一"性。從而使用來自以下來源的算法:Hirschberg，D. S. 1975.A linear space algorithm for computing maximal common subsequences.Commun Assoc Comput Mach 18:341-343；Myers,E.ff.and ff.Mi 1ler.1988.Optimal alignments in linear space.CABI0S 4:1,11-17；Chao,K-M,ff.R.Pearson and ff.Miller.1992.Aligning two sequences within a specified diagonal band.CABIOS 8:5,481-487。
[0054] 本發(fā)明還涉及上述與交配能力相關(guān)的多肽的添加分子和/或缺失分子。因此，可通 過在N末端和/或C末端添加額外的序列而使根據(jù)本發(fā)明的與交配能力相關(guān)的多肽延長，以 此獲得的氨基酸序列仍然具有交配能力。
[0055] 根據(jù)本發(fā)明，還可使與交配能力相關(guān)的多肽的序列片段缺失，只要保持修正后的 突變。借助本領(lǐng)域所熟知的方法，通過本身已知的方式來實(shí)施突變、延長和縮短。
[0056]所述變體的制備在本領(lǐng)域中通常是已知的。例如，通過DNA中的突變可制備多肽的 氨基酸序列變體。誘變和核苷酸序列改變的方法為本領(lǐng)域中所熟知的（例如，Tomic et al.NAR,18:1656(1990),Giebel and Sprtiz NAR,18:4947(1990))〇 [0057]不會對目的蛋白質(zhì)的生物活性帶來負(fù)面影響的適合的氨基酸置換的詳細(xì)內(nèi)容可 參見 Dayhoff et al·, Atlas of Protein Sequence and Structure , Natl .Biomed · Res .Found · ,Washington ,D · C. (1978)中的模型。優(yōu)選保守性置換，例如將一 個氨基酸置換為另一個具有相似特性的氨基酸?？蓪⑦@些置換分成兩個主要組，總共4個亞 組，在每個亞組內(nèi)的置換被稱為保守性置換，所述置換優(yōu)選地不影響蛋白質(zhì)的活性或折疊。 [0058]
[0059]本發(fā)明還涉及被鑒定為與里氏木霉QM6a菌株或其衍生菌株中的交配損傷相關(guān)的 基因/遺傳元件的經(jīng)修正的DNA序列。特別地，本發(fā)明涉及具有或包含SEQ ID N0:220的核苷 酸888-2790或編碼序列、SEQ ID N0:218的核苷酸1263-1476或編碼序列、SEQ ID N0:222的 核苷酸990-3107或編碼序列或者SEQ ID NO :216的核苷酸919-6039或編碼序列的DNA序列。
[0060] 此外，本申請還公開了與所要求保護(hù)的核苷酸序列及所要求保護(hù)的其部分有至少 70 %同源性、優(yōu)選至少80 %同源性、甚至更優(yōu)選90 %同源性、特別是至少95 %同源性的那些 序列，只要所述對應(yīng)序列與交配能力相關(guān)并且對突變的修正被保持。所述同源性優(yōu)選地為 70-100%，更優(yōu)選地為80-100%，最優(yōu)選地為90-100%。所述同源性被定義為同一性的程 度。為此，優(yōu)選地通過以下方式確定同一性程度:確定參與比對并且在其他序列中有"對應(yīng) 的"對應(yīng)物的較短序列的殘基數(shù)。優(yōu)選地通過使用常規(guī)算法以常規(guī)方式確定同源性。在比對 中僅考慮對應(yīng)的成熟蛋白質(zhì)的cDNA。同樣，優(yōu)選地通過已知的計(jì)算機(jī)程序，將相同的序列互 補(bǔ)物確定為同源序列。所述程序的實(shí)例是Clone Manager Suite程序，其包括程序部分 AlignPlus，由Scientific&EducationalSoftware(Du;rham，NC，U·S·A)發(fā)布。為此，通過 FastScan-MaxScore方法或通過Needleman-Wunsch方法在局部比對選項(xiàng)下(保持默認(rèn)值)對 以上確定的兩個DNA序列進(jìn)行比對。根據(jù)本發(fā)明，特別使用具有功能"Compare Two Sequences/Local Fast Scan-Max Scores/Compare DNA Sequences" 的程序版本 "Clone Manager 7Align Plus 5"來確定同源性。因此，使用從以下來源獲得的算法:Hirschberg, D.S.(1975)A linear space algorithm for computing longest common subsequences, Commun Assoc Comput Mach 18:341_343;Myers，E.W.and W.Miller.(1988)0ptimal alignments in linear space ,CABI0S 4:1,11-17；Chao,K-M,ff.R.Pearson and ff.Miller.(1992)Aligning two sequences within a specified diagonal band,CABI0S 8:5,481-487。
[0061] 本發(fā)明還涉及由于遺傳密碼簡并性而與本發(fā)明的序列相關(guān)的DNA序列，以及其等 位基因變異。所述遺傳密碼簡并性可由天然簡并性導(dǎo)致，或由于特別選定的密碼子選擇而 導(dǎo)致。可通過使用分子生物學(xué)中眾所周知的技術(shù)來鑒定天然的等位基因變體，所述技術(shù)例 如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)和雜交技術(shù)。
[0062] 本發(fā)明還涉及與交配能力相關(guān)并且保持對交配損傷突變(包括序列的突變、修飾 或變異）的修正的DNA序列。此外，本發(fā)明還涉及在非嚴(yán)格條件(relaxed condition)或嚴(yán)格 條件下與上述序列雜交的序列。以下條件被認(rèn)為是嚴(yán)格的：在65°C下，硫酸葡聚糖溶液 (GenescreenPlus，DuPont)中雜交18小時，隨后在65°C下分別洗濾膜30分鐘，首先用6 X 33(：、2\33(：(2次）、2\33(：(2次）、0.1%303、最后用0.2\33(：沖（膜轉(zhuǎn)移和檢測方法， Amersham)〇
[0063] 里氏木霉QM6a的衍生菌株是，例如，通過自身已知的技術(shù)(例如常規(guī)誘變(UV、γ放 射、亞硝基胍處理以及其他)或重組技術(shù)）以一步或多個連續(xù)步驟從里氏木霉QM6a衍生的菌 株，例如QM9123、QM9136、QM9414、MG4、MG5、RUT-C30、RUT-D4、RUT-M7、RUT-NG14、MCG77、 MCG80、M5、M6、MHC15、MHC22、Kyowa X-31、Kyowa PC-1-4、Kyowa PC-3-7、TU-6和為本領(lǐng)域技 術(shù)人員所知的多種其他菌株。可從已知的保藏中心獲得所述菌株，例如CBS、ATCC、DSMZ。
[0064] 在本發(fā)明的用于鑒定與交配損傷相關(guān)的基因的方法中，提供了第一親本菌株，其 為具有MAT1-2基因座的里氏木霉QM6a菌株或其衍生菌株。使所述菌株與第二菌株雜交，所 述第二菌株是具有補(bǔ)充的MAT1-1基因座的里氏木霉(紅褐肉座菌）的能交配菌株。通過從來 自國際菌種保藏中心例如CBS(荷蘭真菌菌種保藏中心)或ATCC(美國菌種保藏中心）的紅褐 肉座菌(里氏木霉的有性型）野生型分離株中選擇那些具有MAT1-1等位基因并且在與里氏 木霉QM6a及其衍生菌株雜交時形成能育的子實(shí)體的菌株，或具有MAT1-2等位基因的其他紅 褐肉座菌菌株，而獲得所述菌株?？赏ㄟ^簡單的測試(例如，通過檢查所獲得的子囊孢子能 否萌發(fā))來檢查能育子實(shí)體的形成。所述菌株的優(yōu)選實(shí)例是菌株CBS999.97 MAT1-1或任何 其他能交配的MAT1-1里氏木霉(紅褐肉座菌）菌株，例如Druzhinina et al.(2010)中所列 出的菌株。
[0065]為了獲得能夠使用QM6a/MATl-2作為交配伴侶進(jìn)行成功的有性繁殖的QM6a/MATl-1菌株，用質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌株QM6a/MATl-l，所述質(zhì)粒包含被鑒定與里氏木霉QM6a/MATl-2菌株的 交配損傷相關(guān)的基因的功能性變體。使陽性轉(zhuǎn)化體與里氏木霉QM6a MAT1-2進(jìn)行交配測定。 通過能育的子實(shí)體的形成確認(rèn)交配。通過分離子囊孢子并證明其在萌發(fā)并長成菌絲體之后 能夠與相反交配伴侶進(jìn)行交配，來測試所述子實(shí)體的能育性。
[0066]具體而言，在適合里氏的木霉交配條件下，共培養(yǎng)補(bǔ)充有修復(fù)的備選基因的里氏 木霉QM6a/MATl-l的陽性轉(zhuǎn)化體和里氏木霉QM6a/MATl-2菌株(ATCC13631)。實(shí)施例3中給出 了示例性方案。通過從子實(shí)體分離子囊孢子，使其萌發(fā)并證明所獲得的菌落能夠交配，來測 試能育性。通過可見的形態(tài)學(xué)改變、細(xì)胞與細(xì)胞融合和雙核體形成來驗(yàn)證陽性交配結(jié)果。 [0067]因?yàn)樘烊坏募t褐肉座菌MAT1-1菌株能夠與里氏木霉QM6a及其衍生株雜交并生成 能育的子實(shí)體，但是MAT1-2已與MAT1-1交換的里氏木霉菌株卻無法實(shí)現(xiàn)這一過程，因此本 發(fā)明人得出結(jié)論，里氏木霉QM6a的基因組必然包含導(dǎo)致該失敗的某些基因組特征。因此，理 論上可通過對紅褐肉座菌MAT1-1菌株之一的基因組進(jìn)行測序而鑒定負(fù)責(zé)任的基因組特征 和對應(yīng)的基因。但是，這種策略存在嚴(yán)重的障礙:里氏木霉和紅褐肉座菌的野生型菌株的基 因組中存在平均為0.5-1.5%的核苷酸差異。考慮到基因組為34. IMbp，這意味著里氏木霉 和/或紅褐肉座菌的任何兩個野生型菌株將有170500-511500個核苷酸是不同的。盡管其中 大多數(shù)不存在于基因中，并且（即便存在于基因中的話)可導(dǎo)致沉默突變，但是表現(xiàn)出非沉 默核苷酸交換的基因的數(shù)目可能太多而無法被用來鑒定與雌性不育性相關(guān)的基因。
[0068]因此決定通過若干重復(fù)雜交--里氏木霉QM6a首先和紅褐肉座菌MAT1-1雜交，隨 后同來自所獲得的子代的菌株雜交一一來降低所述核苷酸差異的背景。根據(jù)遺傳學(xué)法則， 有性雜交的子代應(yīng)該有50%基因組來自MAT1-1親代菌株，50%基因組來自MAT1-2親本菌 株。當(dāng)這些攜帶MAT1-1的子代之一再次雜交時，這將使來自MAT1-1菌株的基因組含量進(jìn)一 步減少50%，即在兩輪雜交后為原始的25%。繼續(xù)的雜交輪將獲得來自原始MAT1-1基因組 的含量的 12.5%(第3輪）、6.25%(第4輪）、3.125%(第5輪）、1.56%(第6輪）、0.78%(第7 輪)和0.39% (第8輪）。鑒于里氏木霉/紅褐肉座菌具有9143個注釋的基因，這將待測試的備 選基因數(shù)量減少到357個，其中并非所有基因都在里氏木霉與來自第八次雜交世代的MAT1-1菌株之間存在核苷酸差異。但是，為了繼續(xù)減少這個，將來自第三次雜交的子代分成兩個 菌株，其分別雜交直到第八代。在每個步驟中，驗(yàn)證所生成的MAT1-1子代仍然能夠與QM6a生 成能育的子實(shí)體的能力。
[0069] 重復(fù)進(jìn)行所述回交，直到獲得通過數(shù)學(xué)計(jì)算與親代菌株(即第一菌株)基本上相同 的菌株:如果希望獲得正確基因的可能性更大，可重復(fù)所述回交8個循環(huán)以上。理論上，共需 要進(jìn)行19次回交以達(dá)到MAT1-1基因組的0.00014% ( = 1/9143 ;9143是里氏木霉基因組中注 釋的基因的數(shù)量）。通常重復(fù)回交5-19個循環(huán)，優(yōu)選6-12個循環(huán)，更優(yōu)選7-10個循環(huán)，仍然更 優(yōu)選8-9個循環(huán)，最優(yōu)選8個循環(huán)。因此，就菌株所進(jìn)行的回交次數(shù)來確定與親代菌株基本上 相同的菌株。這意味著回交菌株與親代菌株之間的基本同一性和以下有關(guān):與交配損傷相 關(guān)的基因和與交配損傷不相關(guān)的基因之間的關(guān)系，這是根據(jù)回交次數(shù)通過數(shù)學(xué)計(jì)算獲得。
[0070] 通過首先從子代中鑒定包含MAT1-1基因座的菌株，然后通過自身已知方法確認(rèn)所 述菌株能夠與里氏木霉QM6a(MATl-2)生成能育的子實(shí)體，來從上述回交中選擇子代，所述 子代能夠交配以與具有MAT1-2基因座的里氏木霉(紅褐肉座菌)雜交，并且所述子代包含交 配損傷/雌性不育性的基因的未突變形式和/或不存在于里氏木霉QM6a中的基因/遺傳信 息。
[0071] 盡管通過以上所述回交策略基本上可以獲得從MAT1-1背景轉(zhuǎn)移至里氏木霉QM6a 譜系的所需基因（也是雌性不育性基因）的任何組合，回交策略的使用應(yīng)當(dāng)與敲除策略結(jié)合 以獲得僅攜帶補(bǔ)充和確定的雌性不育性基因的最小集合的能交配的QM6a菌株或其衍生株， 如按照本發(fā)明所述方法獲得。
[0072]由于遺傳重組的隨機(jī)性，越來越不可能從MAT1-1背景保留確定的一組所需基因并 同時擺脫所有與交配不相關(guān)的不合需要的背景基因。因此，在某一后期回交世代之后，在雜 交中擺脫雌性不育性基因的可能性開始大于擺脫非交配相關(guān)基因的可能性，并且獲得攜帶 所需雌性不育性基因的最小集合的能交配的子代的機(jī)會將是微乎其微的。因此，在回交過 程中的較早時間點(diǎn)停止是有利的，此時在所獲得的能交配的子代中仍保留了來自與交配無 關(guān)的MAT1-1雌性不育性基因供體的許多基因。
[0073]僅通過回交策略嘗試產(chǎn)生能交配的里氏木霉菌株的另一個缺點(diǎn)是，因?yàn)樾枰谄?中所有雌性不育性基因已經(jīng)與來自MAT1-1供體基因組的許多隨機(jī)的非交配相關(guān)基因一起 被組裝在基因組中的階段停止，對于這些非交配相關(guān)基因，每個系都與以相同方法產(chǎn)生的 另一個系不同，從而產(chǎn)生不想要的異質(zhì)性。使用回交策略產(chǎn)生與交配損傷相關(guān)的備選基因 池。通過在能交配的里氏木霉QM6a MAT 1-1菌株中對每種鑒定的基因進(jìn)行靶向敲除和使用 上述交配測定對所獲得的里氏木霉QM6a MAT 1-1菌株的交配能力進(jìn)行測定，來進(jìn)一步完善 所述備選基因池。
[0074]因?yàn)樵诶锸夏久筈M6a中可能有多于一個與交配相關(guān)的基因變得喪失功能，從而用 單個基因進(jìn)行補(bǔ)充不會導(dǎo)致獲得交配功能性，因此制備了能交配的里氏木霉QM6a衍生株中 的全部備選基因的敲除菌株。通過這種方式，將鑒定出任何交配所必需的基因是單獨(dú)導(dǎo)致 QM6a的交配缺陷還是作為一組失活的交配必需基因的一部分。為了實(shí)現(xiàn)這一目的，優(yōu)選地 制備菌株CBS1/A8_02(MAT1-1)的tku70缺失版本。所述tku70基因是里氏木霉和其他絲狀真 菌中非同源末端連接(NHEJ)途徑的一部分。所述tku70基因的敲除導(dǎo)致里氏木霉同源重組 效率提高(Guangtao et al.，2008)，因此增加了具有基因敲除（待測試其在交配中的相關(guān) 性)的菌株的數(shù)量。
[0075]可通過適合于使基因失效的任何技術(shù)來實(shí)現(xiàn)tku70基因和各個備選基因的敲除， 所述技術(shù)例如部分的、基本上或功能性缺失、沉默、失活或下調(diào)。優(yōu)選地，將標(biāo)記物插入到對 應(yīng)的構(gòu)建體中以鑒定對應(yīng)的基因敲除生物。相應(yīng)的技術(shù)在本領(lǐng)域中是已知的?；蚯贸?物允許研究所述敲除基因的功能，即所述生物的交配行為。
[0076] 通過這種方法，當(dāng)基因敲除未消除能交配菌株CBSl/A8_02Atku70(MAT 1-1)的交 配能力時，那么所述基因就被鑒定為非交配必需的，并且隨后被從里氏木霉雌性不育性的 備選基因列表中移除。
[0077]還可使用所述敲除策略來鑒定與以上鑒定的基因/遺傳元件相關(guān)的不能交配的表 型。不能交配的基因敲除里氏木霉QM6a菌株為例如這樣的野生型紅褐肉座菌：其中例如通 過部分的、基本上或功能性缺失、沉默、失活或下調(diào)，使以上鑒定的各個基因/遺傳元件不具 備功能性。相應(yīng)的方法本身是已知的。
[0078]通過測序以上所選子代的基因組并將其與所述里氏木霉QM6a親代菌株（以上所使 用的第一菌株)的基因組序列比較，來鑒定與交配損傷相關(guān)的基因。為了實(shí)現(xiàn)這一目的，使 用CLC Genomic Workbench(5.1版本，CLC bio,Arhus,Denmark)以及用newbler(de novo) (2.60版本，Roche/454,Brandford CT,USA)和CLC Genomic Workbench的從頭拼接，以 BLAST(Altschul et al.，1990)和r2cat(Husemann and Stoye，2010)將所獲得的序列比對 定位(map)至里氏木霉QM6a序列支架的支架（scaffold)上。使用定制版本的Mauve (Rissman et al.，2009)來鑒定QM6a參考序列和兩個回交系的比對序列之間的單核苷酸多態(tài)性(SNP) 以及插入和缺失（Indel)。使用自定義R腳本將SNP和Indel比對定位到QM6a編碼序列上。然 后手動測試備選基因的沉默突變，并且去掉導(dǎo)致不干擾推定蛋白質(zhì)功能的保守性氨基酸交 換(例如，E和D，V和I等）的突變。所述各個突變的性質(zhì)當(dāng)然取決于用于回交的肉座菌菌株的 類型。因此，通過使用不同肉座菌菌株可獲得所述各個基因中的不同突變。在修正里氏木霉 QM6a及其衍生菌株的交配無能的基因中鑒定的全部突變組的共同突變是在所述基因的各 個QM6a版本中可修正無法交配的突變的突變。
[0079]通過以下方法鑒定在已公開的里氏木霉QM6a基因組序列中不存在的所述回交系 中的大DNA插入序列。通過BLAST程序在回交系的不同基因組序列和QM6a之間進(jìn)行核苷酸對 比，分析對比結(jié)果來鑒定QM6a基因組序列中不存在的區(qū)域，通過使用自定義R腳本來鑒定這 些序列。提取在此過程中被鑒定的序列，并使用翻譯的核苷酸序列通過BLASTX搜索來搜索 NCBI的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫以找到具有所述序列之間相似的區(qū)域。
[0080]對所述各個突變的驗(yàn)證是恢復(fù)所述生物的交配能力，如以下方法證明：當(dāng)具有 MAT1-1基因座的里氏木霉QM6a與相應(yīng)的用于回交的相同類型的MAT1-2菌株雜交時形成具 有存活的子囊孢子的成熟子實(shí)體。
[0081] 為了獲得與交配損傷直接相關(guān)的基因，將以上鑒定的基因插入具有MAT1-1基因座 的里氏木霉QM6a或其衍生菌株中并使所述菌株與具有MAT1-2基因座的里氏木霉QM6a或其 衍生菌株雜交，借此具有MAT1-1基因座、插入所述基因的里氏木霉QM6a或其衍生菌株形成 子實(shí)體說明所述基因與所述交配損傷直接相關(guān)。以相同方式可驗(yàn)證遺傳元件對交配行為的 促進(jìn)作用。
[0082] 當(dāng)然，通過上述技術(shù)不僅可以鑒定與交配損傷/雌性不育性相關(guān)的基因，還可以鑒 定與一種或多種功能上可檢測的表型特征相關(guān)的任何其他靶基因。此外，在以上系統(tǒng)中可 以使用其他生物(例如，微生物或植物)來代替里氏木霉菌株，只要所述生物能夠交配。 [0083]在現(xiàn)有技術(shù)的基礎(chǔ)上，無法預(yù)期通過將在里氏木霉QM6a(MATl_2)中失去功能的與 交配損傷甚至雌性不育性相關(guān)的非突變并因此為功能性的基因重新引入到里氏木霉QM6a， 其中MAT1-2基因座已被MAT1-1基因座替代，來恢復(fù)其與里氏木霉QM6a(MATl-2)和其他 MAT1-2衍生株交配的能力。將以上鑒定的基因引入工業(yè)木霉菌株，以及用MAT1-1基因座替 代MAT1-2基因座，使得所述菌株能夠與任何其他里氏木霉(MAT1-2)菌株雜交，因此允許快 速鑒定雄性和雌性不育性基因以及基本上任何目的靶基因的方法。
[0084]可使用關(guān)于表3和4中所示的序列差異與其對于改善里氏木霉QM6a交配能力的功 能性含義的相關(guān)性的知識來構(gòu)建特異性探針或包括特異性探針的陣列，用于測試其他生物 中與能育性相關(guān)的基因。根據(jù)表3和4的信息，可提供載體試劑盒，以允許恢復(fù)與交配能力相 關(guān)的基因。
[0085] 本發(fā)明還涉及適用于目的產(chǎn)物的工業(yè)生產(chǎn)的木霉屬（肉座菌屬）的真菌菌株，其中 所述菌株已經(jīng)按照上文所述而獲得并且已經(jīng)編碼目的產(chǎn)物的基因轉(zhuǎn)化。
[0086] 目的產(chǎn)物可以是具有工業(yè)應(yīng)用的任何產(chǎn)物。實(shí)例是適用于研究目的、診斷目的、治 療目的（例如，激素、免疫球蛋白、疫苗、抗菌蛋白（antibacterial protein)、抗病毒蛋白、 酶等）、營養(yǎng)目的或工藝應(yīng)用的蛋白質(zhì)或多肽。所述蛋白質(zhì)或多肽的優(yōu)選實(shí)例為食品酶 (food enzyme)，例如聚半乳糖醛酸苷酶(polygalacturonidase)、果膠甲酯酶、木糖半乳糖 醛酸苷酶、鼠李糖半乳糖醛酸苷酶、阿拉伯呋喃糖酶、阿拉伯聚糖酶（arabana s e/ arabinanase)、淀粉酶、肌醇六磷酸酶、木聚糖酶、纖維素酶、蛋白酶、甘露聚糖酶、轉(zhuǎn)谷氨酰 胺酶等;動物飼料酶(feed enzyme)，例如肌醇六磷酸酶、木聚糖酶、內(nèi)切葡聚糖酶、甘露聚 糖酶和蛋白酶；以及工藝酶(t e c h n i c a 1 e n z y m e)，例如纖維素酶、蛋白酶、淀粉酶、漆酶、氧 化還原酶等。目的產(chǎn)物還可以是生物聚合物。
[0087]通過以上木霉屬進(jìn)行的目的產(chǎn)物的工業(yè)生產(chǎn)是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并且是根 據(jù)為木霉屬真菌菌株建立的發(fā)酵方法來實(shí)施。為了表達(dá)并分泌目的產(chǎn)物，在用于表達(dá)和分 泌目的產(chǎn)物的常規(guī)條件下培養(yǎng)木霉屬菌株。因此，將所述真菌接種在瓊脂平板上，或使其首 先在瓊脂平板上生長，并將孢子懸液或菌絲懸液作為接種物用于深層發(fā)酵。在包含所需的 碳源和氮源以及微量元素和礦物鹽的培養(yǎng)基上進(jìn)行所述發(fā)酵。如果使用誘導(dǎo)型啟動子，所 述培養(yǎng)基還應(yīng)包含誘導(dǎo)劑或其前體。在控制的溫度和pH值以及其他發(fā)酵條件(例如，氧化還 原電位、部分含氧量等)下進(jìn)行所述發(fā)酵。其他碳源和氮源以及培養(yǎng)基中的其他成分的受控 管理也可實(shí)現(xiàn)(分批補(bǔ)料方法）。在發(fā)酵結(jié)束時，通過已知的物理方法從生物質(zhì)中分離包含 目的產(chǎn)物的培養(yǎng)液，并在此過程中分離目的產(chǎn)物。
[0088]以上恢復(fù)里氏木霉QM6a的交配能力與若干獨(dú)特的優(yōu)勢相關(guān)。所述方法允許將里氏 木霉QM6a轉(zhuǎn)化成更類似于野生型的生物。所述方法允許將里氏木霉QM6a及其衍生株中的兩 個或多個有利的遺傳性狀結(jié)合在一起。然后將所述性狀轉(zhuǎn)移到里氏木霉QM6a及其衍生菌株 的子代中。因此，可進(jìn)一步改良現(xiàn)存的工業(yè)上目的化合物的高效生產(chǎn)菌株。還可以將使里氏 木霉菌株雜交的能力用于消除標(biāo)記物基因或其他可通過其表型進(jìn)行測試的不想要的基因， 例如次級代謝、色素形成、不想要的酶(例如，蛋白酶）、形態(tài)學(xué)和無性發(fā)育的基因以及其他 基因。
【附圖說明】
[0089] 圖1是用MAT 1 -1基因座直接替代里氏木霉QM6a菌株中的MAT 1 -2基因座的載體示意 圖。使用hph基因（潮霉素抗性)作為選擇性標(biāo)記物。將hph盒插入到matl-1-3基因和具有轉(zhuǎn) 錄產(chǎn)物ID 59147(DNA裂解酶）的基因之間的基因間區(qū)域中。
[0090] 圖2是菌株QM6a與菌株CBS/MAT1-1雜交的示意圖。使每次雜交的子代(攜帶MAT1-1 基因座）與親代菌株QM6a回交。提取菌株CBS1/A8-2和CBS2/A8-11的DNA并進(jìn)行全基因組測 序。
[0091] 圖3是子囊菌中有性和無性發(fā)育的示意圖(Fazenda et al.，2008)。
[0092] 圖4是基本載體構(gòu)建以轉(zhuǎn)化與交配損傷相關(guān)的基因的示意圖。5'插入片段對應(yīng)于 與交配損傷相關(guān)的不同基因一一在這里是具有轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物ID Trire2_59740的基因?？s寫： PtrPc--trpC啟動子;nptll--賦予遺傳霉素硫酸鹽(G418)抗性的基因；TtrpC--trpC終 止子。
[0093]圖5a、6a、7a和8a是被鑒定為里氏木霉QM6a交配能力所必需的功能性基因的補(bǔ)充 載體。圖5b(SEQ ID N0:220/221)、6b(SEQ ID N0:216/217)、7b(SEQ ID N0:218/219)和8b (SEQ ID NO:222/223)涉及各個補(bǔ)充基因 （complementation gene)本身與功能性啟動子和 終止子。所述啟動子和終止子序列可以與另一個等同功能性的啟動子和/或終止子序列交 換。
[0094] 以下實(shí)施例說明并解釋本發(fā)明的主題。
[0095] 實(shí)施例
[0096] 實(shí)施例1
[0097] 1.材料和方法
[0098] Seidl等（2009)中所述的菌株除了含有MAT1-2基因座還含有MAT1-1基因座。所述 菌株能夠與不同的攜帶MAT1-1和MAT1-2的野生型菌株進(jìn)行有性繁殖，但是不與親代菌株里 氏木霉QM6a(MATl-2)進(jìn)行有性繁殖。為了排除仍然存在的MAT1-2基因座（其位于基因組內(nèi) 的原始基因座處）導(dǎo)致所述菌株中的有性繁殖障礙，用從野生型菌株紅褐肉座菌 (：.卩.1(.1282(6.1.3.85-249)擴(kuò)增的]\^1'1-1基因座直接并同源替換里氏木霉〇163的]\^1'1-2 基因座。
[0099]為了構(gòu)建載體，從紅褐肉座菌1282擴(kuò)增包括上游和下游同源區(qū)的MAT1-1基因座， 并將其克隆到載體pCR blunt(可從Life Technologies/Invitrogen獲得）中。在第二步中， 利用AvrII限制性位點(diǎn)--所述限制性位點(diǎn)位于基因 mat 1-1-3與具有轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物ID 59147 (核酸內(nèi)切酶/DNA裂解酶）的基因之間的基因間區(qū)域中一一將賦予潮霉素抗性的hph基因 (潮霉素 B磷酸轉(zhuǎn)移酶基因）亞克隆到所述載體中。圖1給出了載體構(gòu)建的總體示意圖，表1給 出了所使用的引物的序列。表2列出了 MAT1-2替換載體中基因的準(zhǔn)確位置。所述載體的完整 序列可參見序列表中的SEQ ID N0:7。
[0100]表1:構(gòu)建用于直接MAT基因座替換的載體所使用的引物的序列
[0103] 為了轉(zhuǎn)化里氏木霉QM6a，通過使用引物l_2_replace_cassette_fw和1_2_ replace_cassette_rv的PCR從所述載體擴(kuò)增替代盒。每次轉(zhuǎn)化反應(yīng)使用10yg替代盒。所獲 得的菌株一一其被命名為QM6a :MATl-2 gMATI-1,能夠成功地作為MAT1-2野生型 菌株(例如，CBS999.97)的交配伴侶發(fā)揮作用，但是不能與親代菌株里氏木霉QM6a交配。 [0104] 表2:ΜΑΤ1-2置換載體中不同基因的位置
[0107] 2.突變和缺失基因的鑒定
[0108] 為了鑒定與能夠和里氏木霉MAT1-2雜交的紅褐肉座菌野生型MAT1-1分離株相比 在里氏木霉中突變的基因，使用基因組測序法。因?yàn)槭状螄L試表明野生型分離株與QM6a(其 序列可公開獲得;http: //genome · jgi-psf · org/Trire2/Trire2 · home · html)的差異大于 60000個SNP，通過QM6a與MAT1-1菌株的有性雜交然后MAT1-1子代與QM6a的重復(fù)回交循環(huán)來 去除大部分所述背景。為了實(shí)現(xiàn)這一目的，使菌株QM6a(MATl-2)和菌株CBS999.97(MAT1-1) 以兩個獨(dú)立的系進(jìn)行雜交，以獲得攜帶MAT1-1基因座的有性能力（sexually competent)的 菌株。使來自攜帶ΜΑΤΙ -1基因座的單個子囊孢子的培養(yǎng)物與親代菌株QM6a回交數(shù)次以減少 CBS999.97特異性基因的數(shù)量，這將允許更容易地鑒定導(dǎo)致雌性不育性(FS)的備選基因。通 過重復(fù)此過程數(shù)代，產(chǎn)生和QM6a幾乎相同（其基因組>99%是相同的），但是攜帶MAT1-1基因 座并且有性能力的兩個菌株。然后對來自所述兩個獨(dú)立系的子代的第八代的基因組進(jìn)行測 序，并且通過基因組比較來鑒定導(dǎo)致FS或生育力所必需的備選基因（例如，同時存在于兩個 系中的CBS999.97特異性基因）。
[0109]為每個系制備兩個文庫，分別具有320bp和8kbp的插入片段大小。使用Covaris S2 系統(tǒng)（&3￥31^8，1]1。.￥〇13111'11，]\^)來使0嫩片段化并使用(>)]^911；[。1^?0?純化試劑盒（(^38611 ; Hilden,Germany)來純化片段。使用NEBNext DNA Sample Prep modules(New England 8101&&8，1?8?1(*，1^)，按照生產(chǎn)商的指示制備雙末端文庫。簡言之，使用1(16110?和了40祖聚 合酶對片段進(jìn)行末端修復(fù)，并用T4多核苷酸激酶進(jìn)行磷酸化。然后使用Klenow外-DNA聚合 酶將片段3'腺苷酸化，并使用0嫩連接酶來添加111111]1；[1^接頭(3(^口丨61')。使用(^38611凝膠 提取試劑盒(Qiagen; Hilden，Germany)對約400bp的連接產(chǎn)物進(jìn)行凝膠純化。為了避免在標(biāo) 準(zhǔn)Illumina文庫制備方案中的凝膠純化步驟中引入鳥嘌呤-胞嘧啶(GC)偏向性，在室溫下 而非加熱條件下溶解所述凝膠切片。使用PE PCR引物1.0和2.0(Illumina，San Diego，CA) 和Phusion DNA聚合酶(New England Biolabs，Ipswich,ΜΑ)對經(jīng)過大小選擇、接頭修飾的 DNA片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其方案為:聚合酶激活(98°C，30秒），然后進(jìn)行10個循環(huán)的（98°C變性 10秒，65°C退火30秒，72°C延伸50秒），最后72°C延伸5分鐘。純化文庫并使用Qubit HS測定 試劑盒（Invi trogen，Car lsbad，CA，USA)定量。
[0110] 在cluster station上使用TruSeq PE Cluster Kit v5進(jìn)行族擴(kuò)增，并且使用 TruSeq SBS 36Cycle Kits v5(Illumina，San Diego，CA)和2 X 107bp雙末端方案在一個 Illumina HiSeq 2000道上對全部文庫進(jìn)行測序。使用測序控制軟件（SCS)實(shí)時分析(RTA) v2.6和CASAVAvl.7來處理測序圖像文件以產(chǎn)生堿基響應(yīng)(base call)和phred樣堿基質(zhì)量 評分并且去除失敗的讀出(read)。
[0111] 用CLC基因組工作臺（5.1版本，CLC bio,Arhus,Denmark)對所述兩個系的序列進(jìn) 行質(zhì)量過濾，并用1^￥1316^2.60版本，1?〇(^6/454,8^11(^(^(1(：1'，1]3厶)和(^(：基因組工作臺 進(jìn)行從頭拼接。用BLAST(Altschul et al.，1990)和r2cat(Husemann and Stoye，2010)對 所獲得的支架和單拷貝重疊群（singleton contig)比對定位(map)到里氏木霉QM6a序列支 架上。使用定制版本的Mauve(Rissman et al.，2009)鑒定QM6a參考序列與兩個回交系的比 對序列之間的單核苷酸多態(tài)性（SNP)以及插入和缺失（Indel)。使用自定義R腳本將SNP和 Indel比對序列到QM6a編碼序列。因此獲得以下賦予里氏木霉QM6a雌性不育性的基因（表 3)。此外，說明了與所觀察到的里氏木霉QM6a的交配損傷相關(guān)的所述基因中的突變。表4示 出了在里氏木霉QM6a中被發(fā)現(xiàn)缺失的基因。表5表示通過敲除策略鑒定的與里氏木霉QM6a 中交配損傷相關(guān)的基因。




















































[0190] 實(shí)施例2
[0191] 鑒定與里氏木霉QM6a菌株或其衍生菌株中的交配損傷直接或間接相關(guān)的突變基 因。
[0192] 1.總述
[0193] 為了鑒定QM6a及其后代中與上述交配損傷直接或間接相關(guān)并且非功能性的基因， 以單獨(dú)或若干基因混合物的形式將所述基因轉(zhuǎn)化到其中MAT1-2基因座已被MAT1-1替代的 里氏木霉QM6a菌株中。將待測試的基因克隆到包含遺傳霉素抗性標(biāo)記的質(zhì)粒中，并通過原 生質(zhì)體轉(zhuǎn)化將所述質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到上述里氏木霉QM6a MAT1-1菌株中。然后通過PCR分析測試有 絲分裂穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化體中各個基因整合到染色體DNA中的情況。然后使陽性轉(zhuǎn)化體與里氏木 霉QM6a MAT1-2進(jìn)行可能的交配，并通過能育的子實(shí)體的形成進(jìn)行驗(yàn)證(通過分離子囊孢子 并證明其能夠與相反交配伴侶(opposite mating partner)進(jìn)行交配來測試它們的能育 性）。以下實(shí)驗(yàn)方案可用于鑒定為與交配損傷相關(guān)的任何基因。
[0194] 2.制備與交配損傷相關(guān)的基因中功能缺失的菌株
[0195] 首先通過經(jīng)典遺傳學(xué)(雜交、回交)與比較基因組測序的組合來鑒定雌性不育性備 選基因?；亟恢螳@得的能交配的菌株（CBS1/A8_02，MAT 1-1)和交配缺陷的初始菌株 (QM6a，MAT 1-2)之間的基因組差異根據(jù)定義必然包含交配的功能性補(bǔ)充所必需的全部基 因。此外，所需的FS基因必須被兩個回交系(CBS1/A8_02，MAT 1-1和CBS2/A8_11，MAT 1-1) 的終點(diǎn)菌株所共有。此外，在能交配背景下FS基因的失活必須使功能性交配削弱。采取全部 這些步驟以獲得一系列基因，當(dāng)將所述基因單獨(dú)或共同引入里氏木霉QM6a(MAT 1-1)中時 將重新恢復(fù)交配能力。
[0196] 因?yàn)樵诶锸夏久筈M6a中可能多于一個與交配相關(guān)的單個基因是無功能的，因此用 單個基因進(jìn)行的補(bǔ)充不會導(dǎo)致獲得交配功能性，在能交配的里氏木霉QM6a衍生株中制備全 部備選基因的敲除菌株。通過這種方式，可鑒定交配所需的任何基因是單獨(dú)導(dǎo)致QM6a的交 配缺陷還是作為一組失活的必需交配基因的一部分。為了實(shí)現(xiàn)這一目的，制備菌株CBS1/ A8_02(MAT1-1)的tku70缺失版本。通過使菌株CBS1/A8_02(MAT1-1)與菌株QM9414(里氏木 霉QM6a的不能交配的后代）的tku70缺失版本雜交而實(shí)現(xiàn)tku70基因的敲除，所述tku70缺失 版本攜帶吡啶硫胺氫溴酸鹽（ptrA)的抗性作為選擇性標(biāo)記物。篩選所述雜交的后代中 MAT1-1基因座的存在和tku70缺失。以下將所獲得的菌株稱為CBSl/A8_02Atku70。
[0197] 通過酵母重組克隆裝配由1.0-1.5kb的基因特異性側(cè)翼區(qū)的片段構(gòu)成的缺失盒， 所述側(cè)翼區(qū)的片段被在里氏木霉gpd啟動子和終止子下的賦予潮霉素(hph)抗性的基因所 中斷（Colot et al.，2006)。使用寡核苷酸（10yM)5F+5R以及3F+3R，使用Phusion聚合酶 (Thermo Fisher)，從菌株CBS 999.97/MAT1-1的基因組DNA上擴(kuò)增備選基因的單獨(dú)的側(cè)翼 區(qū)。使用引物hphF和hphR(hphF:GGATCCGAGAGCTACCTTAC(SEQ ID N0: 175)，hphR: CTCGAGGGTACTATGGCTTA(SEQIDN0:176))，通過PCR從質(zhì)粒pLHhph(Hartletal·，2007)擴(kuò) 增包括gpd啟動子和終止子序列的hph基因（2.7kb)。通過PCR將約19bp序列引入側(cè)翼區(qū)以與 酵母穿梭載體PRS426(URA+)或hph標(biāo)記基因重疊，從而允許進(jìn)行同源重組。為了擴(kuò)增所有片 段，使用遞減PCR(t 〇uchd〇wn PCR)程序，其退火溫度范圍為62°C至58°C。表6中給出了所使 用的寡核苷酸序列。
[0198] 通過這種方式，能交配菌株CBSl/A8_02Atku70(MAT 1-1)中在被敲除時并不消除 交配能力的基因被鑒定為不是交配必需的，并且因此被從里氏木霉雌性不育性的備選基因 列表中移除。為了這一目的，鑒定了4個基因，其缺失導(dǎo)致交配無能。所述基因是具有SEQ ID NO: 40、110、112和134的基因的功能性同源物。對于敲除了對應(yīng)于SEQ ID NO: 40、110、112和 134基因的功能性基因的轉(zhuǎn)化體而言，未發(fā)現(xiàn)交配。
[0199] 表6:為構(gòu)建敲除載體以缺失轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物ID 67350、76887、105832和59270的基因，用 于擴(kuò)增5 '和3 '插入片段的引物的序列。
[0202]實(shí)施例3:制備已補(bǔ)充與交配損傷相關(guān)的基因的菌株
[0203]為了獲得能夠成功地與作為交配伴侶的QM6a/MATl-2進(jìn)行有性繁殖的QM6a/MATl-1菌株，用質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌株QM6a/MATl-l，所述質(zhì)粒包含被鑒定為與里氏木霉QM6a/MATl-2菌株 中交配損傷相關(guān)的基因的功能性變體。
[0204] 通過轉(zhuǎn)化基因替代盒（其由MAT1-1基因座、標(biāo)記基因和用于在里氏木霉QM6a/ MAT1-2菌株中進(jìn)行同源整合的3'側(cè)翼區(qū)組成)來構(gòu)建QM6a/MATl-l菌株，所述QM6a/MATl-l 菌株用來與已鑒定的備選基因 Trire2_67350、Trire2_76887、Trire2_105832 和 Trire2_ 59270基因互補(bǔ)。使用引物MATl-l_InFusion fw(GTGCTGGAATTCAGGCCTGGCTTGATGCTGCTAACC TTC(SEQIDN0:193)#PMATl-l_InFusionrv(TCTGCAGAATTCAGGCCTACTCCGCAAGATCAAATCC G(SEQ ID NO: 194))，使用Phusion 聚合酶（Thermo Fisher)，從菌株 CBS999.97(MAT1-1)擴(kuò) 增包含3'區(qū)域的MAT1-1基因座D使用InFusion HD克隆系統(tǒng)（Infusion HD Cloning System CE，Clontech)將擴(kuò)增子克隆到PCR平端載體(pCR blunt，Invitrogen)中。使用在里氏木霉 gpd啟動子和終止子下的賦予潮霉素抗性的基因作為選擇性標(biāo)記物。使用引物hph_AvrII_ fw(GTCCACAGAAGAGCCTAGGACCTCTTCGGCGATACATACTC(SEQ ID NO:195))和hph_AvrII_rv (GGCTTTCACGGACCCTAGGTTGGAATCGACCTTGCATG(SEQ ID NO: 196))，通過PCR從質(zhì)粒pLHhph (Hartl et al.，2007)來擴(kuò)增hph盒。然后用AvrII(Thermo Fisher)消化包含MATl-1 基因座 (包括3'側(cè)翼區(qū)）的質(zhì)粒，以通過使用InFusion克隆系統(tǒng)（Infusion HD Cloning System CE，Clontech)將hph盒插入到matl-1-3基因與MATl-1基因座的3'側(cè)翼區(qū)之間。為了在里氏 木霉QM6a/MATl_2菌株中進(jìn)行交配型交換，使用引物l_2_replace_cassette_fw (TGGAACGACTTTGTACGCAC(SEQ ID NO:197))和1-2_rep1ace_cassette_rv (GGCACAAGAGGACAGACGAC(SEQ ID NO: 198))，通過PCR從所述質(zhì)粒來擴(kuò)增所述基因替代盒。 然后通過原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(Gruber等，1990)來轉(zhuǎn)化所述基因替代盒。在每次轉(zhuǎn)化中使用10yg DNA。以下將所獲得的菌株稱為QM6a/MATl-l。
[0205] 為了補(bǔ)充QM6a菌株的交配缺陷，將新鑒定的備選基因 Trire2_67350、Trire2_ 76887和Trire2_105832的野生型(CBS999.97)等位基因異位地引入QM6a/MATl-l菌株中。 [0206]對于異位基因整合，構(gòu)建包含所述備選基因的野生型（CBS999.97)等位基因以及 賦予對遺傳霉素二硫酸鹽G418的抗性的基因（nptll)的質(zhì)粒。選擇從維也納技術(shù)大學(xué)化學(xué) 工程研究所基因技術(shù)和應(yīng)用生物化學(xué)研究方向的載體保藏中心獲得的質(zhì)粒pPki-Gen(未公 布)作為轉(zhuǎn)化載體。所述質(zhì)粒衍生自質(zhì)粒pRLMex30(Mach etal.，1994)。用Xbal和Hindlll (Thermo Fisher Scientific/Fermentas，St.Leon-Rot，Germany)消化質(zhì)粒pRLMex30，去除 hph編碼區(qū)和cbh2終止子區(qū)（2066bp)，從而留下pkil啟動子。接下來使用引物GenFW (CCTCTTAACCTCTAGACGGCTTTGATTTCCTTCAGG)(SEQ ID NO: 1 56 )和GenRV (TGATTACGCCAAGCTTGGATTACCTCTAAACAAGTGTACCTGTG)(SEQ ID NO:157)從pII99(Namiki et al.，2001)擴(kuò)增包含約800bp trpC啟動子、nptll編碼區(qū)和約700bp trpC終止子的2.4kb 片段。通過InFusion重組(Clontech, USA)將所述兩個片段連在一起，得到質(zhì)粒pPki-Gen。 nptll基因賦予對遺傳霉素二硫酸鹽G418的抗性，其之后被用來選擇真菌轉(zhuǎn)化體。
[0207]在接下來的步驟中，用EcoRI和Xbal (Thermo Fisher Scientif ic/Fermentas， St .Leon-Rot，Germany)消化所述質(zhì)粒pPki-Gen以去除pkil啟動子(約740bp)。通過PCR從菌 株CBS999.97/MAT1-1擴(kuò)增被鑒定為導(dǎo)致交配損傷的基因（即Trire2_67350、Trire2_76887、 Trire2_105832 和 Trire2_59270)，并通過 In-Fusion 重組（Clontech, USA)將所述基因引入 cut載體中。表7中給出了用于擴(kuò)增各個基因的寡核苷酸。所獲得的質(zhì)粒的完整序列在SEQ ID N0:212-215和圖5-8中給出。
[0208] 表7:為構(gòu)建載體以補(bǔ)充里氏木霉QM6a菌株的交配缺陷，用來從菌株CBS999.97擴(kuò) 增備選基因的野生型等位基因的引物的序列。
[0211] 然后使用包含各個備選基因的環(huán)狀質(zhì)粒，通過原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(Gruber et al.， 1990)來轉(zhuǎn)化QM6a/MATl-l菌株。因?yàn)椴恢缹?dǎo)致交配缺陷的是單個基因還是各個備選基因 的組合，因此以單獨(dú)的以及組合的方式轉(zhuǎn)化所述備選基因。每次轉(zhuǎn)化反應(yīng)使用l〇yg環(huán)狀質(zhì) 粒。在總計(jì)6ml原生質(zhì)體懸液中，將每lml原生質(zhì)體懸液加到4ml覆蓋培養(yǎng)基（overlay medium)中，所述培養(yǎng)基包含濃度為lOOμg/ml的遺傳霉素硫酸鹽G418。然后將各個溶液傾倒 在包含麥芽浸出液瓊脂(2%w/v)的瓊脂平板上，所述瓊脂中已添加了濃度為100μg/ml的遺 傳霉素硫酸鹽G418以選擇真菌轉(zhuǎn)化體。在28 °C下和黑暗中孵育所述平板7天。然后將可能的 轉(zhuǎn)化體轉(zhuǎn)移到包含馬鈴薯葡萄糖瓊脂(Difco，USA)的新平板，所述瓊脂具有l(wèi)OOμg/ml的遺 傳霉素硫酸鹽G418以選擇真菌轉(zhuǎn)化體。
[0212] 然后通過PCR分析來測試有絲分裂穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化體中各個基因整合到染色體DNA中 的情況。根據(jù)Liu等(2000)提取染色體DNA。為了測試所述基因的陽性整合，使用基因特異性 弓丨物和在nptll盒中結(jié)合的引物。表8給出了其序列。
[0213] 表8:用于補(bǔ)充了各個雌性不育性備選基因的野生型等位基因的菌株QM6a/MATl_l 的基因分型的引物的序列。
[0215]然后使陽性轉(zhuǎn)化體與里氏木霉QM6a MAT1-2進(jìn)行交配測定。通過能育的子實(shí)體的 形成來驗(yàn)證交配。通過分離子囊孢子并證明其在萌發(fā)并長成菌絲體之后能夠與相反交配伴 侶進(jìn)行交配，來測試其能育性。
[0210]為了驗(yàn)證交配能力的恢復(fù)，在交配測定中測試陽性轉(zhuǎn)化體。在PDA(Dif co?，馬鈴薯 葡萄糖瓊脂）平板上進(jìn)行交配測定，在所述平板上共同培養(yǎng)里氏木霉野生型菌株QM6a/ MAT1-2(ATCC 13631)和補(bǔ)充有修復(fù)的備選基因的里氏木霉QM6a/MATl-l的陽性轉(zhuǎn)化體。在 室溫下(20-23Γ)將平板持續(xù)暴露于天然晝夜節(jié)律的光照周期，以促使子實(shí)體形成。通過從 子實(shí)體中分離子囊孢子并證明由其生長成的菌落能夠與相反交配伴侶進(jìn)行交配，來測試所 述子實(shí)體的能育性。
[0217] 表9示出了各個雌性不育性基因和對應(yīng)經(jīng)修正的并從而具備功能性的序列的相 關(guān)性
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【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種用于鑒定里氏木霉(Trichoderma reesei )QM6a菌株或其衍生菌株中與交配損 傷相關(guān)的基因/遺傳元件的方法，所述方法包括以下步驟： a) 提供第一菌株，所述菌株是具有MAT1-2基因座的里氏木霉QM6a菌株或其衍生菌株； b) 使所述菌株與第二菌株進(jìn)行有性雜交，所述第二菌株是具有補(bǔ)充的MAT1-1基因座的 里氏木霉(紅褐肉座菌(Hypocrea jecorina))的能交配的菌株； c) 使來自b)中的雜交或其回交的MAT1-1子代與a)的第一菌株進(jìn)行反復(fù)回交，直到獲得 與所述第一里氏木霉QM6a菌株或其衍生菌株基本上相同，但是攜帶MAT1-1基因座并且能夠 交配以與里氏木霉QM6a或任何其MAT1-2子代雜交的菌株； d) 從步驟c)選擇能夠交配以與具有MAT1-2基因座的里氏木霉(紅褐肉座菌）雜交的子 代；以及 e) 通過將步驟d)中所選的子代的基因組和a)中第一菌株的基因組序列進(jìn)行比較，來鑒 定與交配損傷相關(guān)的基因/遺傳元件，其中在第一菌株中所述基因/遺傳元件可完全或部分 缺失，或者以突變形式或具有缺失和/或插入的形式存在，因此是與里氏木霉QM6a菌株或其 衍生菌株中的交配損傷直接或間接相關(guān)的基因或遺傳元件。2. 根據(jù)權(quán)利要求1的方法，所述方法還包括將能交配菌株的功能性基因和/或遺傳元 件一一其對應(yīng)于權(quán)利要求1鑒定的與交配損傷相關(guān)的基因/遺傳元件一一插入到具有MAT1-1基因座的里氏木霉QM6a或其衍生菌株中，并使所述菌株與具有MAT1-2基因座的里氏木霉 QM6a或其衍生菌株雜交，籍此由具有MAT1-1基因座并具有插入的所述功能性基因和/或遺 傳元件的里氏木霉QM6a或其衍生菌株形成子實(shí)體，表明所述基因/遺傳元件與所述交配損 傷直接相關(guān)。3. -種用于鑒定與功能性基因和/或遺傳元件一一其對應(yīng)于權(quán)利要求1的方法鑒定的 與里氏木霉QM6a或其衍生菌株的交配損傷相關(guān)的基因/遺傳元件一一相關(guān)的能交配表型的 方法，所述方法包括以下步驟： a) 提供能交配的里氏木霉QM6a MAT 1-1菌株； b) 使上述功能性基因或遺傳元件不具備功能；以及 c) 測量所述里氏木霉QM6a MAT1-1菌株的交配能力，其中所述里氏木霉QM6a MAT1-1菌 株的陽性交配能力表明所述基因或遺傳元件對能交配表型而言是非必需的，并且其中所述 里氏木霉QM6a MAT1-1菌株的陰性交配能力表明所述基因或遺傳元件對能交配表型而言是 必需的。4. 權(quán)利要求1 _3中任一項(xiàng)的方法，其中所述衍生自里氏木霉QM6a的菌株選自QM9123、 QM913 6、QM9414、MG4、MG5、RUT-C30、RUT-D4、RUT-M7、RUT-NG14、MCG7 7、MCG80、M5、M6、MHC15、 MHC22、Kyowa X_31、Kyowa PC-l_4、Kyowa PC-3-7、TU_6以及其衍生菌株。5. 權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的方法，其中所述第二菌株是CBS999.97 MAT1-1。6. 權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的方法，其中所述回交重復(fù)7-19個循環(huán)。7. 權(quán)利要求6的方法，其中所述回交重復(fù)8-9個循環(huán)。8. 權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的方法，其中所述與交配損傷直接或間接相關(guān)的基因/遺傳元 件選自SEQ ID N0:8-155和SEQ ID N0:163-170。9. 權(quán)利要求8的方法，其中所述與交配損傷直接或間接相關(guān)的基因/遺傳元件是選自以 下的基因/遺傳元件：SEQ ID N0:36、SEQ ID N0:40、SEQ ID N0:56、SEQ ID N0:58、SEQ ID N0:60、SEQ ID N0:66、SEQ ID N0:68、SEQ ID N0:72、SEQ ID N0:82、SEQ ID N0:92、SEQ ID N0:100、SEQ ID N0:110、SEQ ID N0:112、SEQ ID N0:118、SEQ ID N0:120、SEQ ID N0:122、 SEQ ID N0:124、SEQ ID N0:134、SEQ ID N0:138、SEQ ID N0:144、SEQ ID N0:146、SEQ ID NO:148和SEQ ID NO:152。10. 權(quán)利要求8的方法，其中所述與交配損傷直接或間接相關(guān)的基因/遺傳元件是選自 SEQIDN0:40、SEQIDN0:110、SEQIDN0:112和SEQIDN0:134的基因/遺傳元件。11. 一種關(guān)于修正里氏木霉QM6a菌株或其衍生菌株的交配損傷的方法，所述菌株具有 MAT1-1基因座并且不能與具有MAT1-2基因座的里氏木霉QM6a菌株或其衍生菌株交配，其中 通過權(quán)利要求2-8中任一項(xiàng)的方法鑒定的一個或多個突變的或者完全或部分缺失的基因 和/或遺傳元件是被相應(yīng)的功能性基因和/或遺傳元件替代或補(bǔ)充。12. 權(quán)利要求11的方法，其中所述被替代或補(bǔ)充的基因和/或遺傳元件選自SEQ ID N0s:8-155或SEQ ID N0s:163-174,并且其中所述被修正的突變、插入或缺失選自表3。13. 權(quán)利要求12的方法，其中所述被替代或補(bǔ)充的基因和/或遺傳元件選自SEQ ID NO: 36、SEQ ID N0:40、SEQ ID N0:56、SEQ ID N0:58、SEQ ID N0:60、SEQ ID N0:66、SEQ ID N0:68、SEQ ID N0:72、SEQ ID N0:82、SEQ ID N0:92、SEQ ID N0:100、SEQ ID N0:110、SEQ ID N0:112、SEQ ID N0:118、SEQ ID N0:120、SEQ ID N0:122、SEQ ID N0:124、SEQ ID NO: 134、SEQIDN0:138、SEQIDN0:144、SEQIDN0:146、SEQIDN0:148和SEQIDN0:152。14. 權(quán)利要求12的方法，其中所述被替代或補(bǔ)充的基因和/或遺傳元件選自SEQ ID NO: 40、SEQIDN0:110、SEQIDN0:112和SEQIDN0:134。15. -種通過權(quán)利要求11 -14中任一項(xiàng)的方法獲得的里氏木霉QM6a或其衍生菌株的能 夠自體交配的真菌菌株。16. -種適用于目的產(chǎn)物的工業(yè)生產(chǎn)的木霉屬（肉座菌屬）的真菌菌株，其中所述菌株 是已根據(jù)權(quán)利要求11-14中任一項(xiàng)的方法獲得，并且已經(jīng)用編碼目的產(chǎn)物的基因轉(zhuǎn)化。17. 根據(jù)權(quán)利要求16的真菌菌株用于目的產(chǎn)物的工業(yè)生產(chǎn)的用途。18. 權(quán)利要求16的菌株或權(quán)利要求17的用途，其中所述目的產(chǎn)物選自食品酶、飼料酶、 工藝酶、激素、免疫球蛋白、疫苗、抗菌蛋白或抗病毒蛋白。19. 與里氏木霉QM6a或其衍生菌株中的交配損傷相關(guān)的基因/遺傳元件，其具有SEQ ID NO :8-155或SEQ ID NO :163-174的序列。20. 與里氏木霉QM6a或其衍生菌株中的交配損傷相關(guān)的基因/遺傳元件，其具有SEQ ID N0:40、SEQIDN0:110、SEQIDN0:112或SEQIDN0 :134的序列或從其衍生的功能等價(jià)序 列。21. 里氏木霉QM6a或其衍生菌株的交配能力所必需的基因或遺傳元件，其具有SEQ ID N0:216、SEQ ID N0:218、SEQ ID N0:220、SEQ ID N0:222或SEQ ID N0:224、SEQ ID NO: 226、SEQ ID NO:228、SEQ ID NO:230的序列或從其衍生的功能等價(jià)序列。
【文檔編號】C12N15/80GK105980565SQ201380068881
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2013年12月23日
【發(fā)明人】C·P·庫比切克, R·林克, B·賽博斯, T·哈曼, P·勞倫茨
【申請人】Ab酶有限公司