一種快速檢測(cè)人13號(hào)、18號(hào)、21號(hào)、x和y染色體數(shù)目的試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種快速檢測(cè)人13號(hào)、18號(hào)、21號(hào)、X和Y染色體數(shù)目的試劑盒，包括擴(kuò)增檢測(cè)試劑，該擴(kuò)增檢測(cè)試劑包括：1條熒光標(biāo)記的通用擴(kuò)增引物和13對(duì)重復(fù)序列擴(kuò)增引物中的至少一對(duì)，各有3對(duì)重復(fù)序列引物分別用于檢測(cè)21號(hào)、18號(hào)和13號(hào)染色體的數(shù)目，有4對(duì)重復(fù)序列引物用于檢測(cè)X或Y染色體的數(shù)目。每對(duì)重復(fù)序列引物均能同時(shí)擴(kuò)增位于不同兩條染色體上的目標(biāo)序列和參考序列，目標(biāo)序列和參考序列是位于目標(biāo)染色體和參考染色體兩條染色體上的兩個(gè)相似序列，通過(guò)目標(biāo)序列和參考序列擴(kuò)增量的比值能有效檢測(cè)出目標(biāo)序列所在染色體的數(shù)量。采用該試劑盒檢測(cè)可在單個(gè)反應(yīng)管中同時(shí)檢測(cè)13號(hào)、18號(hào)、21號(hào)、X和Y染色體數(shù)目，結(jié)果準(zhǔn)確。
【專利說(shuō)明】
-種快速檢測(cè)人13號(hào)、18號(hào)、21號(hào)、X和Y染色體數(shù)目的試劑盒
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及醫(yī)學(xué)檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種快速檢測(cè)人13號(hào)、18號(hào)、21號(hào)、X和Y 染色體數(shù)目的試劑盒.
【背景技術(shù)】
[0002] 染色體病主要是因染色體的數(shù)目或結(jié)構(gòu)異常引起的疾病，臨床上常會(huì)引起流產(chǎn)、 死胎、早夭、先天性智力低下、發(fā)育滯后、多發(fā)崎形及性發(fā)育不全等疾病的發(fā)生。目前，此類 疾病仍無(wú)理想的治療方法，因此，及早進(jìn)行產(chǎn)前診斷W選擇性的終止妊娠是預(yù)防該類疾病 發(fā)生的關(guān)鍵。
[0003] 羊水細(xì)胞培養(yǎng)和染色體核型分析是實(shí)現(xiàn)染色體病產(chǎn)前診斷的經(jīng)典方法 (Caspersson T,Zech LJohansson C,et 曰I.Identific曰tion of human chromosomes by DNA-binding fluorescent agents[J] .Qiromosoma,1970,30(2) :215-227.),但是，該方法 存在費(fèi)時(shí)(一般要兩周W上）、容易培養(yǎng)失敗W及不能檢測(cè)較小的染色體結(jié)構(gòu)崎變等缺點(diǎn)。 巧光原位雜交(FISH)技術(shù)應(yīng)用于產(chǎn)前快速診斷，無(wú)需進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，24小時(shí)內(nèi)就可得出檢 驗(yàn)結(jié)果（Ho SSY,Chua C,Gole L, et al. Same-day prenatal diagnosis of common chromosomal aneuploidies using microfluidics-fIuorescence in situ hyb;ridization[J] .Prenatal Dia即osis,2012,32(4) :321-328.等）；但是，由于該技術(shù)操 作繁瑣并且要求具有良好的技術(shù)專業(yè)性，使得該技術(shù)不能大量的進(jìn)行臨床標(biāo)本的應(yīng)用。因 此，需要建立更加快速而有效的產(chǎn)前診斷方法來(lái)彌補(bǔ)W上方法的一些缺陷和不足。
[0004] 隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，目前已出現(xiàn)了幾種快速分子診斷非整倍體的方法。STR- QF-PCR方法是目前應(yīng)用最廣的一種方法，該方法能實(shí)現(xiàn)非整倍體的檢測(cè)，該方法設(shè)及的文 章 （Atef SH,Hafez S,Helmy S,et al.QF-PCR as a Rapid Technique for Routine Prenatal Diagnosis of Fetal Aneuploidies[J].Pediatric Research,2011,70:412- 412.)和專利（公開號(hào)為 103614361A、101838689A、103555849A、101407843、103074416A的發(fā) 明專利）的研究相對(duì)較多，但是該技術(shù)的主要缺點(diǎn)是診斷需要依靠多態(tài)性位點(diǎn)，而多態(tài)性位 點(diǎn)可能在某一人群能較好的進(jìn)行診斷，但因?yàn)榉N族的差異可能會(huì)出現(xiàn)在其它人群中無(wú)法進(jìn) 診斷的t青況（Mann K,Dona邑hue C,Fox SP,et al. Strategies for the rapid prenatal diagnosis of chromosome aneuploidy[J] .Eur J Hum Genet, 2004,12:907-915.);并且， 基于STR的QF-PCR需要多種巧光標(biāo)記，受STR多態(tài)性分子標(biāo)記的限制，每條染色體需要檢測(cè) 多個(gè)位點(diǎn)才能滿足檢測(cè)的要求，如果檢測(cè)位點(diǎn)少，那么就可能出現(xiàn)不能檢測(cè)的情況;而如果 檢測(cè)位點(diǎn)多，那么需要的引物也越多，因此，針對(duì)不同的染色體往往需要多管PCR才能進(jìn)行 診斷，從而也影響了其使用的方便性和操作的簡(jiǎn)便性。多重連接探針擴(kuò)增(MLPA)技術(shù)最開 始應(yīng)用于基因拷貝數(shù)的變化，后來(lái)應(yīng)用于非整倍體疾病的診斷（Slater皿，Bruno DL，Ren H,et al.Rapid,high throughput prenatal detection of aneuploidy using a novel quantitative method(MLPA)[J]. Journal of medical genetics ,2003,40(12):907- 912.)，由于該技術(shù)需要雜交過(guò)夜、連接W及產(chǎn)物的后續(xù)毛細(xì)管電泳分析等步驟，不僅對(duì)DNA 樣本的質(zhì)量要求高，而且實(shí)驗(yàn)的后續(xù)分析也需要?？诘能浖虼?，也存在操作繁瑣，條件 苛刻，技術(shù)要求高等不足(Willis AS,Veyver I,Eng CM.Multiplex ligation-dependent probe amplification(MLPA)and prenatal diagnosis[J].Prenat Diagn,2012;32:315- 320.) O
[0005] 在本發(fā)明人的前期研究中，基本實(shí)現(xiàn)了常見染色體非整倍體的檢測(cè)，相關(guān)的研究 已經(jīng)在SCI雜志上發(fā)表化ong X，Li L，Sun L，F(xiàn)u K，Long J，Weng X，Ye X，Liu X，Wang B, Yan S,Ye H,Fan Z.Rapid diagnosis of aneuploidy using segmental duplication quanti1:ative fluorescent PCR[J].Plos One,2014,9(3) :e88932.)。但是，前期的研究還 存在著一些缺陷或不足，前期的研究中每管只能檢測(cè)染色體的一個(gè)位點(diǎn)，位點(diǎn)相對(duì)較少，易 造成假陰性或假陽(yáng)性情況的發(fā)生；另一方面，前期的研究也沒有開發(fā)出一條公共的擴(kuò)增引 物，因此，每對(duì)重復(fù)序列均需要單獨(dú)進(jìn)行巧光標(biāo)記，從而造成檢測(cè)成本的增加，優(yōu)化的難度 的也增加;再者，由于前期單管檢測(cè)的位點(diǎn)少，因此，需要多管同時(shí)檢測(cè)，從而容易造成實(shí)驗(yàn) 的繁瑣W及操作上的錯(cuò)誤。綜上所述，前期的研究主要還存在檢測(cè)位點(diǎn)少，巧光標(biāo)記過(guò)多， 不能實(shí)現(xiàn)單管檢測(cè)等缺點(diǎn)。
[0006] 鑒于前期檢測(cè)體系的不足，本發(fā)明人重新篩選并驗(yàn)證了一系列新的重復(fù)序列分子 標(biāo)記，通過(guò)一系列新的分子標(biāo)記序列設(shè)計(jì)并合成了相應(yīng)的擴(kuò)增引物，經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的優(yōu)化，使1 條通用引物和13對(duì)重復(fù)序列引物能在同一個(gè)PCR反應(yīng)體系中擴(kuò)增，并擴(kuò)增出26個(gè)不同片段 大小的巧光標(biāo)記產(chǎn)物。通過(guò)不同片段大小的重復(fù)序列的擴(kuò)增量的巧光比值，即可判斷出所 檢測(cè)目標(biāo)染色體的拷貝數(shù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種快速檢測(cè)人13號(hào)、18號(hào)、21號(hào)、X和Y染色體數(shù) 目的試劑盒。該試劑盒可W在單個(gè)反應(yīng)管中實(shí)現(xiàn)人13號(hào)、18號(hào)、21號(hào)、X和Y染色體數(shù)目的快 速檢測(cè)，且檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確、可靠、特異性強(qiáng)。
[0008] 本發(fā)明所述的快速檢測(cè)人13號(hào)、18號(hào)、21號(hào)、X和Y染色體數(shù)目的試劑盒，包括擴(kuò)增 檢測(cè)試劑，該擴(kuò)增檢測(cè)試劑包括：
[0009] -、下述(1)-(13)中的至少一個(gè)引物對(duì)：
[0010] (1)同時(shí)擴(kuò)增13號(hào)染色體特異重復(fù)序列C虹13-1與6號(hào)染色體特異重復(fù)序列C虹6的 引物對(duì)，它們的堿基序列分別如SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:2所示；
[0011] (2)同時(shí)擴(kuò)增13號(hào)染色體特異重復(fù)序列C虹13-2與5號(hào)染色體特異重復(fù)序列Ch巧-1 的引物對(duì)，它們的堿基序列分別如SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:4所示；
[0012] (3)同時(shí)擴(kuò)增13號(hào)染色體特異重復(fù)序列C虹13-3與9號(hào)染色體特異重復(fù)序列chr9-l 的引物對(duì)，它們的堿基序列分別如SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:6所示；
[OOU] (4)同時(shí)擴(kuò)增18號(hào)染色體特異重復(fù)序列C虹18-1與8號(hào)染色體特異重復(fù)序列C虹8的 引物對(duì)，它們的堿基序列分別如SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:8所示；
[0014] (5)同時(shí)擴(kuò)增18號(hào)染色體特異重復(fù)序列C虹18-2與19號(hào)染色體特異重復(fù)序列C虹19 的引物對(duì)，它們的堿基序列分別如SEQ ID NO:32和SEQ ID NO: 10所示；
[0015] (6)同時(shí)擴(kuò)增18號(hào)染色體特異重復(fù)序列C虹18-3與5號(hào)染色體特異重復(fù)序列Ch巧-2 的引物對(duì)，其堿基序列分別如SEQ ID NO:33和SEQ ID NO: 12所示；
[0016] (7)同時(shí)擴(kuò)增21號(hào)染色體特異重復(fù)序列C虹21-1與2號(hào)染色體特異重復(fù)序列C虹2的 引物對(duì)，它們的堿基序列分別如SEQ ID NO:34和SEQ ID NO: 14所示；
[0017] (8)同時(shí)擴(kuò)增21號(hào)染色體特異重復(fù)序列C虹21-2與9號(hào)染色體特異重復(fù)序列chr9-2 的引物對(duì)，它們的堿基序列分別如SEQ ID NO:35和SEQ ID NO: 16所示；
[0018] (9)同時(shí)擴(kuò)增21號(hào)染色體特異重復(fù)序列C虹21-3與15號(hào)染色體特異重復(fù)序列C虹15 的引物對(duì)，它們的堿基序列分別如SEQ ID NO:36和SEQ ID NO: 18所示；
[0019] (10)同時(shí)擴(kuò)增巧染色體特異重復(fù)序列Chrl與Y染色體特異重復(fù)序列Ch巧-1的引 物對(duì)，它們的堿基序列分別如SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:20所示；
[0020] (11)同時(shí)擴(kuò)增X染色體特異重復(fù)序列Ch巧-1與Y染色體特異重復(fù)序列Ch巧-2的引 物對(duì)，它們的堿基序列分別如SEQ ID NO:38和SEQ ID NO:22所示；
[0021] (12)同時(shí)擴(kuò)增16號(hào)染色體特異重復(fù)序列Chrie與X染色體特異重復(fù)序列Ch巧-2的 引物對(duì)，其堿基序列分別如SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:24所示；
[0022] (13)同時(shí)擴(kuò)增3號(hào)染色體特異重復(fù)序列chr3與X染色體特異重復(fù)序列Ch巧-3的引 物對(duì)，它們的堿基序列分別如SEQ ID NO:40和SEQ ID NO:26所示；
[0023] 二、通用引物：同時(shí)擴(kuò)增上述（1)-(13)中所有重復(fù)序列的通用引物，其序列如SEQ ID NO:27所示。
[0024] 本發(fā)明技術(shù)方案中，每一對(duì)引物均可W同時(shí)擴(kuò)增不同兩條染色體上的不同片段大 小的特異重復(fù)序列，每對(duì)引物可W單獨(dú)使用，也可W任意兩對(duì)W上組合使用。當(dāng)試劑盒包括 上述（1)-(13)中全部的引物對(duì)時(shí)，可W實(shí)現(xiàn)在單個(gè)反應(yīng)管中實(shí)現(xiàn)人13號(hào)、18號(hào)、21號(hào)、X和Y 染色體數(shù)目的快速檢測(cè)，還可實(shí)現(xiàn)對(duì)具有兩個(gè)檢測(cè)位點(diǎn)的5號(hào)和9號(hào)染色體的非整倍體進(jìn)行 檢測(cè)，并能實(shí)現(xiàn)對(duì)只有一個(gè)檢測(cè)位點(diǎn)的1號(hào)、2號(hào)、3號(hào)、6號(hào)、8號(hào)、15號(hào)、16號(hào)及19號(hào)染色體的 非整倍體進(jìn)行篩查。
[0025] 本發(fā)明技術(shù)方案中，所設(shè)及的各重復(fù)序列及其公開擴(kuò)增引物如下述表1所示：
[0026] 表1:
[00271
[C
[0029]上述表1中的"重復(fù)序列編號(hào)"是指在本試劑盒或反應(yīng)體系中給予重復(fù)序列的編 號(hào)，同時(shí)，也是其在毛細(xì)管電泳中的片段大小排列順序；"重復(fù)序列所在染色體"是指重復(fù)序 列(實(shí)際是兩條堿基相似度非常高的序列)分別定位于哪兩條染色體；"重復(fù)序列的位點(diǎn)"是 本試劑盒給予的檢測(cè)序列位點(diǎn)的名字或代碼；"公共擴(kuò)增引物"是指本試劑盒中擴(kuò)增對(duì)應(yīng)重 復(fù)序列所用到的公共擴(kuò)增引物。W重復(fù)序列I(SDl)為例：SDl為13號(hào)染色體與6號(hào)染色體的 重復(fù)序列（分別如圖1曰、圖Ib所示）；兩條染色體上的重復(fù)序列分別為SD1-13(NC_ 000013.11:45533516-45533710)和 SD1-6(NC_000006.11:66803785-66803976);試劑盒選 擇了重復(fù)序列SD1-13和SD1-6上的chrl3-l和chr6兩段DNA序列作為PCR擴(kuò)增的目標(biāo)檢測(cè)序 列；引物56〇10^:1和56〇10^:2為重復(fù)序列中的證^3-1和油扣序列的公共擴(kuò)增引物 (如圖Ic所示）。
[0030] 本發(fā)明技術(shù)方案中，所述堿基序列SEQ ID NO:28至堿基序列SEQ ID NO:40,分別 是由通用引物與相應(yīng)重復(fù)序列的公共擴(kuò)增引物中的上游引物相連形成加尾而獲得，具體如 下：
[0031] (1)將通用引物(SEQ ID N0:27)與SEQ ID N0:1相連接，得到通用引物加尾的序列 為沈Q ID NO:28的引物序列；
[0032] (2)將通用引物(SEQ ID N0:27)與SEQ ID N0:3相連接，得到通用引物加尾的序列 為沈Q ID NO:29的引物序列；
[00削 （3)將通用引物(SEQ ID N0:27)與SEQ ID N0:5相連接，得到通用引物加尾的序列 為沈Q ID NO:30的引物序列；
[0034] (4)將通用引物(SEQ ID N0:27)與SEQ ID N0:7相連接，得到通用引物加尾的序列 為沈Q ID NO:31的引物序列；
[00對(duì) （5)將通用引物(SEQ ID NO:27)與SEQ ID N0:9相連接，得到通用引物加尾的序列 為沈Q ID NO:32的引物序列；
[0036] (6)將通用引物(SEQ ID N0:27)與SEQ ID NO: 11相連接，得到通用引物加尾的序 列為SEQ ID NO:33的引物序列；
[0037] (7)將通用引物(SEQ ID N0:27)與SEQ ID NO: 13相連接，得到通用引物加尾的序 列為SEQ ID NO:34的引物序列；
[0038] (8)將通用引物(SEQ ID N0:27)與SEQ ID NO: 15相連接，得到通用引物加尾的序 列為SEQ ID NO:35的引物序列；
[0039] (9)將通用引物(SEQ ID N0:27)與SEQ ID NO: 17相連接，得到通用引物加尾的序 列為SEQ ID NO:36的引物序列；
[0040] (10)將通用引物(SEQ ID N0:27)與SEQ ID NO: 19相連接，得到通用引物加尾的序 列為SEQ ID NO:37的引物序列；
[0041 ] (11)將通用引物(SEQ ID N0:27)與SEQ ID N0:21相連接，得到通用引物加尾的序 列為SEQ ID NO:38的引物序列；
[0042] (12)將通用引物(SEQ ID N0:27)與SEQ ID N0:23相連接，得到通用引物加尾的序 列為SEQ ID NO:39的引物序列；
[0043] (13)將通用引物(SEQ ID N0:27)與SEQ ID N0:25相連接，得到通用引物加尾的序 列為SEQ ID NO:40的引物序列。
[0044] 本發(fā)明技術(shù)方案中，所述的通用引物需要進(jìn)行巧光標(biāo)記W得到巧光標(biāo)記的通用引 物，將所述通用引物與重復(fù)序列的公共擴(kuò)增引物中的一條相連形成加尾，那么，單條巧光標(biāo) 記的通用引物就能同時(shí)擴(kuò)增13對(duì)重復(fù)序列，擴(kuò)增出26個(gè)帶巧光標(biāo)記的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。具體在 巧光標(biāo)記時(shí)，可W應(yīng)用市面上各種常見的巧光標(biāo)記對(duì)其進(jìn)行標(biāo)記，本申請(qǐng)中，優(yōu)選采用6- FAM巧光標(biāo)記于5 '端，其中巧光基團(tuán)FAM指簇基巧光素。
[0045] 本發(fā)明試劑盒用于檢測(cè)21-S體、18-S體、13-S體和性染色體數(shù)目異常的原理如 下:本發(fā)明所述的試劑盒通過(guò)在染色體間特異重復(fù)序列(兩個(gè)相似序列）的兩端完全相同的 DNA序列部位設(shè)計(jì)一對(duì)共同的擴(kuò)增引物(如圖Ic所示），避免了不同引物擴(kuò)增不同序列產(chǎn)生 的相互干擾或其它條件的干擾，從而保證了兩個(gè)序列（即為一個(gè)重復(fù)序列)擴(kuò)增效率的一致 性。將重復(fù)序列的其中一條公共擴(kuò)增引物與通用引物相連接一起合成，那么擴(kuò)增后的重復(fù) 序列產(chǎn)物就帶上了巧光標(biāo)記，再根據(jù)巧光信號(hào)的高度計(jì)算重復(fù)序列間的峰值比例，即通過(guò) 定量重復(fù)序列間的巧光比值判斷兩條染色體之間拷貝數(shù)的變化。對(duì)于常染色體，正常樣本 的重復(fù)序列的相對(duì)定量比值為2:2,即比值為1;而S體樣本的比值為3:2,即比值為1.5(如 后續(xù)表3所示）；對(duì)于性染色體的判斷，利用常染色體與X染色體進(jìn)行比較，利用常染色體與X 染色體進(jìn)行比較，X染色體與Y染色體進(jìn)行比較，W判斷染色體的數(shù)目（如后續(xù)表4所示）。
[0046] 具體地，13號(hào)、18號(hào)、21號(hào)、X和Y染色體拷貝數(shù)根據(jù)重復(fù)序列間擴(kuò)增產(chǎn)物的巧光值 的比例來(lái)計(jì)算，分別如下：
[0047] (1)13號(hào)染色體拷貝數(shù)的計(jì)算是根據(jù)油43-1與(：虹6擴(kuò)增產(chǎn)物的巧光比值、油"3- 2與C虹5-1擴(kuò)增產(chǎn)物的巧光比值W及C虹13-3與C虹9-1擴(kuò)增產(chǎn)物的巧光比值；
[004引（2)18號(hào)染色體拷貝數(shù)的計(jì)算是根據(jù)ChrlS-I與C虹8擴(kuò)增產(chǎn)物的巧光比值、ChrlS- 2與C虹19擴(kuò)增產(chǎn)物的巧光比值W及C虹18-3與C虹5-2擴(kuò)增產(chǎn)物的巧光比值；
[0049] (3)21號(hào)染色體拷貝數(shù)的計(jì)算是根據(jù)chr21-l與C虹2擴(kuò)增產(chǎn)物的巧光比值、chr21- 2與C虹9-2擴(kuò)增產(chǎn)物的巧光比值W及C虹21-3與C虹15擴(kuò)增產(chǎn)物的巧光比值；
[0050] (4)Y染色體拷貝數(shù)的計(jì)算是根據(jù)Chrl與Ch巧-1擴(kuò)增產(chǎn)物的巧光比值W及Ch^-I 與C虹Y-2擴(kuò)增產(chǎn)物的巧光比值；
[0051 ] (5)X染色體拷貝數(shù)的計(jì)算是根據(jù)Ch巧-1與Ch巧-2擴(kuò)增產(chǎn)物的巧光比值、Chrie與 C虹X-2擴(kuò)增產(chǎn)物的巧光比值W及C虹3與C虹X-3擴(kuò)增產(chǎn)物的巧光比值。
[0052] 進(jìn)一步的，本發(fā)明提供的試劑盒中還包括有分子量?jī)?nèi)標(biāo)，采用巧光染料標(biāo)記分子 量?jī)?nèi)標(biāo)，包括 75、100、139、150、160、200、250、300、340、350、400、450、490、500 等 14 個(gè)片段長(zhǎng) 度，使用時(shí)加入電泳混合液與待測(cè)樣本一起電泳，用于檢測(cè)等位基因的片段長(zhǎng)度。
[0053] 本發(fā)明試劑盒中所設(shè)及的引物均是來(lái)源于所篩選出的染色體間特異的重復(fù)序列， 特異重復(fù)序列的開發(fā)是研究成果的關(guān)鍵，試劑盒所開發(fā)的重復(fù)序列主要有：
[0化4] 13號(hào)染色體與6號(hào)染色體間的重復(fù)序列分別為SDl-13(NC_000013.11:45533516- 45533710) 和 SDl-6(NC_000006.11:66803785-66803976);
[0化日]13號(hào)染色體與5號(hào)染色體間的重復(fù)序列分別為SD2-13(NC_000013.11:103445949- 10：M46146) 和 SD2-5(NC_000005.9:127445772-127445571);
[0化6] 13號(hào)染色體與9號(hào)染色體間的重復(fù)序列分別為SD3-13(NC_000013.11:19056785- l9063757) 和 SD3-9(NC_000009.11:96398139-96391197);
[0化7] 18號(hào)染色體與8號(hào)染色體間的重復(fù)序列分別為SD4-18(NC_000018.10:55302603- 55302903) 和 SD4-8(NC_000008.11:74166980-74166674);
[0化引 18號(hào)染色體與19號(hào)染色體間的重復(fù)序列分別為SD5-18(NC_000018.10:3456352- ：M58411) 和SD5-19(NC_000019.9:466405:34-46640620);
[0化9] 18號(hào)染色體與5號(hào)染色體間的重復(fù)序列分別為SD6-18(NC_000018.10:43887609- 43888143) 和 SD6-5(NC_000005.9:74906109-74906672);
[0060] 21號(hào)染色體與2號(hào)染色體間的重復(fù)序列分別為SDT-SUNLOOOOSl.giAAeTSSSS- AAeTTgeS) 和 SD7-2(NC_000002.11:86371055-86406746);
[0061 ] 21號(hào)染色體與9號(hào)染色體間的重復(fù)序列分別為SD8-21(NC_000021.9:20174376- 20175408)和SD8-9(NC_000009.11:115391095-115392117);
[0062] 21號(hào)染色體與15號(hào)染色體間的重復(fù)序列分別為SDg-SUNLOOOOSl.gaAOSSSSO- iAOAATgg) 和 SD9-15(NC_000015.9:46532227-46541458);
[0063] 1號(hào)染色體與Y染色體間的重復(fù)序列分別為SDlO-I (202371840-202414823)和 SD10-Y(NC_000024.10：26328480-26365418)；
[0064] X染色體與Y染色體間的重復(fù)序列分別為SD11-X(NC_000023.11: 11335972- 11339369)和SD11-Y(NC_000024.9:6701615-6704983);
[00化]16號(hào)染色體與X染色體間的重復(fù)序列分別為SD12-16(NC_000016.9:69151913- 69154553) 和 SD12-X(NC_000023.11:44633469-44636065);
[0066] 3號(hào)染色體與X染色體間的重復(fù)序列分別為SD13-3(NC_000003.11:25797003- 25799031) 和 SD13-X(NC_000023.11:78129748-78131776) 。
[0067] 本發(fā)明技術(shù)方案中所述的重復(fù)序列是指不同的兩條染色體上的兩個(gè)大部分堿基 序列相同的兩個(gè)DNA序列，在一些文獻(xiàn)中，也稱為相似序列或同源基因或同源序列等。
[0068] 本發(fā)明所述的試劑盒還包括一些現(xiàn)有試劑盒中常規(guī)且必須的組分，如陽(yáng)性對(duì)照模 板、陰性對(duì)照模板、緩沖液、酶液、dNTP、Mg2+等。
[0069] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明所述試劑盒可實(shí)現(xiàn)單管快速檢測(cè)21號(hào)、18號(hào)、13號(hào)、X和Y 染色體數(shù)目，同時(shí)，由于采用通過(guò)巧光標(biāo)記的引物進(jìn)行巧光標(biāo)記擴(kuò)增，一條巧光標(biāo)記的引物 就能實(shí)現(xiàn)所有26個(gè)擴(kuò)增產(chǎn)物的巧光標(biāo)記，從而大大節(jié)約了檢測(cè)成本;另一方面，本發(fā)明所述 試劑盒基于重復(fù)片段的SD-QF-PCR技術(shù)既具有STR-QF-PCR方法的簡(jiǎn)便性和批量處理能力， 也具有MLPA技術(shù)的基于非多態(tài)性檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)。因此，本發(fā)明所述試劑盒具有快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn) 確、可批量化、應(yīng)用廣泛、成本低廉等諸多優(yōu)點(diǎn)。
【附圖說(shuō)明】
[0070] 圖1為6號(hào)染色體和13號(hào)染色體間的重復(fù)序列的位點(diǎn)及引物信息；其中，（a)為6號(hào) 染色體上的特異重復(fù)序列chr6在6號(hào)染色體上的位置，（b)為13號(hào)染色體上的特異重復(fù)序列 chrl3-l在13號(hào)染色體上的位置；（C)為6號(hào)染色體上的特異重復(fù)序列chr6和13號(hào)染色體上 的特異重復(fù)序列chrl3-l，W及根據(jù)序列設(shè)計(jì)的公共擴(kuò)增引物；
[0071] 圖2為質(zhì)控品（正常樣本)的重復(fù)序列的擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖譜；
[0072] 圖3為13-=體綜合征羊水標(biāo)本的擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖譜；
[0073] 圖4為18-=體綜合征羊水標(biāo)本的擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖譜；
[0074] 圖5為21-=體綜合征羊水標(biāo)本的擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖譜；
[0075] 圖6為Kl inef e 1 ter綜合征(47，XXY)羊水標(biāo)本的擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖譜；
[0076] 圖7為化rner綜合征(45，X)羊水標(biāo)本的擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖譜；
[0077] 圖8為超雄綜合征(47，XYY)羊水標(biāo)本的擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖譜。
【具體實(shí)施方式】
[0078] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳述，W更好地理解本發(fā)明的內(nèi)容，但 本發(fā)明并不限于W下實(shí)施例。
[0079] 實(shí)施例1:采用本發(fā)明所述試劑盒對(duì)正常標(biāo)本、待測(cè)13- =體標(biāo)本、待測(cè)18- =體標(biāo) 本、待測(cè)21-=體標(biāo)本、待測(cè)47，XXY標(biāo)本、待測(cè)45，X標(biāo)本、待測(cè)47，XYY標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)。
[0080] 1、重復(fù)序列的比對(duì)查詢
[0081 ] 通過(guò)NCBI的Blast功能，對(duì)不同染色體上的序列進(jìn)行比對(duì)，在其中找出目標(biāo)染色體 和參考序列染色體上兩條染色體特異的重復(fù)序列，并通過(guò)設(shè)計(jì)不同的引物對(duì)重復(fù)序列的特 異性進(jìn)行驗(yàn)證，最后篩查出的重復(fù)序列如下：
[0082] (1)13號(hào)染色體與6號(hào)染色體間的重復(fù)序列分別為SD1-13(NC_000013. 11 : 45533516-45533710)和SD1-6(NC_000006.11:66803785-66803976);
[008；3] (2)13號(hào)染色體與5號(hào)染色體間的重復(fù)序列分別為SD2-13(NC_000013. 11 : 10：3445949-10：3446146)和SD2-5(NC_000005.9:127445772-127445571);
[0084] (3)13號(hào)染色體與9號(hào)染色體間的重復(fù)序列分別為SD3-13(NC_000013. 11 : 19056785-19063757)和SD3-9(NC_000009.11:96398139-96391197);
[0085] (4)18號(hào)染色體與8號(hào)染色體間的重復(fù)序列分別為SD4-18(NC_000018.10: 55302603-55302903)和SD4-8(NC_000008.11:74166980-74166674);
[0086] (5)18號(hào)染色體與19號(hào)染色體間的重復(fù)序列分別為SD5-18(NC_000018.10: :3456352-:3458411)和SD5-19(NC_000019.9:466405:34-46640620);
[0087] (6)18號(hào)染色體與5號(hào)染色體間的重復(fù)序列分別為SD6-18(NC_000018.10: 43887609-43888143)和SD6-5(NC_000005.9:74906109-74906672);
[008引 （7)21號(hào)染色體與2號(hào)染色體間的重復(fù)序列分別為SD7-21(NC_000021.9: 44675538-44677965)和SD7-2(NC_000002.11:86371055-86406746);
[0089] (8)21號(hào)染色體與9號(hào)染色體間的重復(fù)序列分別為SD8-21(NC_000021.9: 20174376-20175408)和SD8-9(NC_000009.11:115391095-115392117);
[0090] (9)21號(hào)染色體與15號(hào)染色體間的重復(fù)序列分別為SD9-21(NC_000021.9: 14035550-14044799)和SD9-15(NC_000015.9:46532227-46541458);
[0091] (10)1號(hào)染色體與Y染色體間的重復(fù)序列分別為SDlO-I (202371840-202414823)和 SD10-Y(NC_000024.10：26328480-26365418)；
[0092] (11 )X染色體與Y染色體間的重復(fù)序列分別為SDl 1-X(NC_000023.11:11335972- 11339369)和SD11-Y(NC_000024.9:6701615-6704983);
[009引 （12)16號(hào)染色體與X染色體間的重復(fù)序列分別為SD12-16(NC_000016.9: 69151913-69154553)和SD12-X(NC_000023.11:44633469-44636065);
[0094] a3)3號(hào)染色體與X染色體間的重復(fù)序列分別為SD13-3(NC_000003.11:25797003- 25799031)和SD13-X(NC_000023.11:78129748-78131776)。
[00巧]2、試劑盒的組成：
[0096] 2.1通用引物的設(shè)計(jì)
[0097] 通過(guò)NCBI的Blast功能，設(shè)計(jì)一條長(zhǎng)度為20bp，與人類或其它動(dòng)物DNA序列沒有同 源性的一段DNA片段作為通用引物，通用引物序列具體如下所示。采用6-FAM巧光標(biāo)記于5' 端，即得通用巧光標(biāo)記引物。
[009引 TYYW:5'-TGCACGCTGACGACTGGTAC-3'（SEQ ID N0:27)。
[0099] 2.2試劑盒重復(fù)序列的擴(kuò)增引物
[0100] 本發(fā)明所述的快速檢測(cè)人13號(hào)、18號(hào)、21號(hào)、X和Y染色體數(shù)目的試劑盒，根據(jù)篩選 選出了 13個(gè)重復(fù)序列，設(shè)計(jì)、合成并驗(yàn)證了一系列的引物，最后，試劑盒成功優(yōu)化出了 13對(duì) 擴(kuò)增引物。每對(duì)擴(kuò)增引物中有一條采用通用引物連接加尾，W便能用巧光標(biāo)記的通用引物 對(duì)13個(gè)重復(fù)序列進(jìn)行同時(shí)擴(kuò)增，擴(kuò)增出帶有巧光標(biāo)記的擴(kuò)增產(chǎn)物，W便后續(xù)毛細(xì)管電泳分 析檢測(cè)。
[0101] (1)檢測(cè)13號(hào)染色體數(shù)目的引物：
[0102] 本發(fā)明總共篩選出了 3個(gè)重復(fù)序列用于檢測(cè)13號(hào)染色體的數(shù)目，分別是SDl (chrl3-l 和 C虹6)、SD2(chrl3-2 和 Ch 巧-1)和 SD3(chrl3-3 和 chr9-l)用于檢測(cè) 13 號(hào)染色體 的數(shù)目：
[0103] SDUc虹13-1和C虹6)的擴(kuò)增引物為：
[0104] 5'-CCTGATCCAGTGACTGCTCTC-3'（SEQ ID N0:1);
[0105] 5'-GCAAGATGAAGGGGATGTCCA-3'（沈Q ID N0:2);
[0106] 采用通用引物(SEQ ID N0:27)對(duì)SDl上游引物進(jìn)行加尾連接：
[0107] 5'-TGCACGCTGACGACTGGTACCCTGATCCAGTGACTGCTCTC-3'（沈Q ID NO：28)；
[010引 SD2(c虹13-2和C虹9-1)的擴(kuò)增引物為：
[0109] 5'-CTTTTTGGGATTTCTACTGCAATCT-3'（SEQ ID N0:3);
[0110] 5'-TGCAAGATAGTGCAGCCTGG-3'（沈Q ID N0:4);
[0111] 采用通用引物(SEQ ID N0:27)對(duì)SD2上游引物進(jìn)行加尾連接：
[0112] 5'-TGCACGCTGACGACTGGTACCTTTTTGGGATTTCTACTGCAATCT-3'（沈Q ID NO：29)；
[0113] SD3(c虹13-3和C虹5-1)的擴(kuò)增引物為：
[0114] 5'-GGCCAAAATCAGCTCAAGGG-3'（沈Q ID N0:5);
[0115] 5'-GGGCTGCTCAGGGTTCC-3'（沈Q ID N0:6);
[0116] 采用通用引物(SEQ ID N0:27)對(duì)SD3上游引物進(jìn)行加尾連接：
[0117] 5'-TGCACGCTGACGACTGGTACGGCCAAAATCAGCTCAAGGG-3'（沈Q ID NO：30)；
[011引序列C虹6和chrl3-l在染色體的定位分別如圖1 (a)、圖1 (b)中所示，重復(fù)序列的具 體堿基序列W及相應(yīng)的引物設(shè)計(jì)如圖1 (C )所示。
[0119] (2)檢測(cè)18號(hào)染色體數(shù)目的引物：
[0120] 本發(fā)明總共篩選出了 3個(gè)重復(fù)序列用于檢測(cè)18號(hào)染色體的數(shù)目，分別是SD4 (chrlS-l和C虹8)、SD5khrl8-2和C虹19)和SD6(chrl8-3和C虹5-2)用于檢測(cè)18號(hào)染色體的 數(shù)目：
[0121] SD4(c虹18-1和C虹8)的擴(kuò)增引物為：
[0122] 5'-TGCTGGATATATGAAACTCAGACC-3'（沈Q ID N0:7);
[0123] 5'-TCATGCCTGGTCATTTGGGT-3'（SEQ ID N0:8);
[0124] 采用通用引物(SEQ ID N0:27)對(duì)SD4上游引物進(jìn)行加尾連接：
[012引 5'-TGCACGCTGACGACTGGTACTGCTGGATATATGAAACTCAGACC-3'（沈Q ID NO:31);
[0126] SD5(c虹18-2和C虹19)的擴(kuò)增引物為：
[0127] 5'-GGGCCAAACCCAACCCT-3'（沈Q ID N0:9);
[012引 5，-ATATCTGTGTTTTGTCCCACACC-3,（沈Q ID N0:10);
[0129] 采用通用引物(SEQ ID N0:27)對(duì)SD5上游引物進(jìn)行加尾連接：
[0130] 5'-TGCACGCTGACGACTGGTACGGGCCAAACCCAACCCT-3'（沈Q ID NO：32)；
[0131] SD6(c虹18-3和C虹5-2)的擴(kuò)增引物為：
[0132] 5'-TGCTGTAGAGCAAGGTGAGT-3'（SEQ ID N0:11);
[0133] 5'-CAGCCTCACTTAATTCTGAGGT-3'（SEQ ID N0:12);
[0134] 采用通用引物(SEQ ID N0:27)對(duì)SD6上游引物進(jìn)行加尾連接：
[01 巧]5'-TGCACGCTGACGACTGGTACTGCTGTAGAGCAAGGTGAGT-3'（沈Q ID NO:33);
[0136] (3)檢測(cè)21號(hào)染色體數(shù)目的引物：
[0137] 本發(fā)明總共篩選出了 3個(gè)重復(fù)序列用于檢測(cè)21號(hào)染色體的數(shù)目，分別是SD7 (chr21-l 和 C虹2)、SD8(chr21-2 和 chr9-2)和 SD9(chr21-3 和 C虹 15)用于檢測(cè) 21 號(hào)染色體的 數(shù)目：
[013引 SD7(c虹21-1和C虹2)的擴(kuò)增引物為：
[0139] 5'-AGCTCCAGATCACCATGCTC-3'（SEQ ID N0:13);
[0140] 5'-AAAACTGGCCCGAAGGGTAG-3'（沈Q ID N0:14);
[0141] 采用通用引物(SEQ ID N0:27)對(duì)SD7上游引物進(jìn)行加尾連接：
[0142] 5'-TGCACGCTGACGACTGGTACAGCTCCAGATCACCATGCTC-3'（SEQ ID NO:34);
[0143] SD8(c虹21-2和C虹9-2)的擴(kuò)增引物為：
[0144] 5'-AGGCAAACATTATACACACAATGG-3'（沈Q ID N0:15);
[0145] 5'-TCTGCTGCCTGTCAATATTTGT-3'（SEQ ID N0:16);
[0146] 采用通用引物(SEQ ID N0:27)對(duì)SD8上游引物進(jìn)行加尾連接：
[0147] 5'-TGCACGCTGACGACTGGTACAGGCAAACATTATACACACAATGG-3'（沈Q ID NO:35);
[014引 SD9(c虹21-3和C虹15)的擴(kuò)增引物為：
[0149] 5'-TCCACAGAATCTGAAGGCTCC-3'（沈Q ID N0:17);
[01 加]5'-TACTTTAATTAGCTGACAGCATGTG-3'（沈Q ID N0:18);
[0151] 采用通用引物(SEQ ID N0:27)對(duì)SD9上游引物進(jìn)行加尾連接：
[0152] 5'-TGCACGCTGACGACTGGTACTCCACAGAATCTGAAGGCTCC-3'（沈Q ID NO：36)
[0153] (4)檢測(cè)X和Y染色體數(shù)目的引物：
[0154] 本發(fā)明總共篩選出了 4個(gè)重復(fù)序列用于檢測(cè)性染色體的數(shù)目，分別是SD10(chrl和 C 虹 Y-l)、SDll(chri(-巧日ch巧-2)、SD12(c虹16和c虹X-2)和SD13(chr巧日c虹X-3)用于檢測(cè)X 和Y染色體的數(shù)目：
[0巧5] SD10(c虹1和C虹Y-1)的擴(kuò)增引物為：
[0K6] 5'-GGTTGTGCTAAAAACACTCTTTGC-3'（SEQ ID N0:19);
[0157] 5'-TCTGGAATGTGGCTGCTGT-3'（SEQ ID N0:20);
[015引采用通用引物(SEQ ID N0:27)對(duì)SDlO上游引物進(jìn)行加尾連接：
[0159] 5'-TGCACGCTGACGACTGGTACGGTTGTGCTAAAAACACTCTTTGC-3'（SEQ ID NO:37);
[0160] SDlUc虹X-I和C虹Y-2)的擴(kuò)增引物為：
[0161] 5'-ACTGTCTAGACAATCACCCCA-3'（沈Q ID N0:21);
[0162] 5'-AAAAGTATGATCCAGCTACTACAGA-3'（沈Q ID N0:22);
[0163] 采用通用引物(SEQ ID N0:27)對(duì)SDll上游引物進(jìn)行加尾連接：
[0164] 5'-TGCACGCTGACGACTGGTACACTGTCTAGACAATCACCCCA-3'（沈Q ID NO:38);
[01化]SD12(c虹16和C虹X-2)的擴(kuò)增引物為：
[0166] 5'-AGTAAGAAACAATGGGCAGAAAGC-3'(SEQ ID NO：23)；
[0167] 5'-TTTCCCTCCAGGACCACCTT-3'（沈Q ID N0:24);
[016引采用通用引物(SEQ ID N0:27)對(duì)SD12上游引物進(jìn)行加尾連接：
[01~]5'-TGCACGCTGACGACTGGTACAGTAAGAAACAATGGGCAGAAAGC-3'（沈Q ID NO：39)；
[0170] SD13(c虹3和C虹X-3)的擴(kuò)增引物為：
[0171] 5'-GGTTTTGCCTAGGTCCAGTG-3'（沈Q ID N0:25);
[0172] 5'-CCTGGTAATACAGCTCAGTGTCA-3'（沈Q ID N0:26);
[0173] 采用通用引物(SEQ ID N0:27)對(duì)SD13上游引物進(jìn)行加尾連接：
[0174] 5'-TGCACGCTGACGACTGGTACGGTTTTGCCTAGGTCCAGTG-3'（沈Q ID NO：40)；
[0175] 2.3其它組成成分：
[0176] Hotstar-Taq酶，緩沖液，dATP、dTTP、dCTP和dGTPW及Mg2+均購(gòu)自北京康為世紀(jì)生 物科技有限公司。
[0177] 3、PCR反應(yīng)體系的配制：
[0178] 按下述表2配制PCR反應(yīng)體系：
[01巧]表2: (ml表示mmol/L，]iM表示皿ol/L)
[0180]
[01811
[0182」PCR反應(yīng)體系為50uL。
[0183] 4、樣本的來(lái)源及處理
[0184] 樣本來(lái)源于經(jīng)傳統(tǒng)的染色體核型分析方法確定核型的DNA樣本，DNA樣本采用實(shí)驗(yàn) 室常規(guī)DNA提取方法進(jìn)行提取，W雙蒸水稀釋至20ngAiL，并于-20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0185] 5、PCR擴(kuò)增程序：
[0186] PCR反應(yīng)所用儀器為普通的PCR儀。PCR反應(yīng)程序?yàn)?95°C預(yù)變性10min;95°C15sec， 6〇1：3〇36(3,72°(：1111111，30個(gè)循環(huán);在72°(：延伸3〇111111;最后于15°(：保溫備用。
[0187] 6、毛細(xì)管電泳分析:將IuL PCR產(chǎn)物與23uL甲酯胺和IuL分子量標(biāo)準(zhǔn)品（Applied Biosystems)混合。該混合物在95°C下變性3分鐘，并放置在冰上，W防止重新退火，直到進(jìn) 一步分析。使用P〇p4凝膠(ABI)在ABUlSOxI遺傳分析儀(Applied Biosystems)進(jìn)行電泳分 析。對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行分離，采用GeneMapper ID軟件V3.2(Applied Biosystems)進(jìn)行數(shù)據(jù)分 析。分別統(tǒng)計(jì)SD-QF-PCR和染色體核型分析檢測(cè)結(jié)果，并進(jìn)行比對(duì)分析。
[0188] 7、結(jié)果檢測(cè)與分析：
[0189] 當(dāng)樣本為正常標(biāo)本時(shí)，21號(hào)、18號(hào)和13號(hào)染色體序列與參考染色體序列間的重復(fù) 序列(相似序列）的擴(kuò)增量比值為2:2,即1:1的比值關(guān)系(檢測(cè)結(jié)果見圖2);而當(dāng)目標(biāo)染色體 為S體時(shí)，其比值關(guān)系則為3:2,即為1.5:1的關(guān)系(檢測(cè)結(jié)果見圖3、圖4、圖5)。21號(hào)、18號(hào)和 13號(hào)染色體的數(shù)目與檢測(cè)比值的關(guān)系見表3。
[0190] 表3:
[0191]
[0192] 當(dāng)樣本為正常男性標(biāo)本時(shí)，X:Y=1:1，常染色體:性染色體(X或Y)為2:1的比值關(guān) 系；當(dāng)樣本為正常女性標(biāo)本時(shí)，Y = O,常染色體:X染色體為2:2的比值關(guān)系（檢測(cè)結(jié)果見圖 2)。
[0193] 當(dāng)樣本為47，XXY樣本時(shí)，X: Y= 2:1;常染色體:Y染色體為2:1的比值關(guān)系；常染色 體:X染色體為2:2的比值關(guān)系(檢測(cè)結(jié)果見圖6)。
[0194] 當(dāng)樣本為45，X樣本時(shí)，Y = O;常染色體:X染色體為2:1的比值關(guān)系(檢測(cè)結(jié)果見圖 7)。
[0195] 當(dāng)樣本為47 ,XYY樣本時(shí)，X: Y= 1: 2;常染色體:Y染色體為2: 2的比值關(guān)系；常染色 體:X染色體為2:1的比值關(guān)系(檢測(cè)結(jié)果見圖8)。
[0196] X與Y染色體的數(shù)目與檢測(cè)的比值關(guān)系見表4。
[0197] 表4: 「ni〇Rl
L〇199」實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，試劑盆的檢測(cè)體系能非帯有效檢測(cè)出21號(hào)，18號(hào)，13號(hào)，X和Y染色 體的數(shù)目，與傳統(tǒng)的染色體核型分析判斷的結(jié)果一致，因此，本發(fā)明所述試劑盒能用于臨床 標(biāo)本的檢測(cè)。
[0200] 實(shí)施例2:用實(shí)施例1所述試劑盒、方法、步驟等對(duì)臨床標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)
[0201] 采用試劑盒對(duì)33例正常標(biāo)本，12例21-S體標(biāo)本，3例13-S體標(biāo)本，6例18-S體標(biāo) 本，3例45，X樣本，2例47 ,XXY樣本，1例47 ,XYY樣本進(jìn)行檢測(cè)，所有樣本均來(lái)源自經(jīng)傳統(tǒng)的染 色體核型分析方法確定核型的DNA樣本。
[0202] 通過(guò)21號(hào)染色體與2號(hào)，9號(hào)和15號(hào)染色體間的重復(fù)序列的巧光比值判斷21號(hào)染色 體的拷貝數(shù)。
[0203] 通過(guò)18號(hào)染色體與8號(hào)，19號(hào)和5號(hào)染色體間的重復(fù)序列的巧光比值判斷18號(hào)染色 體的拷貝數(shù)。
[0204] 通過(guò)13號(hào)染色體與6號(hào)，5號(hào)，9號(hào)染色體間的重復(fù)序列的巧光比值判斷13號(hào)染色體 的拷貝數(shù)。
[0205] 通過(guò)X染色體與3號(hào)，16號(hào)和Y染色體間的重復(fù)序列的巧光比值判斷X染色體的拷貝 數(shù)。
[0206] 通過(guò)Y染色體與1號(hào)和X染色體間的重復(fù)序列的巧光比值判斷Y染色體的拷貝數(shù)。
[0207] 21號(hào)，18號(hào)和13號(hào)染色體的檢測(cè)結(jié)果見表5。
[0208] 表5:13號(hào)、18號(hào)和21號(hào)染色體目標(biāo)序列與參考序列間巧光比值結(jié)果及分析
[0209]
[0210]
[0211] X和Y染色體的檢測(cè)結(jié)果見表6。
[0212] 表6:X和Y染色體目標(biāo)序列與參考序列間巧光比值結(jié)果及分析
[0215]
[0216] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，試劑盒可實(shí)現(xiàn)單管多重定量巧光PC財(cái)夾速、準(zhǔn)確和穩(wěn)定的檢測(cè)出13 號(hào)、18號(hào)、21號(hào)、X和Y染色體的數(shù)目，檢測(cè)結(jié)果與傳統(tǒng)的染色體核型分析方法一致，準(zhǔn)確率為 100%，結(jié)果可讀性好，分析、檢測(cè)過(guò)程簡(jiǎn)單、高效。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種快速檢測(cè)人13號(hào)、18號(hào)、21號(hào)、X和Y染色體數(shù)目的試劑盒，包括擴(kuò)增檢測(cè)試劑，其 特征在于:所述的擴(kuò)增檢測(cè)試劑包括： 一、 下述(1)-(13)中的至少一個(gè)引物對(duì)： (1) 同時(shí)擴(kuò)增13號(hào)染色體特異重復(fù)序列chrl3-l與6號(hào)染色體特異重復(fù)序列chr6的引物 對(duì)，它們的堿基序列分別如SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:2所示； (2) 同時(shí)擴(kuò)增13號(hào)染色體特異重復(fù)序列chrl3-2與5號(hào)染色體特異重復(fù)序列chr5-l的引 物對(duì)，它們的堿基序列分別如SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:4所示； (3) 同時(shí)擴(kuò)增13號(hào)染色體特異重復(fù)序列chrl3-3與9號(hào)染色體特異重復(fù)序列chr9-l的引 物對(duì)，它們的堿基序列分別如SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:6所示； (4) 同時(shí)擴(kuò)增18號(hào)染色體特異重復(fù)序列chrl8-l與8號(hào)染色體特異重復(fù)序列chr8的引物 對(duì)，它們的堿基序列分別如SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:8所示； (5) 同時(shí)擴(kuò)增18號(hào)染色體特異重復(fù)序列chrl8-2與19號(hào)染色體特異重復(fù)序列chrl9的引 物對(duì)，它們的堿基序列分別如SEQ ID NO:32和SEQ ID NO: 10所示； (6) 同時(shí)擴(kuò)增18號(hào)染色體特異重復(fù)序列chrl8-3與5號(hào)染色體特異重復(fù)序列chr5-2的引 物對(duì)，其堿基序列分別如SEQ ID NO:33和SEQ ID NO: 12所示； (7) 同時(shí)擴(kuò)增21號(hào)染色體特異重復(fù)序列chr21-l與2號(hào)染色體特異重復(fù)序列chr2的引物 對(duì)，它們的堿基序列分別如SEQ ID NO:34和SEQ ID NO: 14所示； (8) 同時(shí)擴(kuò)增21號(hào)染色體特異重復(fù)序列chr21-2與9號(hào)染色體特異重復(fù)序列chr9-2的引 物對(duì)，它們的堿基序列分別如SEQ ID NO:35和SEQ ID NO: 16所示； (9) 同時(shí)擴(kuò)增21號(hào)染色體特異重復(fù)序列chr21-3與15號(hào)染色體特異重復(fù)序列chrl5的引 物對(duì)，它們的堿基序列分別如SEQ ID NO:36和SEQ ID NO: 18所示； (10) 同時(shí)擴(kuò)增1號(hào)染色體特異重復(fù)序列chrl與Y染色體特異重復(fù)序列chrY-1的引物對(duì)， 它們的堿基序列分別如SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:20所示； (11) 同時(shí)擴(kuò)增X染色體特異重復(fù)序列chrX-1與Y染色體特異重復(fù)序列chrY-2的引物對(duì)， 它們的堿基序列分別如SEQ ID NO:38和SEQ ID NO:22所示； (12) 同時(shí)擴(kuò)增16號(hào)染色體特異重復(fù)序列chrl6與X染色體特異重復(fù)序列chrX-2的引物 對(duì)，其堿基序列分別如SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:24所示； (13) 同時(shí)擴(kuò)增3號(hào)染色體特異重復(fù)序列chr3與X染色體特異重復(fù)序列chrX-3的引物對(duì)， 它們的堿基序列分別如SEQ ID NO:40和SEQ ID NO:26所示； 二、 通用引物：同時(shí)擴(kuò)增上述（1)-(13)中所有重復(fù)序列的通用引物，其序列如SEQ ID NO :27所示。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于:所述堿基序列SEQ ID N0:28至堿基序列 SEQ ID N0:40,分別是由通用引物與相應(yīng)重復(fù)序列的公共擴(kuò)增引物中的上游引物相連形成 加尾而獲得，各重復(fù)序列及其公開擴(kuò)增引物如下述表1所示： 表1:3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于:所述的通用引物采用熒光標(biāo)記于5 ' 端。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于:所述的通用引物采用6-FAM熒光標(biāo)記于 5'端。5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于：13號(hào)、18號(hào)、21號(hào)、X和Y染色體拷貝數(shù)根 據(jù)重復(fù)序列間擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光值的比例來(lái)計(jì)算，具體如下： (1) 13號(hào)染色體拷貝數(shù)的計(jì)算是根據(jù)chrl3-l與chr6擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光比值、chrl3-2與 chr5-l擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光比值以及chrl3-3與chr9-l擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光比值； (2) 18號(hào)染色體拷貝數(shù)的計(jì)算是根據(jù)(：1^18-1與(31^8擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光比值、(31^18-2與 chrl9擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光比值以及chrl8-3與chr5-2擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光比值； (3) 21號(hào)染色體拷貝數(shù)的計(jì)算是根據(jù)chr21-l與chr2擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光比值、chr21-2與 chr9-2擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光比值以及chr21-3與chrl5擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光比值； (4) Y染色體拷貝數(shù)的計(jì)算是根據(jù)chrl與chrY-Ι擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光比值以及chrX-Ι與 chrY-2擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光比值； (5) X染色體拷貝數(shù)的計(jì)算是根據(jù)chrX-Ι與chrY-2擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光比值、chrl6與chrX-2擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光比值以及chr3與chrX-3擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光比值。6. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于:該試劑盒可實(shí)現(xiàn)對(duì)13號(hào)、18號(hào)、21號(hào)、 X和Y染色體的檢測(cè)，還可實(shí)現(xiàn)對(duì)具有兩個(gè)檢測(cè)位點(diǎn)的5號(hào)和9號(hào)染色體的非整倍體進(jìn)行檢 測(cè)，并能實(shí)現(xiàn)對(duì)只有一個(gè)檢測(cè)位點(diǎn)的1號(hào)、2號(hào)、3號(hào)、6號(hào)、8號(hào)、15號(hào)、16號(hào)及19號(hào)染色體的非 整倍體進(jìn)行篩查。7. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于:試劑盒中的重復(fù)序列的公共擴(kuò)增引 物來(lái)源于以下重復(fù)序列： (1) 13號(hào)染色體與6號(hào)染色體間的重復(fù)序列分別為SD1-13即 以及 SDl-6SPNC_000006.11:66803785-66803976; (2) 13號(hào)染色體與5號(hào)染色體間的重復(fù)序列分別為SD2-13即NC_000013.11:103445949-103446146 以及 SD2-5S 卩NC_000005 · 9:127445772-127445571; (3) 13號(hào)染色體與9號(hào)染色體間的重復(fù)序列分別為503-13即％_000013.11:19056785-19063757 以及 SD3-9BPNC_000009.11:96398139-96391197; (4) 18號(hào)染色體與8號(hào)染色體間的重復(fù)序列分別為SD4-18即NC_000018.10:55302603-55302903 以及 SD4-8S 卩NC_000008.11:74166980-74166674; (5) 18號(hào)染色體與19號(hào)染色體間的重復(fù)序列分別為SD5-18即NC_000018.10:3456352-3458411 以及 SD5-19 即NC_000019 · 9:46640534-46640620; (6) 18號(hào)染色體與5號(hào)染色體間的重復(fù)序列分別為506-18即％_000018.10:43887609-43888143 以及 SD6-5S 卩NC_000005 · 9:74906109-74906672; (7) 21號(hào)染色體與2號(hào)染色體間的重復(fù)序列分別為SD7-21即 以及 SD7-2SPNC_000002.11:86371055-86406746; (8) 21號(hào)染色體與9號(hào)染色體間的重復(fù)序列分別為SD8-21即NCJiOOOSl.gdOnASTe-SOnSAOS 以及 SD8-9BPNC_000009.11:115391095-115392117; (9) 21號(hào)染色體與15號(hào)染色體間的重復(fù)序列分別為SD9-21即 和 SD9-15 即 NC_000015 · 9:46532227-46541458; (10) 1號(hào)染色體與Y染色體間的重復(fù)序列分別為SD10-1即202371840-202414823以及 SD10-Y即NC_000024·10:26328480-26365418; (11 )X染色體與Y染色體間的重復(fù)序列分別為SD11-X即NC_000023.11:11335972-11339369 以及 SD11-Y 即NC_000024.9:6701615-6704983; (12)16號(hào)染色體與乂染色體間的重復(fù)序列分別為5012-168卩叱_000016.9:69151913_ 69154553 以及 SD12-X 即NC_000023.11:44633469-44636065; (13 )3號(hào)染色體與X染色體間的重復(fù)序列分別為SD13-3即NC_000003.11:25797003-25799031 以及 SD13-X 即NC_000023 · 11:78129748-78131776。
【文檔編號(hào)】C12N15/11GK105925691SQ201610320884
【公開日】2016年9月7日
【申請(qǐng)日】2016年5月16日
【發(fā)明人】孫雷
【申請(qǐng)人】孫雷