專利名稱：一種核酸探針、含有該核酸探針的組合物及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及一種核酸探針，具體地，涉及一種用于檢測8號染色體數(shù)目的核酸探針。本發(fā)明還涉及含有該核酸探針的組合物、用于檢測8號染色體數(shù)目的檢測劑、用于檢測8號染色體數(shù)目的試劑盒、一種原位雜交方法、一種檢測8號染色體數(shù)目的方法、所述核酸探針在制備檢測8號染色體數(shù)目的試劑中的用途、以及所述核酸探針在制備檢測8號染色體數(shù)目異常相關(guān)疾病的試劑或輔助試劑中的用途。
背景技術(shù)：
研究發(fā)現(xiàn)，很多疾病都伴有8號染色體的數(shù)目異常，例如骨髓增生異常綜合征 (myelodysplastic syndromes, MDS)以及癌癥如急性白血病(acute leukemia, AL)、卵巢癌(ovarian carcinoma)、禾口前列腺癌(prostatic adenocarcinoma)等(FRANCESC SOLEA, et al. Incidence, characterization and prognostic significance of chromosomal abnormalities in 640 patients with primary myelodysplastic syndromes. British Journal of Haematology，2000，108，346-356 ；劉瓊等，伴復(fù)雜核型異常的髓系惡性血液病 8號染色體異常分析，中國實驗血液學(xué)雜志200816 (5) =993-996 ；姬宏飛等，應(yīng)用著絲粒探針檢測40例卵巢癌患者8號染色體數(shù)目的異常增多，國際遺傳學(xué)雜志，Dec 15，2007，Vol 30，No. 6 ；以及曾碹等，前列腺癌8號染色體改變與Gleason評分之間的相關(guān)性，中華病理學(xué)雜志，S印tember 2006, Vol 35，No. 9)。目前用于檢測8號染色體數(shù)目是否異常的方法有核型分析和熒光原位雜交 (FISH)等。核型分析的結(jié)果較為準(zhǔn)確，但是對操作人員的經(jīng)驗要求較高。因此，最好方法是熒光原位雜交，而8號染色體特異的著絲粒探針是該檢測成敗的關(guān)鍵。目前已有相關(guān)的檢測 8 號染色體的探針(Heinz-Ulrich G. ffeier, Hans-Dieter Kleine, and Joe W. Gray. Labeling of the centromeric region on human chromosome 8 by in situ hybridization [J], Hum Genet (1991) 87 :489-494.)，但是該探針實際上是包含多個序列的混合物，信號特異性并不理想。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明人經(jīng)過大量的實驗和不懈的努力，發(fā)現(xiàn)了一種信號強度高并且特異性高的核酸探針，可以有效地檢測人的8號染色體的數(shù)目，并且判讀8號染色體的數(shù)目是否異常。 由此提供了下述發(fā)明本發(fā)明的一個方面涉及一種核酸探針，其帶有可檢測的標(biāo)記，所述核酸探針的核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示。GCTGCAGATCACAAAGAAGTTTCTGAGAATGCTGCTGTCTAATTTTTACATGTAAGCCCGTTTCCAACG AAATCCTCAAAGCTATCCAAATATCCGCATGCAGAATCTTCAAAAAGAGTGTTCCAGAAGTACTGCATGAAACGAAA GGTTCAAGTCCGTTTGTTGAGGACACACATCACAAATAAGTTTCTCAGAATGCTTCTGTCTTGTTTTCATTGGAAGA TATTTCCTTTTTCACCATAGTTCAGAAAGCGCTCCAAATGTCCACTTCCAGATACTACAATAGGAGTGTTTCCAACC
3TGCTCTATGAAACGGAAGGTTCAACTCTGTGAGTTAAGCTTC(SEQ IDNO :1)本發(fā)明還涉及一種核酸探針，其核苷酸序列與上述的核酸探針的核苷酸序列(SEQ ID NO 1)互補，或者其核苷酸序列為選自如下的變體1)在高等嚴(yán)緊條件下與上述的核酸探針的核苷酸序列(SEQ ID N0:1)雜交的核苷酸序列，2)對上述的核酸探針的核苷酸序列進(jìn)行一個或多個堿基的取代、缺失、添加修飾的核苷酸序列，和3)與上述的核酸探針的核苷酸序列具有至少90%的序列同一性的核苷酸序列。典型地，“雜交條件”根據(jù)測量雜交時所用條件的“嚴(yán)緊性”程度來分類。嚴(yán)緊性程度可以以例如核酸結(jié)合復(fù)合物或探針的解鏈溫度(Tm)為依據(jù)。例如，“最大嚴(yán)緊性”典型地發(fā)生在約Tm-5°C (低于探針Tm 5°C )；“高等嚴(yán)緊性”發(fā)生在Tm以下約5_10°C；“中等嚴(yán)緊性”發(fā)生在探針Tm以下約10-20°C ；“低嚴(yán)緊性”發(fā)生在Tm以下約20_25°C。作為替代，或者進(jìn)一步地，雜交條件可以以雜交的鹽或離子強度條件和/或一或多次的嚴(yán)緊性洗滌為依據(jù)。例如，6XSSC=極低嚴(yán)緊性；3XS SC=低至中等嚴(yán)緊性；IXSSC =中等嚴(yán)緊性； 0. 5XSSC =高等嚴(yán)緊性。從功能上說，可以采用最大嚴(yán)緊性條件確定與雜交探針嚴(yán)緊同一或近嚴(yán)緊同一的核酸序列；而采用高等嚴(yán)緊性條件確定與該探針有約80%或更多序列同一性的核酸序列。對于要求高選擇性的應(yīng)用，典型地期望采用相對嚴(yán)緊的條件來形成雜交體，例如， 選擇相對低的鹽和/或高溫度條件。Sambrook等(Sambr00k，J.等(1989)分子克隆，實驗室手冊，Cold Spring Harbor Press, Plainview, N. Y.)提供了包括中等嚴(yán)緊性和高等嚴(yán)緊性在內(nèi)的雜交條件。為便于說明，用于檢測本發(fā)明的多核苷酸與其它多核苷酸雜交的合適的中度嚴(yán)緊條件包括用5SSC、0. 5% SDS、1. OmM EDTA(pH8. 0)溶液預(yù)洗；在50_65°C下在5SSC中雜交過夜；隨后用含0. SDS的2X、0. 5X和0. 2XSSC在65°C下各洗滌兩次20分鐘。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，能容易地操作雜交嚴(yán)緊性，如改變雜交溶液的含鹽量和/或雜交溫度。例如，在另一個實施方案中，合適的高度嚴(yán)緊雜交條件包括上述條件，不同之處在于雜交溫度升高到例如60-65°C或65-70°C。在本發(fā)明中，所述對SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列進(jìn)行一個或多個堿基的取代、 缺失、添加修飾的核苷酸序列，是指分別或同時在所述核苷酸序列的5’端和/或3’端，和 /或序列內(nèi)部進(jìn)行例如不超過2-45個，或者不超過2-30個，或者不超過3-20個，或者不超過4-15個，或者不超過5-10個，或者不超過6-8個的分別用逐個連續(xù)整數(shù)表示的堿基的取代、缺失、添加修飾。通過一種多核苷酸進(jìn)行說明，其所具有的核苷酸序列例如與SEQID NO 1的參考核苷酸序列至少具95%的“同一性”是指在SEQ IDNO 1的參考核苷酸序列之每100個核苷酸中，該多核苷酸的核苷酸序列除了含有多達(dá)5個核苷酸的不同外，該多核苷酸之核苷酸序列與參考序列相同。換句話說，為了獲得核苷酸序列與參考核苷酸序列至少95%相同的多核苷酸，參考序列中多達(dá)5%的核苷酸可被刪除或被另一核苷酸替代；或可將一些核苷酸插入?yún)⒖夹蛄兄?，其中插入的核苷酸可多達(dá)參考序列之總核苷酸的5% ；或在一些核苷酸中，存在刪除、插入和替換的組合，其中所述核苷酸多達(dá)參考序列之總核苷酸的5%。參考序列的這些突變可發(fā)生在參考核苷酸序列的5’或3’末端位置，或在這些末端位置之間的任意地方，它們或單獨散在于參考序列的核苷酸中，或以一個或多個鄰近的組存在于參考序列中。在本發(fā)明中，用于確定序列同一性和序列相似性百分?jǐn)?shù)的算法是例如BLAST和 BLAST 2.0 算法，它們分別描述在 Altschul 等(1977)Nucl. Acid. Res. 25 :3389-3402 和 Altschul等(1990) J. Mol. Biol. 215 :403_410。采用例如文獻(xiàn)中所述或者默認(rèn)參數(shù)，BLAST 和BLAST 2.0可以用于確定本發(fā)明的核苷酸序列同一性百分?jǐn)?shù)。執(zhí)行BLAST分析的軟件可以通過國立生物技術(shù)信息中心(NCBI)為公眾所獲得。在本發(fā)明中，所述與SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列具有至少90%的序列同一性的核苷酸序列包括與SEQ ID NO :1所公開序列基本同一的多核苷酸序列，例如當(dāng)采用本文所述方法(例如采用標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)的BLAST分析)時，與本發(fā)明多核苷酸序列相比含有至少 90%序列同一性、優(yōu)選至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%或更高的序列同一性的那些序列。本發(fā)明人經(jīng)過比對，發(fā)現(xiàn)8號染色體中存在與SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列具有高度序列同一性的序列，其高達(dá)95^^96%,97^^98%或99%。另外，由于人的個體之間的差異，不同個體之間的8號染色體中也存在與SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列具有一個和幾個堿基差異的情況，但是與SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列具有高度序列同一性的序列，其高達(dá)95 %、96 %、97 %、98 %或99 %。因此，這些序列也可以作為本發(fā)明的核酸探針的序列。本發(fā)明的核酸探針的核苷酸序列可以人工方法合成(化學(xué)合成DNA)，也可以設(shè)計特異性引物通過PCR擴增的方法制備，例如可以參考實施例1中的方法制備。本發(fā)明的核酸探針帶有可檢測的標(biāo)記，具體地，為熒光標(biāo)記，包括但不限于，例如四甲基羅丹明 CTetramthylrhodamine-5-dUTP)、異硫氰酸(FITC)、DEAC、TAMRA、Cy3，等等。 所述標(biāo)記可以根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)進(jìn)行，例如采用切口平移法、隨機引物法等。 本發(fā)明的另一方面涉及一種組合物，其含有本發(fā)明的核酸探針。本發(fā)明的還一方面涉及一種用于檢測8號染色體數(shù)目的檢測劑，其含有本發(fā)明的核酸探針。本發(fā)明的還一方面涉及一種用于檢測8號染色體數(shù)目的試劑盒，其含有本發(fā)明的核酸探針。具體地，所述試劑盒以10人份計，包括如下組分核酸探針7 μ 1Human cot-lDNA5 μ 1鮭魚精DNA2 μ 1TE 工作液6 μ 1。其中，核酸探針的濃度可以是0.1yg/yl。本發(fā)明的還一方面涉及一種原位雜交方法，包括使用本發(fā)明的核酸探針的步驟； 具體地，所述原位雜交為熒光原位雜交(FISH)。本發(fā)明的還一方面涉及一種檢測8號染色體數(shù)目的方法，包括使用本發(fā)明的核酸探針的步驟。例如使用熒光原位雜交。本發(fā)明的探針的序列位于8號染色體的著絲粒區(qū)域， 因此，根據(jù)觀察到單個細(xì)胞中的信號的數(shù)目，即為8號染色體的數(shù)目。如果信號數(shù)目是2，8號染色體數(shù)目正常；否則判斷為異常。所述信號為可檢測的標(biāo)記產(chǎn)生的信號，包括但不限于熒光信號。本發(fā)明的還一方面涉及本發(fā)明的核酸探針在制備檢測8號染色體數(shù)目的試劑中的用途。本發(fā)明的還一方面涉及本發(fā)明的核酸探針在制備檢測8號染色體數(shù)目異常相關(guān)疾病的試劑或輔助試劑中的用途；具體地，所述8號染色體數(shù)目異常相關(guān)疾病為癌癥或骨髓增生異常綜合征；更具體地，所述癌癥為急性白血病、卵巢癌、或前列腺癌。由于上述病癥的發(fā)生通常伴隨著8號染色體數(shù)目的異常(FRANCESC S0LEA, et al. Incidence, characterization and prognostic significance of chromosomal abnormalities in 640patients with primary myelodysplastic syndromes. British Journal of Haematology, 2000,108, 346-356 ；劉瓊等，伴復(fù)雜核型異常的髓系惡性血液病8號染色體異常分析，中國實驗血液學(xué)雜志200816(5) =993-996 ；姬宏飛等，應(yīng)用著絲粒探針檢測40例卵巢癌患者8號染色體數(shù)目的異常增多，國際遺傳學(xué)雜志，Dec 15,2007, Vol30, No. 6 ；以及曾碹等，前列腺癌8號染色體改變與Gleason評分之間的相關(guān)性，中華病理學(xué)雜志，S^tember 2006，Vol 35，No. 9)，因此，本發(fā)明的核酸探針可以用于制備檢測癌癥的輔助試劑。在本發(fā)明中，所述8號染色體為人的8號染色體。發(fā)明的有益效果本發(fā)明的核酸探針信號強度高，并且特異性高。


圖1 :D0P-PCR擴增8號染色體產(chǎn)物的凝膠電泳圖(兩個平行的樣品)。圖2 :PCR擴增8號染色體α -衛(wèi)星DNA產(chǎn)物的凝膠電泳圖(兩個平行的樣品)。圖3 =TA克隆菌落的PCR產(chǎn)物的凝膠電泳圖(5個平行的樣品)。圖4 陽性克隆標(biāo)記探針的凝膠電泳圖G個平行的樣品)。圖5 實施例1制備的核酸探針1進(jìn)行FISH檢測正常人外周血培養(yǎng)的淋巴細(xì)胞樣本的結(jié)果(10X100)。圖6:對照探針1進(jìn)行FISH檢測正常人外周血培養(yǎng)的淋巴細(xì)胞樣本的結(jié)果 (10X100)。圖7:對照探針2進(jìn)行FISH檢測正常人外周血培養(yǎng)的淋巴細(xì)胞樣本的結(jié)果 (10X100)。圖8 實施例1制備的核酸探針1進(jìn)行FISH檢測骨髓增生異常綜合征患者骨髓樣本的結(jié)果(8號染色體數(shù)目異常)(10 X 100)，其中CSP8表示實施例1制備的探針或者該探針的信號。
具體實施例方式下面將結(jié)合實施例對本發(fā)明的實施方案進(jìn)行詳細(xì)描述。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解，下面的實施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體技術(shù)或條件者，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件(例如參考J.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯的《分子克隆實驗指南》，第三版，科學(xué)出版社)或者按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。實施例1 本發(fā)明核酸探針樣品1的制備試劑和材料TaKaRa Taq Hot Start Version,DNase I,DNA polymerase I 均購自大連TaKaRa 公司；FITC-dUTP 購自 Roche ；Human Cot-IDNA 購自 Invitrogen ；QIAprep Spin Miniprep Kit 購自 QIAGEN。實驗方法1.探針序列的獲得 1) DOP-PCR 擴增 8 號染色體 DNA以正常人的8號染色體DNA (顯微切割)為模板，D0P-PCR擴增8號染色體DNA，所用簡并引物的序列如下5-CCGACTCGAGNNNNNNATGTGG-3 (SEQ ID NO 2) (TaKaRa 公司合成)，其中 N 表示隨機地選自ATCG四種堿基。反應(yīng)體系如下H2O30. 5 μ 1PCR Buffer5 μ 1Mg2+4 μ 1dNTP-mix4 μ 1簡并引物4μ1模板 DNA2 μ 1Taq Hot Start(TaKaRa)0. 5 μ 1總體積50 μ 1反應(yīng)條件如下預(yù)變性96°C3' 00〃變性94°C 1' 00〃退火30°C 1' 30〃以14°C /min的速度升溫至延伸72°C 延伸 2' 00〃以上程序運行10個循環(huán)變性94°C 1' 00〃退火56°C 1' 00〃延伸72°C2' 00〃以上程序運行20個循環(huán)最后延伸72°C5' 00〃也可以參考，例如Fiegler H, et al. DNA microarrays for comparative genomic hybridization based on D0P—PCR amplification of BAC and PAC clones.Genes Chromosomes Cancer. 2003Apr ；36 (4) :361_74。
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DOP-PCR結(jié)束后取2 μ 1產(chǎn)物，用1 %瓊脂糖膠電泳檢測，檢測結(jié)果如圖1所示，片段大小在2000bp-100bp之間。2) PCR擴增8號染色體著絲粒α -衛(wèi)星DNA以步驟1)中的DOP-PCR擴增產(chǎn)物為模板，PCR擴增8號染色體著絲粒α -衛(wèi)星 DNA，做兩個平行，所用引物為特異性引物，如下primerl 5-GAAGCTTAACTCACAGAGTTGAA-3 (SEQ ID NO 3) (TaKaRa 公司合成)，以及primer2 5-GCTGCAGATCCCAAAGAAGTTTC-3 (SEQ ID NO 4) (TaKaRa 公司合成)反應(yīng)體系如下H2O31. 5μ 1PCR Buffer5 μ 1Mg2+3 μ 1dNTP-mix4 μ 1primerl2 μ 1primer22 μ 1模板 DNA2 μ 1Taq Hot Start (TaKaRa) 0. 5 μ 1總體積50 μ 1反應(yīng)條件如下預(yù)變性96°C3' 00〃變性94°C 1' 00〃退火45°C 1' 00〃延伸72°C2' 00〃以上程序運行30個循環(huán)最后延伸72°C7' 00〃也可以參考，例如，Heinz-Ulrich G. ffeier, et al. Labeling of the centromeric region on human chromosome 8 by in situ hybridization. Hum Genet (1991)87 489-494。PCR結(jié)束后取2μ 1產(chǎn)物，用瓊脂糖膠電泳檢測，結(jié)果如圖2所示，產(chǎn)物主要是 α-衛(wèi)星DNA的單拷貝(171bp)和雙拷貝(342bp)，本發(fā)明人選擇雙拷貝做為探針序列。3)8號染色體著絲粒α-衛(wèi)星DNA構(gòu)建TA克隆回收步驟2)中PCR產(chǎn)物中的電泳大約為342bp的片段，插入pMD 20_T Vector (TaKaRa)中，并轉(zhuǎn)化入 Ε. coli Competent Cells JM109 (TaKaRa)中，藍(lán)白斑篩選陽性克隆，選取5個白色菌落PCR鑒定陽性克隆，反應(yīng)體系如下H2O15. 6μ 1PCR Buffer2. 5 μ 1Mg2+1. 5μ 1dNTP-mix2μ 1primerl1 μ 1
primer21 μ 1菌落1 μ 1Taq Hot Start(TaKaRa) 0. 4 μ 1總體積25 μ 1反應(yīng)條件如下預(yù)變性96°C3' 00〃變性94°C 1' 00〃退火45°C 1' 00〃延伸72°C2' 00〃以上程序運行30個循環(huán)最后延伸72°C7' 00〃PCR結(jié)束后取2μ 1產(chǎn)物，用瓊脂糖膠電泳檢測，結(jié)果如圖3所示，產(chǎn)物主要是 α-衛(wèi)星DNA的雙拷貝，說明載體構(gòu)建成功。并且經(jīng)測序證明，核酸探針的序列與SEQ ID
NO 1完全一致。4)篩選陽性克隆并切口平移直標(biāo)法進(jìn)行探針標(biāo)記篩選的陽性克隆進(jìn)一步培養(yǎng)提取質(zhì)粒DNA，并用切口平移直標(biāo)法進(jìn)行探針標(biāo)記，成品探針的制備包括了探針標(biāo)記、探針純化、探針混合三個步驟。例如，可以參考《熒光原位雜交技術(shù)》，Barbara Beatty等著，王瑛主譯，天津科技翻譯出版公司，2003，也可以參考下面的步驟2.探針標(biāo)記1)從冰箱中取出lOXbuffer、dNTP工作液、DNA、熒光素工作液置于冰盒上待用。2)DNase I工作液的配制現(xiàn)配現(xiàn)用。用ddH20稀釋DNase I 1000倍待用，注意要在冰盒上操作，以防DNase I失活。3)向每個1. 5ml EP管中依次加入以下試劑(冰盒中操作、避光)標(biāo)記體系如下標(biāo)記反應(yīng)體系組成用量IOXbuffer20 μ 1dNTP 工作液20 μ 1陽性克隆DNA4μ gDNase I 工作液(1 1000) 10 μ 1DNA Poly I40UFITC 工作液8μ1dd H2O補足至 200 μ 1Total200 μ 1充分混勻、離心，置于生化培養(yǎng)箱中的VSN-5搖床上，打開搖床，轉(zhuǎn)速調(diào)至3檔，培養(yǎng)溫度為15 士 1°C，反應(yīng)2小時。2小時后拿出EP管，加入8μ 1 EDTA工作液終止反應(yīng)，混勻。4)陽性克隆質(zhì)粒切口平移直標(biāo)法進(jìn)行探針標(biāo)記，做了 4個平行，標(biāo)記產(chǎn)物電泳結(jié)果如圖(圖4)，片段大小在1000bp-250bp之間。
3.探針純化用NucleoSpin Extract II試劑盒(MN)純化，純化方法如下1)探針混合標(biāo)記探針取600 μ 1體系純化。2)在混合好的探針中加入2倍體積NT和ddH20混合液(NT ddH20 =1 3)， 充分混勻。3)將樣品轉(zhuǎn)移入純化柱中，IlOOOg離心lmin，棄廢液。4)在純化柱中加入600 μ 1的ΝΤ3(乙醇稀釋后的)，IlOOOg離心lmin，棄廢液。5) IlOOOg繼續(xù)空轉(zhuǎn)2min，除去管壁上剩余的液體及純化柱中剩余的酒精。6)室溫敞口放置5min，進(jìn)一步使殘留的酒精揮發(fā)。7)將純化柱置于新的1. 5mLEP管中，探針加入100μ 1NE，IlOOOg離心lmin。由此制得核酸探針樣品1。實施例2 含有核酸探針樣品1的檢測劑1的制備按照下面的比例(以10人份為例)配制探針混和液，即得到檢測劑1，其含有實施例1制備的核酸探針樣品1。檢測劑1各組分各組分體積核酸探針樣品17 μ 1Humancot-IDNA5μ 1鮭魚精DNA2μ 1TE 工作液6μ 1合計20 μ 1(10 人份)核酸探針樣品1的濃度并不特別限定，例如為0. 1 μ g/μ 1。盡管上面按照10人份對各組分的體積給出了具體的數(shù)值，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，各組分的體積主要滿足上面的比例就可以。也可以照此配制1人份、多人份的檢測劑。為了實驗操作的簡便和表述的簡潔清楚，下面的實施例5和實施例7中，如果沒有特別說明，所用探針均為按照實施例2制得的檢測劑1。實施例3 對照探針1和對照探針2的制備按照與實施例1中類似的方法制備對照探針1，除了在探針序列的獲得的步驟2) 中，選用α-衛(wèi)星DNA的單拷貝(171bp)為探針序列。按照背景技術(shù)中的文獻(xiàn)中的方法制備對照探針2 (實際上是多種序列的混合物)。實施例4 正常人外周血培養(yǎng)的淋巴細(xì)胞樣本的制備1.試劑秋水仙堿、培養(yǎng)基、低滲液、冰醋酸、100 %乙醇。2.實驗操作(1)將72小時內(nèi)采集的人外周血，用注射針直接穿過培養(yǎng)瓶的橡膠塞，向培養(yǎng)基中注入30-40滴，輕搖勻后置37°C恒溫箱培養(yǎng)；(2)培養(yǎng)時間為70士2小時。培養(yǎng)期間，定期輕搖勻，使細(xì)胞充分接觸培養(yǎng)基；(3)終止培養(yǎng)前2-4小時，在培養(yǎng)液中加入秋水仙堿(用5ml注射器加四滴，使終濃度為 0. 07-0. 08 μ g/ml)；
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(4)將培養(yǎng)物完全轉(zhuǎn)入清潔的離心管中，以IOOOrpm離心8分鐘，棄上清液；(5)向刻度離心管中加入預(yù)溫的37°C的低滲液5ml，用滴管混勻，置37°C恒溫水浴中低滲30分鐘。溫度計需要定期校正；(6)低滲后加入1毫升固定液，輕輕混勻后IOOOrpm離心8分鐘；(7)棄上清，加入細(xì)1固定液，輕輕混勻，在4°C冰箱靜置20分鐘，IOOOrpm離心8 分鐘，棄上清液；(8)重復(fù)步驟(7) —遍；(9)棄上清液后，視細(xì)胞數(shù)量多少加入適量固定液制成細(xì)胞(正常人外周血培養(yǎng)的淋巴細(xì)胞)懸液；(10)吸取細(xì)胞懸液自70-80cm高滴在一張干燥清潔的載波片上，吹干；(11)低倍鏡下尋找分散良好，染色適中的分裂相，油鏡下觀察染色體形態(tài)；(12) 56°C烤片半小時，室溫下放置2天。_20°C保存?zhèn)溆茫蝗绱酥频谜Ｈ送庵苎囵B(yǎng)的淋巴細(xì)胞樣本。實施例5 使用檢測劑1進(jìn)行熒光原位雜交檢測正常人外周血培養(yǎng)的淋巴細(xì)胞樣本使用實施例2中制備的檢測劑1和實施例4制備的正常人外周血培養(yǎng)的淋巴細(xì)胞樣本進(jìn)行熒光原位雜交(FISH)。步驟包括變性雜交、玻片洗滌、復(fù)染三個步驟。其中變性雜交有甲酰胺變性雜交和雜交儀變性雜交兩種方法。前者是樣本和探針分別變性，后者是用雜交儀對樣本和探針進(jìn)行共變性，減少了人為因素的影響。具體地，可以參考下面的步驟一、標(biāo)本準(zhǔn)備及變性注意使用前將盛有變性液的容器置于73°C 士 1°C水浴箱中約30分鐘，使溶液達(dá)到所需溫度。1.將玻片在73°C 士 1°C的變性液中浸泡5分鐘。注意考普林瓶中最多可同時浸入4張玻片。2.將玻片依次置于預(yù)冷的70%乙醇、85%乙醇和100%乙醇中各3分鐘進(jìn)行梯度脫水。玻片自然干燥后，可置于45-50°C烤片機上預(yù)熱2-5分鐘后與探針雜交。若以下探針混合物尚未完成變性，玻片可置于45-50°C烤片機上較長時間預(yù)熱。二、檢測劑1準(zhǔn)備及變性1.室溫下將如下液體加入到微量離心管中
名稱體積(μ )雜交緩沖液 7.0去離子水1.0檢測劑12.0Σ10. 02.離心 1-3 秒。3.渦旋混勻后再次短暫離心。4.將裝有以上探針混合物的試管置于73士 1°C水浴箱中變性5分鐘之后，將該試管置于45-50°C水浴箱中，雜交前取出。
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三、探針與樣本雜交1.將10 μ 1變性后的探針混合物滴于玻片雜交區(qū)域，立即加蓋蓋玻片，用橡皮膠封邊。2.避免蓋玻片與玻片之間產(chǎn)生氣泡。3.將玻片置于預(yù)熱的濕盒中，42 °C保溫箱中過夜雜交。注意將浸濕的紙巾置于密封容器中，制備濕盒。*使用雜交儀變性雜交(可選擇方法)(1)探針配制。室溫下將如下液體加入到微量離心管中。名稱體積(μ )雜交緩沖液 7. 0去離子水1. 0檢測劑12. 0Σ10. 0(2)離心1-3秒，渦旋混勻后再次短暫離心。(3)將10μ 1探針混合物滴直接加到經(jīng)過預(yù)處理玻片的雜交區(qū)域，立即加蓋蓋玻片，用橡皮膠封邊。(4)準(zhǔn)備雜交儀器，共變性條件83°C _85°C，5分鐘，雜交條件42°C，16小時。特別說明42°C過夜雜交可在雜交儀中進(jìn)行，也可在共變性之后將玻片置于濕盒中，于42°C恒溫孵箱中過夜雜交。注意將浸濕的紗布置于密封容器中，制備濕盒。四、玻片洗滌雜交后洗滌包括一系列不同濃度、不同溫度的鹽溶液的漂洗，由于有非特異性的探針片段的結(jié)合會增強背景，需要通過雜交后洗滌降低背景。雜交后洗滌有慢洗和快洗兩種方法，前者用時大約50分鐘，后者約5分鐘。1.慢速洗滌方案試劑:50%甲酰胺/2XSSC(3 瓶)，2XSSC，0. 1% NP-40/2XSSC，70% 乙醇。洗滌步驟注使用前將除70%乙醇外的溶液置于46士 1°C水浴箱中至少30分鐘，使溶液達(dá)到所需溫度。(1)移去蓋玻片，立即將玻片置于3瓶50%甲酰胺/2X SSC溶液中各漂洗10分鐘， 振蕩1-3秒；將玻片置于2XSSC中，漂洗10分鐘，振蕩1-3秒；(2)將玻片置于0. 1 % NP-40/2XSSC中，漂洗5分鐘，振蕩1-3秒；(3)將玻片室溫浸泡在70%乙醇中，漂洗3分鐘。2.快速洗滌方案試劑0.3% NP-40/0. 4X SSC, 0. 1% NP-40/2X SSC，70% 乙醇。洗滌程序(1)移去蓋玻片，將玻片置于0.3% NP-40/0. 4X SSC溶液中，振蕩1-3秒，漂洗2 分鐘；(2)特別說明快速洗滌方案中0. 3% NP-40/0. 4X SSC洗滌液的溫度和時間需要根據(jù)樣本差異進(jìn)行調(diào)節(jié)，73 士 1 °C使推薦的使用溫度。(3)室溫下將玻片置于0. 1 % NP-40/2 X SSC洗滌液中，振蕩1_3秒，漂洗30秒；(4)室溫下將玻片置于70%乙醇中，漂洗3分鐘。(五)檢測(1)暗處自然干燥玻片。(2)將15μ1 DAPI復(fù)染劑滴加于雜交區(qū)域位置，立即蓋上蓋玻片。暗處放置10-20 分鐘后，在熒光顯微鏡下選用合適的濾光片組觀察玻片。五·實驗結(jié)果結(jié)果如圖5所示。結(jié)果顯示單個間期細(xì)胞中可以觀測到2個綠色信號，單個中期分裂相中可以看到2個8號染色體著絲粒顯示綠色信號。結(jié)果說明樣本的8號染色體數(shù)目正常。結(jié)果顯示信號強并且沒有交叉，因此該探針的信號強度和特異性都很好。實施例6 使用對照探針1進(jìn)行熒光原位雜交實驗操作步驟與實施例5中類似，除了所用探針為實施例3中制備的對照探針1。結(jié)果如圖6所示。結(jié)果顯示肉眼觀察不到綠色信號。結(jié)果說明肉眼觀察不到綠色信號，因此該探針無法使用。實施例7 使用對照探針2進(jìn)行熒光原位雜交實驗操作步驟與實施例5中類似，除了所用探針為實施例3中制備的對照探針2。結(jié)果如圖7所示。結(jié)果顯示單個間期細(xì)胞中可以觀測到2個綠色主信號以及多個特異性交叉的較弱的綠色信號，單個中期分裂相中可以看到2個8號染色體著絲粒顯示綠色信號，但其他染色體著絲粒區(qū)可有較弱的綠色信號。結(jié)果說明樣本的8號染色體數(shù)目正常。結(jié)果顯示主信號強，但有輕微的特異性交叉。實施例8 使用檢測劑1進(jìn)行熒光原位雜交檢測骨髓增生異常綜合征患者骨髓樣本使用實施例2制備的檢測劑1，實驗操作步驟與實施例5中類似，除了所用樣本為骨髓增生異常綜合征患者骨髓樣本(北大人民醫(yī)院提供)，并且該樣本處理不需要細(xì)胞培養(yǎng)做中期染色體。所用樣本實驗前已經(jīng)通過核型分析，確認(rèn)其8號染色體為3體。結(jié)果如圖8所示。結(jié)果顯示單個間期細(xì)胞中可以觀測到3個綠色信號。注由于實驗中同時加有含有檢測其它染色體的探針，所以還有2各紅色的信號， 不影響本實施例的結(jié)果。結(jié)果說明樣本的8號染色體數(shù)目異常，出現(xiàn)8號染色體3體。與核型分析的結(jié)果一致。并且結(jié)果顯示信號強并且沒有交叉，因此該探針的信號強度和特異性都很好。盡管本發(fā)明的具體實施方式
已經(jīng)得到詳細(xì)的描述，本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解。根據(jù)已經(jīng)公開的所有教導(dǎo)，可以對那些細(xì)節(jié)進(jìn)行各種修改和替換，這些改變均在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。本發(fā)明的全部范圍由所附權(quán)利要求及其任何等同物給出。
權(quán)利要求
1.一種核酸探針，其帶有可檢測的標(biāo)記，其特征在于，所述核酸探針的核苷酸序列如 SEQ ID NO :1所示，或者其核苷酸序列與SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列互補，或者其核苷酸序列為選自如下的變體1)在高等嚴(yán)緊條件下與SEQID NO :1所示的核苷酸序列雜交的核苷酸序列，2)對SEQID NO :1所示的核苷酸序列進(jìn)行一個或多個堿基的取代、缺失、添加修飾的核苷酸序列，和3)與SEQID NO :1所示的核苷酸序列具有至少90%的序列同一性的核苷酸序列。
2.一種組合物，其含有權(quán)利要求1所述的核酸探針。
3.一種用于檢測8號染色體數(shù)目的檢測劑，其含有權(quán)利要求1所述的核酸探針。
4.一種用于檢測8號染色體數(shù)目的試劑盒，其含有權(quán)利要求1所述的核酸探針。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，以10人份計，包括如下組分 核酸探針7 μ 1Human cot-1 DNA 5 μ 1 鮭魚精DNA2 μ 1TE工作液6 μ 1ο
6.一種原位雜交方法，包括使用權(quán)利要求1所述的核酸探針的步驟。
7.—種檢測8號染色體數(shù)目的方法，包括使用權(quán)利要求1所述的核酸探針的步驟。
8.權(quán)利要求1所述的核酸探針在制備檢測8號染色體數(shù)目的試劑中的用途。
9.權(quán)利要求1所述的核酸探針在制備檢測8號染色體數(shù)目異常相關(guān)疾病的試劑或輔助試劑中的用途。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的用途，其中，所述8號染色體數(shù)目異常相關(guān)疾病為癌癥或骨髓增生異常綜合征；具體地，所述癌癥為急性白血病、卵巢癌、或前列腺癌。
全文摘要
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及一種核酸探針、含有該核酸探針的組合物及其用途。具體而言，涉及一種用于檢測8號染色體數(shù)目的核酸探針；該核酸探針的核苷酸序列可以為SEQ ID NO1或者其互補序列或者其具有序列同一性的變體。本發(fā)明還涉及用于檢測8號染色體數(shù)目的檢測劑、用于檢測8號染色體數(shù)目的試劑盒、一種原位雜交方法、一種檢測8號染色體數(shù)目的方法、所述核酸探針在制備檢測8號染色體數(shù)目的試劑中的用途、以及所述核酸探針在制備檢測8號染色體數(shù)目異常相關(guān)疾病的試劑或輔助試劑中的用途。本發(fā)明的核酸探針信號強度高，并且特異性高。
文檔編號C12Q1/68GK102465123SQ20101053187
公開日2012年5月23日 申請日期2010年11月4日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月4日
發(fā)明者吳曉東, 張益清, 陰層層, 陳忠 申請人:北京金菩嘉醫(yī)療科技有限公司