一種用于鑒別鴿子性別的引物、試劑盒及其鑒別方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于鑒別鴿子性別的引物、試劑盒及其鑒別方法，所述引物的序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示，該引物具有特異性好，分辨率高，擴增效果好等優(yōu)點，不需進行酶切，直接進行瓊脂糖凝膠電泳。而且，相對于一條特異性產物，兩條特異性產物具有更高的辨識度，使得擴增結果可以一眼就可以分辨出來；本發(fā)明還提供了利用所述引物鑒別鴿子性別的方法，該方法在利用上述引物特異性擴增的前提下，還能夠通過簡化樣品DNA的獲得過程，縮短了鑒別鴿子性別的時間成本和經濟成本，利用所述引物鑒別鴿子性別的方法具有廣泛的市場利用價值。
【專利說明】
-種用于鑒別銷子性別的引物、試劑盒及其鑒別方法
技術領域
[0001] 本發(fā)明設及分子生物學檢測技術領域，更具體地，設及一種用于鑒別錯子性別的 引物、試劑盒及其鑒別方法。
【背景技術】
[0002] 性別鑒定在家禽的育種、養(yǎng)殖成本的控制等生產環(huán)節(jié)尤為重要。不同性別的個體 其營養(yǎng)需求不同，及早區(qū)分性別可W對個體區(qū)別飼養(yǎng);對于種錯養(yǎng)殖，需要合理的性別比 例，早期的性別鑒定將有助于實現運一過程。
[0003] 錯子屬于單態(tài)鳥，其性別不論是在幼鳥還是在成鳥時期，都很難從外觀及其它行 為上加 W區(qū)別。翻肛鑒別法是目前在家禽生產中運用最廣泛的方法，但是初生錯體型小，僅 有IOg左右，難W在早期進行性別鑒定，只有到5月齡左右才可W用此方法鑒別，且鑒別的結 果正確率低，耗時耗力。
[0004] 利用雌雄錯子在CHDl基因上序列和拷貝數的不同，使用對錯子傷害盡可能小的材 料，如羽毛、血液等，運用兩步法PCR(聚合酶鏈式反應）、瓊脂糖凝膠電泳、凝膠成像系統(tǒng)等 技術對錯子進行性別鑒定。降低檢測成本，提高成功率，降低技術口檻，為錯子的生產甚至 家禽的生產帶來革命性的改變;現有技術中存在一些鑒定錯子性別的引物和方法，但公開 的引物一些僅僅是擴增出一條帶，通過條帶大小不同來鑒別錯子性別，運存在特異性不足， 甚至假陰性的可能。

【發(fā)明內容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的技術問題是克服現有技術存在的上述缺陷，提供一種新的用于 鑒別錯子性別的引物。
[0006] 本發(fā)明的第二個目的是提供一種利用鑒別錯子性別的方法。
[0007] 本發(fā)明的第=個目的是提供含有上述引物的試劑盒。
[000引本發(fā)明的第四個目的是通過所述引物或者試劑盒的應用。
[0009] 本發(fā)明的目的是通過W下技術方案予W實現的： 一種用于鑒別錯子性別的引物，所述引物的序列如SEQ ID NO: 1和SEQ ID N0:2所示。
[0010] 發(fā)明人通過針對相同的目標區(qū)段，設計了多組引物，用于檢測運些引物鑒定錯子 性別的特異性，其結果發(fā)現，只有SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO:2所示的引物能夠特異性且靈 敏的鑒別錯子性別。
[0011] 因此，本發(fā)明還保護一種含有SEQ ID NO: 1和SEQ ID N0:2所示引物的試劑盒。
[0012] 該試劑盒可用于工業(yè)生產，從而實現快速鑒別錯子性別的產業(yè)化，優(yōu)選地，所述試 劑盒還包括PCR反應液、DNA提取液。
[0013] 需要說明的是，本發(fā)明所述DNA提取液可W是現有技術中存在的能夠提取到錯子 DNA(無論是羽毛DNA還是血液DNA)的提取液，只要能夠提取到錯子DNA用于PCR，都適用于 本發(fā)明的技術方案。
[0014] 在實際生產中，10日齡甚至更小的錯子沒有足夠采集的羽毛。因此可W嘗試通過 血液樣品來檢測錯子的性別，運一時期的乳錯行動能力及反應能力都比較差，且錯子的性 情比較溫順，因此采血液時不會造成較大的應激，對錯子造成的危害較小。
[0015] 因此優(yōu)選地，所述DNA提取液可W是血液樣裂解液和羽毛樣裂解液;所述血液樣裂 解液選自DMSO、TE緩沖液或者雙蒸水;所述羽毛樣裂解液為PBS緩沖液。
[0016] 本發(fā)明還提供上述引物或者上述試劑盒在鑒別錯子性別中的應用。
[0017]本發(fā)明還提供一種鑒別錯子性別的PCR方法，包括W下步驟： 51. 加入沈Q ID NO a和沈Q ID NO: 2所述引物，樣品DNA，PCR反應液進行PCR反應； 52. PCR反應后采用凝膠電泳分析電泳條帶大小，進行結果判定:若顯示大小分別為 474bp與319bp的兩條電泳條帶，則為雌性;若顯示大小為474bp的一條電泳條帶，則為雄性。
[0018] 優(yōu)選地，S2所述樣品DNA通過樣品前處理獲得，所述樣品前處理是指:若選擇錯子 羽毛樣品，則收集羽毛，并與PBS緩沖液混合完成樣品的前處理;若選擇錯子血液樣品，則收 集血液，并與TE緩沖液、雙蒸水或者DMSO混合完后樣品的前處理。
[0019] 另外，發(fā)明人在研究中發(fā)現錯子羽毛毛囊中膽存有足夠性別鑒定所用的血液，運 使得原本耗時耗力的采血工作變得簡單，一個人就可W完成操作且不需要借助任何工具， 該方法的可操作性顯著增強，因此優(yōu)選地，所述血液包括靜脈血液和羽毛毛囊中的血液。
[0020] 優(yōu)選地，上述方法中，Sl所述PCR反應的體系為:2微升樣品DNA，10微升PCR反應液、 權利要求1所述引物IOyM各1微升，余量為雙蒸水，反應體系的總體積為20微升。
[0021] 與現有技術相比，本發(fā)明具有W下有益效果： 本發(fā)明通過設計多組引物，篩選出了中用于鑒別錯子性別的引物，所述引物的序列如 SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO: 2所示，該引物具有特異性好，分辨率高，擴增效果好等優(yōu)點，不 需進行酶切，直接進行瓊脂糖凝膠電泳。而且，相對于一條特異性產物，兩條特異性產物具 有更高的辨識度，使得擴增結果可W-眼就可W分辨出來;本發(fā)明還提供了利用所述引物 鑒別錯子性別的方法，該方法在利用上述引物特異性擴增的前提下，還能夠通過簡化樣品 DNA的獲得過程，縮短了鑒別錯子性別的時間成本和經濟成本，利用所述引物鑒別錯子性別 的方法具有廣泛的市場利用價值。
【附圖說明】
[0022] 圖1為利用引物CHD646擴增雄錯和雌錯的PCR結果，其中，M為Markera~12為雄錯 樣本，13~24為雌錯樣本。
[0023] 圖2為利用引物CHD520擴增雄錯和雌錯的PCR結果，其中，M為Markera~12為雄錯 樣本，13~24為雌錯樣本。
[0024] 圖3為利用引物CHD243擴增雄錯和雌錯的PCR結果，其中，M為Marker，1~12為雄錯 樣本，13~24為雌錯樣本。
[0025] 圖4為雄錯子和雌錯子在解剖學上的差異。
[0026] 圖5為不同裂解液處理樣品得到的PCR擴增結果，其中，M為Marker;泳道1~4，5~ 8,9~12，13~16，17~20分別是用雙蒸水、IXTE緩沖液、pH=8.0的PBS緩沖液、1%SDS溶 液、2.5M NaCl處理樣品得到的PCR擴增的產物。
[0027] 圖6為不同濃度TE緩沖液處理血液樣PCR擴增電泳結果;其中，M為Marker;泳道1~ 4,5~8,9 ~12，13~16，17~20,21~24分別是用0.25XTE，0.5XTE，1XTE，2XTE，4XTE，8 X TE緩沖液處理后PCR擴增的產物，圖中灰色框所示為擴增效果最好的處理組。
[0028] 圖7為不同濃度DMSO處理血液樣PCR擴增電泳結果，其中，M為Marker;泳道1~4,5 ~8,9~12，13~16，17~20,21~24分別是用0.25%、0.5%、1%、2%、4%、8%0150水溶液處理后 PCR擴增的產物，紅框中所示的為擴增效果最好的處理組。
[00巧]圖8為2%DMS0處理血液樣對雌錯DNA進行PCR擴增的結果(A)和2%DMS0處理血液樣 對雄錯DNA進行PCR擴增的結果(B)。
[0030] 圖9為PBS緩沖液作為裂解液處理羽毛樣PCR擴增電泳結果，其中，M為Marker;泳道 1~6，7~12分別是6羽雌錯和6羽雄錯的羽毛樣品經過1 X PBS處理后PCR擴增的產物。
[0031] 圖10為不同濃度的PBS緩沖液作為裂解液處理羽毛樣PCR擴增電泳結果，其中，M為 Marker;泳道1~4,5~8，9~12,13~16,17~20,21~24分別是4羽（2羽雌錯和2羽雄錯）的 羽毛樣品經過0.25 X PBS、0.5 X PBS、1 X PBS、2 X PBS、4 X PBS、8 X PBS 處理后PCR擴增的產 物。
[0032] 圖11為1 XPBS處理羽毛樣對雄錯DNA進行PCR擴增的結果。
[0033] 圖12為1 XPBS處理羽毛樣對雌錯DNA進行PCR擴增的結果。
[0034] 圖13為錯子羽毛毛囊中獲得的新鮮血液。
【具體實施方式】
[0035] 下面結合說明書附圖和具體實施例進一步說明本發(fā)明的內容，但不應理解為對本 發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實質的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的簡單 修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍；若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術 人員所熟知的常規(guī)手段。
[0036] 羽毛結構較為完整的錯子，一般是10日齡左右至成年錯子。從待測的錯子身上拔 下羽毛2~討良，必須具有毛囊結構，裝入無菌塑料封袋中待測，早期使用肝素鋼真空采血管 從錯子翅膀采集靜脈血樣品1~2毫升，后期我們發(fā)現乳錯羽毛毛囊中含有豐富的血液，也 可用作錯子性別鑒定血液樣樣品。
[0037] 實施例1引物設計和特異性實驗 靜脈血液樣處理方法:前期用移液器取血液5微升，按照1:30的體積比稀釋到含有血 液樣裂解液的A管中。
[0038] 羽毛毛囊中血液樣處理方法:將新采摘的羽毛沿毛羽向毛球按壓，可W收集10微 升甚至更多的新鮮血液，加入150微升血液樣裂解液。
[0039] 羽毛樣處理方法:將收集的羽毛沿根部剪下3~4毫米，置于含有150微升羽毛樣 裂解液的B管中，室溫放置2分鐘。
[0040] PCR擴增程序如下： (1)在PCR儀中按照預先設定好的程序，98°C加熱10分鐘，之后4°C冷卻十分鐘，將A管或 B管取出，1.2X 1〇4 g離屯、10分鐘。
[0041] (2)將A管或B管中的上清轉移至新PCR管中，取2微升作為PCR反應的模板，之后依 次加入10微升化rmix化qTM'、6微升的雙蒸水W及每一對上下游引物各1微升，總計20微升體 系(每一對上下游引物序列如表1所示）。
[0042] (3)將加好的體系放入PCR儀中按照如下程序進行反應:a. 94°C預變性，加熱5分 鐘;b. 94°C變性，加熱30秒;C. 53.5°C退火，反應30秒;d. 72°C延伸，反應30秒;之后從b到 d進行38個循環(huán);f. 72°C再延伸反應5分鐘，反應結束后跑瓊脂糖凝膠電泳，根據條帶數量 和大小進行結果判定。
[0043] CHD646合成的目的片段分別為CHD-Z和C皿-W，其長度分別為646bp和52化P，其PCR 擴增結果如圖1，從圖1中可W看出，無論是公錯樣品，還是母錯樣品均擴增出了兩條條帶， 且條帶長度相近，不能夠將不同性別的錯子區(qū)分開來，且引物中存在非特異性結合，即產生 了錯誤擴增，片段剛好為52化P左右。
[0044] CHD520合成的目的片段分別為CHD-Z和C皿-W，其長度分別為52化P和394bp，其PCR 擴增結果如圖2,從圖2中可W看出，該引物未能夠擴增出可W有效分辨錯子性別的條帶，只 在520bp處擴增到了條帶。說明該引物的特異性較差，上下游引物GC含量差異大導致退火溫 度等條件不一致，進而導致了擴增的失敗。
[0045] CHD243合成的目的片段為CHD-W，其長度為243bp，本引物設計的思路是根據CHDl 基因在ZW染色體上序列的不同，設計一條CHD-W特異的引物進行擴增，公錯擴增不出條帶， 母錯在243bp處有一條條帶，從而鑒定錯子性別。其PCR擴增結果如圖3,從圖3中可W看出， 未擴增出條帶的樣本不能直接進行判定，既有可能是公錯也有可能是未能有效擴增的母 錯。進一步實驗的結果表明，該引物在最適溫度下的擴增結果并不理想，運可能與引物本身 的特異性有關，其對低濃度質量較差的模板DM的擴增效率比較低，因此不適合作為錯子性 別鑒定的引物。
[0046] CHD457合成的目的片段分別為CHD-Z和C皿-W，其長度分別為457bp和308bp，其PCR 擴增結果表明：引物存在非特異性結合，即產生了錯誤擴增，且片段剛好為1000 bp左右，該 引物不能作為錯子性別鑒定的引物。
[0047] CHD474合成的目的片段分別為CHD-Z和C皿-W，其長度分別為474bp和319bp，其PCR 擴增結果表明：利用該引物PCR擴增雌錯樣品，可在瓊脂糖凝膠電泳上顯示兩條長度分別為 474bp與319bp的條帶，而雄錯只能擴增出一條長度為474bp的條帶，因此判斷出待測樣品的 性別;CHD474的上游引物和下游引物的序列分別為SEQ ID N0:1和SEQ ID N0:2。
[004引實施例2裂解液篩選實驗(血液樣） 樣品處理方法同實施例U運里選用了血液樣），PCR擴增程序如下： (1)在PCR儀中按照預先設定好的程序，98°C加熱10分鐘，之后4°C冷卻十分鐘，將A管或 B管取出，1.2X 104 g離屯、10分鐘。
[0049] (2)將A管或B管中的上清轉移至新PCR管中，取2微升作為PCR反應的模板，之后依 次加入10微升Permix化qTM'、6微升的雙蒸水W及上下游引物各1微升，總計20微升體系（上 下游引物序列如SEQ ID NO: 1和SEQ ID N0:2所示）。
[0050] 沈Q ID N0:l:5'-TTCTGAGGATGGAAATGAGT-3' 沈Q ID N0:2:5'-AGCAATGGTTACAACACTTC-3' (3 )將加好的體系放入PCR儀中按照如下程序進行反應:a. 94 °C預變性，加熱5分鐘;b. 94 °C變性，加熱30秒;C . 53.5 °C退火，反應30秒;d. 72 °C延伸，反應30秒;之后從b到d進行 38個循環(huán);f. 72°C再延伸反應5分鐘，反應結束后跑瓊脂糖凝膠電泳，根據條帶數量和大小 進行結果判定。
[0051] 我們通過解剖獲得了性別確定的雄錯子W及雌錯子樣品各30只。圖4示的是雄錯 子和雌錯子在解剖上的差異。
[0052] 本實施例分別用雙蒸水、1 XTE緩沖液、pH=8.0的PBS緩沖液、1%SDS溶液、2.5M 化Cl作為樣品裂解液，其擴增結果如圖5所示，結果表明：雙蒸水W及IXTE緩沖液處理的 PCR擴增電泳結果有清晰可辨的條帶，其他幾種溶液沒有擴增出明顯條帶；1 X TE緩沖液擴 增所得的溶液的條帶質量較雙蒸水處理好，所W選用TE緩沖液用作進一步試驗。
[0053] 接下來選擇0.25 X TE，0.5 X TE，1 X TE，2 X TE，4 X TE，8 X TE的緩沖液處理血液樣， 其擴增結果如圖6所示，結果表明IXTE緩沖液具有較好的實驗效果。
[0化4] 本實施例還嘗試用二甲基亞楓(DMSO)，結果如圖7所示，由此可知二甲基亞諷在從 0.25%到8%濃度條件下都能夠取得較理想的擴增效果，同時可W確定2%濃度的DMSO作為裂 解液最優(yōu)濃度，用2%濃度的DMSO作為裂解液，SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO:2作為引物，分別用 30只雄錯和雌錯驗證，結果如圖8和9。
[0055] 圖8A中，30只雌錯子的血液樣經2% DMSO處理的結果顯示，所有的樣品都擴增出了 清晰明顯的兩條條帶，與圖8B中30只雄錯子擴增出的一條條帶對比明顯，且條帶的長度均 符合預期，由此可W認為2% DMSO處理血液樣品PCR擴增進行性別鑒定的結果具有準確率百 分之百且重復性良好的特點。
[0056] 實施例3裂解液篩選實驗(羽毛樣） 錯子羽毛中富含蛋白成分，運給有效地擴增帶來很大的難度;我們前期摸索了多種羽 毛樣裂解液，其中，WPBS緩沖液作為羽毛樣裂解液具有很大的可行性，其擴增結果如圖9。
[0057]接下來實驗PBS緩沖液的濃度為擴增結果的影響，結果如圖10,最終確定IXPBS作 為錯子羽毛樣的裂解液。用IXPBS作為裂解液，SEQ ID NO: 1和SEQ ID N0:2作為引物，分別 用30只雄錯和雌錯驗證，結果如圖11和12。
[005引由圖11和圖12我們可W知道，使用IXPBS處理羽毛樣品之后經過PCR反應，瓊脂糖 凝膠電泳，可W擴增出分辨性別的條帶。不過，圖12中的部分樣品的電泳圖顯示有比較明顯 的拖帶，運可能是由于錯子羽毛中含有更復雜的成分，W及由于膽藏的時間過久，樣品有一 定程度上的變質。但是并不影響我們分辨待測樣品的性別。同理，在圖13中的母錯樣品中， 存在有部分未能擴增出474bp條帶的樣品，運是由于樣品的DNA濃度低，優(yōu)先擴增了較短的 片段。在實際操作中?？蒞直接認定擴增出319bp條帶的待測樣品即為雌性，故上述結果均 可W有效的鑒別錯子性別。
[0059] 實施例4試劑盒的組裝 所述用于鑒定錯子性別的試劑盒包含PCR反應液(如化rmix化qTM'）、裂解液1、裂解液2 W及SEQ ID N0:1和SEQ ID N0:2所述引物，其中，裂解液1為血液樣的裂解液(DMS0、1XTE 緩沖液或者雙蒸水），裂解液2為羽毛樣的裂解液(1 X PBS緩沖液）。
[0060] 所述試劑盒的PCR反應體系為：2微升裂解后的樣品作為PCR反應的模板，10微升 化MixhqTMi,6微升的雙蒸水W及SEQ ID NOa和沈Q ID N0:2所述引物IOiiM各1微升，總體 積為20微升。
[0061 ]所述裂解后的樣品通過W下方法得到的： 靜脈血液樣處理方法:前期用移液器取血液5微升，按照1:30的體積比稀釋到含有血 液樣裂解液的A管中。
[0062] 羽毛毛囊中血液樣處理方法:將新采摘的羽毛沿毛羽向毛球按壓，可W收集10微 升甚至更多的新鮮血液，加入150微升血液樣裂解液。
[0063] 羽毛樣處理方法:將收集的羽毛沿根部剪下3~4毫米，置于含有150微升羽毛樣 裂解液的B管中，室溫放置2分鐘。
[0064] 所述試劑盒的PCR反應條件為:a. 94°C預變性，加熱5分鐘;b. 94°C變性，加熱30 秒;C. 53.5°C退火，反應30秒;d. 72°C延伸，反應30秒;之后從b到d進行38個循環(huán);f. 72°C 再延伸反應5分鐘。
【主權項】
1. 一種用于鑒別鴿子性別的引物，其特征在于，所述引物的序列如SEQ ID N0:1和SEQ ID NO:2所示。2. 含有權利要求1所述引物的試劑盒。3. 根據權利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括PCR反應液、DNA提取 液。4. 根據權利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述DNA提取液為血液樣裂解液和羽毛 樣裂解液，其中，血液樣裂解液選自DMSO、TE緩沖液或者雙蒸水;所述羽毛樣裂解液為PBS緩 沖液。5. 權利要求1所述引物或者權利要求2所述試劑盒在鑒別鴿子性別中的應用。6. -種鑒別鴿子性別的PCR方法，其特征在于，包括以下步驟：51. 加入權利要求1所述引物，樣品DNA，PCR反應液進行PCR反應； 52. PCR反應后采用凝膠電泳分析電泳條帶大小，進行結果判定:若顯示大小分別為 474bp與319bp的兩條電泳條帶，則為雌性;若顯示大小為474bp的一條電泳條帶，則為雄性。7. 根據權利要求6所述的方法，其特征在于，S2所述樣品DNA通過樣品前處理獲得，所述 樣品前處理是指:若選擇鴿子羽毛樣品，則收集羽毛，并與PBS緩沖液混合完成樣品的前處 理;若選擇鴿子血液樣品，則收集血液，并與TE緩沖液、雙蒸水或者DMSO混合完后樣品的前 處理。8. 根據權利要求7所述的方法，其特征在于，所述血液包括靜脈血液和羽毛毛囊中的血 液。9. 根據權利要求6所述的方法，其特征在于，Sl所述PCR反應的體系為:2微升樣品DNA， 10微升PCR反應液、權利要求1所述引物1 ΟμΜ各1微升，余量為雙蒸水，反應體系的總體積為 20微升。
【文檔編號】C12N15/11GK105925690SQ201610320748
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2016年5月16日
【發(fā)明人】王修啟, 梁少杰, 陳明霞, 高春起, 嚴會超
【申請人】華南農業(yè)大學