專利名稱：一種以細(xì)菌纖維素小球/膜塊為載體制備固定化酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬固定化酶技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種以細(xì)菌纖維素小球/膜塊為載體制 備固定化酶的方法。
背景技術(shù)：
由于酶具有較好的底物專一性，在許多領(lǐng)域具有重要應(yīng)用價(jià)值。但游離的酶蛋白 在實(shí)際應(yīng)用過程中易受環(huán)境條件影響而變性失活，且不易從反應(yīng)體系中分離以實(shí)現(xiàn)重復(fù)使 用的目的，這在一定程度上限制了酶的工業(yè)化應(yīng)用。酶固定化技術(shù)是實(shí)現(xiàn)酶重復(fù)連續(xù)使用 和改善其穩(wěn)定性的有效手段。目前酶的固定化載體主要包括無機(jī)載體材料(如二氧化硅、 活性炭、多孔性玻璃等)、有機(jī)合成高分子材料(如聚丙烯酰胺、聚乙烯、聚苯乙烯、聚氨酯 等)和天然高分子材料(如結(jié)構(gòu)性蛋白，殼聚糖，海藻酸鈉等)，但尚無利用細(xì)菌纖維素小 球?yàn)檩d體來固定化酶的報(bào)道。現(xiàn)有的固定化酶技術(shù)主要有5種(1)微囊法該法是利用半 透膜能阻止大分子的酶從膠囊中擴(kuò)散出去，而小分子反應(yīng)物和產(chǎn)物能自由擴(kuò)散的特性來實(shí) 現(xiàn)的；(2)惰性載體吸附法酶可以通過范德華力，氫鍵，疏水作用，靜電相互作用等吸附到 不溶性支持物上，從而達(dá)到固定化的目的；(3)共價(jià)交聯(lián)法利用雙功能試劑可以使分子與 分子交聯(lián)起來而形成大分子顆粒，從而實(shí)現(xiàn)酶的固定化；(4)膠格物理包埋法該包埋是通 過成膠物質(zhì)在酶的水溶液中聚合而實(shí)現(xiàn)的，最常用的是聚丙烯酰胺膠，其它還有淀粉膠等； (5)與水不溶性載體共價(jià)結(jié)合法根據(jù)酶和載體本身的理化性質(zhì)，通過共價(jià)偶聯(lián)使酶和載 體產(chǎn)生共價(jià)結(jié)合。細(xì)菌纖維素(bacterial cellulose, BC)是一種由微生物合成的高純度胞外生物 纖維。細(xì)菌纖維素的初級結(jié)構(gòu)與植物纖維素相似，由吡喃葡萄糖單體以β_1，4糖苷鍵連接 而成的直鏈多糖，但是BC的纖維結(jié)構(gòu)卻與植物纖維大不相同。BC由微纖維絲組成，這種微 纖維絲呈帶狀，其厚度為0. 1 μ m左右，比植物纖維的厚度(10 μ m)小兩個(gè)數(shù)量級。此外，這 種微纖維絲具有明顯的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。由于BC微結(jié)構(gòu)的特性，它具有許多獨(dú)特的性質(zhì)，例如良 好的機(jī)械強(qiáng)度，超細(xì)納米纖維網(wǎng)絡(luò)，生物可降解性，較大的比表面積、導(dǎo)電性和高的結(jié)晶度 等特性。近幾年，有研究報(bào)道利用化學(xué)改性后的細(xì)菌纖維素膜為載體用于微生物細(xì)胞的固 定化，其固定化后的微生物細(xì)胞對孔雀石綠染料的降解效果良好，在培養(yǎng)液初始PH值和染 料初始濃度不變的情況下仍能保持穩(wěn)定的脫色率。細(xì)菌纖維素作為一種新型的納米纖維生 物材料，已經(jīng)成為國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。細(xì)菌纖維素具有納米纖維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，因此該纖維材料 具有非常高的比表面和數(shù)量眾多的空隙結(jié)構(gòu)，有利于吸附和包容酶蛋白。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種以細(xì)菌纖維素小球/膜塊為載體制備固 定化酶的方法，具有工藝簡便，可操作性強(qiáng)，酶活損失小等優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明提供一種以球形細(xì)菌纖維素為載體制備固定化酶的方法，包括(1)細(xì)菌纖維素小球的制備
將活化的斜面菌種接入pH4. 8 5. 2的種子培養(yǎng)基，在25 30°C、100 200rpm 條件下培養(yǎng)12 16h制得液體種子，以體積百分比為4 10%接種量將液體種子轉(zhuǎn)接至 PH4. 8 5. 2的發(fā) 酵培養(yǎng)基中，每500mL錐形瓶中含有200 300mL發(fā)酵培養(yǎng)液，25 30°C， 80 200rpm條件下培養(yǎng)48 96h，傾濾，得細(xì)菌纖維素小球；(2)細(xì)菌纖維素小球的處理將發(fā)酵收集得到的細(xì)菌纖維素小球用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 1 %的NaOH在80 90°C水浴 中處理30 120min，用去離子水漂洗3 5次，收集，用體積分?jǐn)?shù)為0. 的醋酸中和小球 內(nèi)殘留的堿液，靜置12 24h，用去離子水漂洗2 3次，在水中保持其球狀形態(tài)，將小球取 出，吸干表面水分，在液氮中速凍或在低溫冰箱里冷凍，然后在冷凍干燥機(jī)中干燥后獲得白 色纖維素小球；(3)細(xì)菌纖維素小球固定化酶的制備以細(xì)菌纖維素小球?yàn)檩d體采用物理吸附法或吸附 交聯(lián)法制備固定化酶。所述步驟(1)中的菌種選自醋桿菌(Acetobacter sp.)、木醋桿菌(A. xylinum)、 產(chǎn)醋醋桿菌(A. acetigenum)、醋化桿菌(紋膜醋酸菌，A. aceti)、許氏醋酸菌 (A. schutzenbachii)、惡臭醋酸菌(A. ranees)、奧爾蘭醋桿菌(A. orleanense)、彎醋桿 菌(A. curvum)、巴氏醋桿菌(Acetobacter pasteurianus)、葡萄糖桿菌(Gluconobacter sp.)、葡萄糖氧化桿菌(Gluconobacter oxydans)、農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)、 根瘤菌(Rhizobium trifolii)、洋蔥假單胞菌(Seudomonas c印acia)、八疊球菌(Sarcina ventriculi)、椰毒假單胞菌(P. cocovenenans)、空腸彎曲菌(Campylobacter jejuni)中 的一種或幾種。所述步驟(1)中的種子培養(yǎng)基，按重量百分比，包含葡萄糖2. 0%，酵母粉0. 5%, 胰蛋白胨 0. 5%, Na2HPO4 · 12Η20 0. 27%，檸檬酸 0. 115%。所述步驟(1)中的發(fā)酵培養(yǎng)基，按重量百分比，包含葡萄糖2. 0%，酵母粉0. 5%, 胰蛋白胨 0. 3%, Na2HPO4 · 12Η20 0. 27%，檸檬酸 0. 115%。所述步驟(3)中物理吸附法，包括5 IOml的100 5000U/L酶液中加入細(xì)菌 纖維素小球0. 05 0. 4g并使其浸沒，輕微振蕩3 5min，在4°C條件下吸附6 24h，取出 細(xì)菌纖維素小球，用PH4. 8 9. O的醋酸鈉緩沖溶液漂洗1 2次，吸干小球表面水分，4°C 冰箱保存。所述步驟(3)中吸附 交聯(lián)法，包括5 IOml的100 5000U/L酶液中加入細(xì) 菌纖維素小球0. 05 0. 4g并使其浸沒，輕微振蕩3 5min，在4°C條件下吸附6 24h，以 Ig纖維素小球25 200mL戊二醛溶液的比例加入質(zhì)量體積百分比為25%的戊二醛溶液， 20 30°C攪拌條件下交聯(lián)反應(yīng)1 3h，取出細(xì)菌纖維素小球，用pH4. 8 9. 0的醋酸鈉緩 沖溶液漂洗1 2次，吸干小球表面水分，4°C冰箱保存。本發(fā)明的一種以細(xì)菌纖維素膜塊為載體制備固定化酶的方法，包括(1)細(xì)菌纖維素膜的預(yù)處理將細(xì)菌纖維素膜用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 的NaOH在80 90 °C水浴中處理30 120min至膜呈乳白色半透明，用去離子水漂洗3-5次，收集，用體積分?jǐn)?shù)為0. 的醋酸 中和膜內(nèi)殘留的堿液，靜置12 24h，用去離子水漂洗2-3次，濾紙吸干膜表面水分，將膜 切成邊長4-30mmX4-30mm的膜塊，在液氮中速凍或在低溫冰箱里冷凍，然后在冷凍干燥機(jī)中干燥，備用；或?qū)⑷ルx子水漂洗的膜在冷凍干燥機(jī)中凍干后，將凍干后的膜切成邊長 4-30mmX4-30mm的膜塊，備用；(2)固定化酶的制備以細(xì)菌纖維素膜塊為載體采用物理吸附法或吸附 交聯(lián)法制備固定化酶所述步驟⑵中物理吸附法，包括5 IOml的100 5000U/L酶液中加入細(xì)菌纖 維素膜塊0. 002 0. 5g并使其浸沒，輕微振蕩3 5min，在4°C條件下吸附0. 5 24h (優(yōu) 選6-24h)，取出細(xì)菌纖維素膜塊，用pH4. 8 9. 0的緩沖溶液漂洗1 2次，吸干膜塊表面 水分，4°C冰箱保存。所述步驟⑵中吸附 交聯(lián)法，包括5 IOml的100 5000U/L酶液中加入細(xì)菌 纖維素膜塊0. 002 0. 5g并使其浸沒，輕微振蕩3-5min，在4°C條件下吸附0. 5 24h (優(yōu) 選6-24h)，以Ig纖維素膜25 200mL戊二醛溶液的比例加入質(zhì)量體積百分比為25%的戊 二醛溶液5-15mL，20-30°C條件下交聯(lián)反應(yīng)l_3h，取出細(xì)菌纖維素膜塊，用pH4. 8 9. 0的 緩沖溶液漂洗1 2次，吸干膜塊表面水分，4°C冰箱保存。有益效果(1)本發(fā)明提供了一種新型酶固定化技術(shù)。本發(fā)明能高效吸附生物酶，最大限度地 保持酶的活性，且安全環(huán)保，方法簡單，易于操作，可控性強(qiáng)。與采用化學(xué)交聯(lián)的方法相比， 初始酶活保留率高出約25%。(2)球狀細(xì)菌纖維素的生產(chǎn)并將其作為酶固定化的載體材料，拓寬了細(xì)菌纖維素 的應(yīng)用領(lǐng)域。(3)細(xì)菌纖維素材料純度高，生物穩(wěn)定性強(qiáng)。(4)細(xì)菌纖維素材料傳質(zhì)性能好，有利于實(shí)現(xiàn)酶的高效催化。(5)細(xì)菌纖維素材料在自然界的生物可降解性好，生物相容性好。(6)細(xì)菌纖維素小球固定化酶可以用于柱型生物反應(yīng)器，而纖維素膜固定化酶則 可以用于膜生物反應(yīng)器。(7)纖維素膜用于固定化酶在尺寸和形狀的控制上比纖維素小球更方便，操作更 簡單容易，結(jié)構(gòu)上也更均勻。


圖1為游離漆酶(▲)和本發(fā)明細(xì)菌纖維素小球吸附法固定化漆酶(■)的最適
反應(yīng)溫度。圖2為游離漆酶(▲)和本發(fā)明細(xì)菌纖維素小球吸附法固定化漆酶(■)最適反 應(yīng)PH值。圖3為游離漆酶(▲)和本發(fā)明細(xì)菌纖維素小球吸附法固定化漆酶(■)的熱穩(wěn)定性。圖4為游離漆酶(▲)和本發(fā)明細(xì)菌纖維素小球吸附法固定化漆酶(■)的PH
穩(wěn)定性。圖5為本發(fā)明的吸附法( )和吸附_交聯(lián)法(■)細(xì)菌纖維素小球固定化漆酶
的重復(fù)使用穩(wěn)定性。圖6為游離漆酶(▲)和本發(fā)明細(xì)菌纖維素膜吸附法固定化漆酶(■)的最適反應(yīng)溫度。圖7為游離 漆酶(▲)和本發(fā)明細(xì)菌纖維素膜吸附法固定化漆酶(■)的最適反 應(yīng)PH值。圖8為游離漆酶(▲)和本發(fā)明細(xì)菌纖維素膜吸附法固定化漆酶(■)的溫度穩(wěn) 定性。圖9為游離漆酶(▲)和本發(fā)明細(xì)菌纖維素膜吸附法固定化漆酶(■)的PH穩(wěn)定性。圖10為本發(fā)明細(xì)菌纖維素膜吸附法固定化漆酶的重復(fù)使用穩(wěn)定性。圖11為游離漆酶(▲)和本發(fā)明細(xì)菌纖維素膜吸附_交聯(lián)法固定化漆酶(■) 的最適反應(yīng)溫度。圖12為游離漆酶(▲)和本發(fā)明細(xì)菌纖維素膜吸附_交聯(lián)法固定化漆酶(■) 的最適反應(yīng)PH值。圖13為游離漆酶(▲)和本發(fā)明細(xì)菌纖維素膜吸附_交聯(lián)法固定化漆酶(■) 的溫度穩(wěn)定性。圖14為游離漆酶(▲)和本發(fā)明細(xì)菌纖維素膜吸附_交聯(lián)法固定化漆酶(■) 的PH穩(wěn)定性。圖15為本發(fā)明細(xì)菌纖維素膜吸附_交聯(lián)法固定化漆酶的重復(fù)使用穩(wěn)定性。圖16為游離酶(▲)和本發(fā)明纖維素膜吸附法固定化葡萄糖氧化酶(■)的最 適反應(yīng)溫度。圖17為游離酶(▲)和本發(fā)明纖維素膜吸附法固定化葡萄糖氧化酶(■)的最 適反應(yīng)pHo圖18為游離酶(▲)和本發(fā)明纖維素膜吸附法固定化葡萄糖氧化酶(■)的溫 度穩(wěn)定性。圖19為游離酶(▲)和本發(fā)明纖維素膜吸附法固定化葡萄糖氧化酶(■)的PH
穩(wěn)定性。圖20為固定化葡萄糖氧化酶的重復(fù)使用穩(wěn)定性。圖21為游離酶(▲)和本發(fā)明纖維素膜吸附_交聯(lián)法固定化葡糖氧化酶(■) 最適反應(yīng)溫度。圖22為游離酶(▲)和本發(fā)明纖維素膜吸附_交聯(lián)法固定化葡糖氧化酶(■) 最適反應(yīng)pH。圖23為游離酶(▲)和本發(fā)明纖維素膜吸附_交聯(lián)法固定化葡糖氧化酶(■) 溫度穩(wěn)定性。圖24為游離酶(▲)和本發(fā)明纖維素膜吸附_交聯(lián)法固定化葡糖氧化酶(■ )pH 穩(wěn)定性。圖25為吸附_交聯(lián)法固定化葡萄糖氧化酶的重復(fù)使用穩(wěn)定性。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定 的范圍。以下為以細(xì)菌纖維素小 球?yàn)檩d體制備固定化酶的相關(guān)實(shí)施例實(shí)施例1從醋酸桿菌斜面上挑取1環(huán)單菌落接種于IOOmL無菌種子培養(yǎng)基中，所述 的種子培養(yǎng)基包含(質(zhì)量百分比)葡萄糖2.0%，酵母粉0.5%，胰蛋白胨0.5%， Na2HPO4 ·12Η200. 27%，檸檬酸0. 115%,ρΗ5. 0，在 30°C，130rpm條件下培養(yǎng) 12h。以 6%的接 種量將種子液接入到裝有300mL無菌發(fā)酵培養(yǎng)基的500mL錐形瓶中。所述的發(fā)酵培養(yǎng)基包 含(質(zhì)量百分比)葡萄糖2.0%，酵母粉0.5%，胰蛋白胨0.3% ,Na2HPO4 ·12Η20 0.27%，檸 檬酸0. 115%, pH5. 0 ;30°C, IlOrpm條件下培養(yǎng)72h后，在培養(yǎng)基中生成許多細(xì)菌纖維素小 球。將培養(yǎng)基傾濾后取出纖維素小球，用去離子水反復(fù)沖洗，除去小球表面培養(yǎng)基及雜質(zhì)， 再將小球浸泡于0. 1 %的NaOH溶液中，80°C處理60min，去除纖維素小球中的菌體及殘留 培養(yǎng)基至乳白色半透明；然后用去離子水沖洗并加入少量0. 的醋酸中和小球中殘留的 NaOH，靜置過夜后再用去離子水沖洗細(xì)菌纖維素小球；將小球表面液體用濾紙吸干，逐個(gè)用 液氮速凍或置于低溫冰箱中冷凍，然后在冷凍干燥機(jī)中干燥，得到細(xì)菌纖維素小球載體。固定化漆酶的制備吸附法向50mL燒杯中加入酶活單位300U/L的漆酶酶液10mL，加入0. 2g凍干的 細(xì)菌纖維素小球并使其浸沒，輕微振蕩3 5min，在4°C條件下吸附24h，取出細(xì)菌纖維素小 球，用200mM、pH5. 2的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液漂洗1 2次，吸干小球表面水分，4°C冰箱保
存?zhèn)溆?。吸?交聯(lián)法向50mL燒杯中加入酶活單位300U/L的漆酶酶液10mL，加入0. 2g 凍干的細(xì)菌纖維素小球并使其浸沒，輕微振蕩3 5min，在4°C條件下吸附24h，加入IOmL 戊二醛溶液，30°C、磁力攪拌條件下交聯(lián)反應(yīng)1 3h，取出細(xì)菌纖維素小球，用pH4. 8 5. 2 的醋酸鈉緩沖溶液漂洗1 2次，吸干小球表面水分，4°C冰箱保存。酶的表征如下(a)游離酶和固定化酶的最適反應(yīng)溫度以0.4mM 2，2'-連氮基-雙_(3_乙基苯并二氫噻唑啉_6_磺酸)二銨鹽(2， 2' -azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid)，簡稱 ABTS)為底物，在 50mM 醋酸鈉緩沖溶液中(PH = 5. 2)測定漆酶活力，以確定固定化漆酶和游離漆酶的最適反應(yīng)溫 度，結(jié)果如圖1所示。從圖1中相對酶活力的變化(以同組實(shí)驗(yàn)中最高酶活力為100% ) 可知，當(dāng)反應(yīng)溫度< 60°C時(shí)，固定化酶的活力隨著反應(yīng)溫度的升高而增大，當(dāng)反應(yīng)溫度> 60°C時(shí)，固定化酶的活力有所下降，其最佳反應(yīng)溫度(60°C)比游離酶(50°C)提高了 10°C。(b)游離酶和固定化酶的最適反應(yīng)pH值以0. 4mMABTS為底物，在200mM的檸檬酸緩沖液中，50°C條件下測定漆酶活力，以 確定游離酶和固定化酶的最適反應(yīng)PH。以每組最高酶活力為100%作圖，結(jié)果如圖2所示。 從圖中可知，游離酶和固定化酶的最適反應(yīng)PH值都為3. 5，在pH3. 5-5. 5之間，pH值對固定 化酶的影響要小于對游離酶的影響。(c)游離酶和固定化酶的熱穩(wěn)定性將游離酶酶液和固定化酶分別在30 70°C水浴中保持30min后，以0. 4mMABTS為底物，在50°C條件下測定漆酶活力，確定游離酶和固定化酶的溫度穩(wěn)定性。以每組的最高酶 活力為100%，結(jié)果見圖3。由圖可知，游離酶在40°C以內(nèi)較為穩(wěn)定，而固定化酶在50°C以 內(nèi)較穩(wěn)定，比游離酶提高了 10°C。(d)游離酶和固定化酶的pH穩(wěn) 定性將游離酶和固定化酶分別置于含0. 2M不同pH的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液和 0. 4mM ABTS底物的反應(yīng)液中，30°C下保溫30min后，以0. 4mM ABTS為底物，在50mM醋酸鈉 緩沖溶液(PH5. 2)中，50°C條件下測定漆酶活力，以確定游離酶和固定化酶的pH穩(wěn)定性。以 每組的最高酶活力為100%，其結(jié)果見圖4。從圖中可以看出，游離酶在pH5時(shí)較穩(wěn)定，其酶 活在PH4 7的范圍內(nèi)保持了 90%以上的相對活力；固定化酶在pH4時(shí)較穩(wěn)定，其酶活在 PH3 6的范圍內(nèi)保持80%以上的相對活力。固定化酶的酸堿穩(wěn)定性較游離酶向酸性方向 移動(dòng)了 1個(gè)PH單位。(e)固定化酶的重復(fù)使用穩(wěn)定性在50mL小燒杯中，加入IOmL去離子水、5mL醋酸鈉緩沖溶液(200mM，pH5. 2)和5mL ABTS(2mM)，磁力攪拌子緩慢攪拌，當(dāng)溫度達(dá)到50°C后加入0.2g固定化酶。按照(d)中酶 活力測定方法測定固定化酶酶活。20min后，取出固定化酶，用醋酸鈉緩沖溶液沖洗1 2 次，再用去離子水反復(fù)沖洗，充分洗滌反應(yīng)底物和產(chǎn)物。用濾紙吸干殘留水分并重復(fù)以上操 作，直到得到重復(fù)使用7次后的固定化酶。測定酶活力的結(jié)果見圖5，以固定化漆酶第一次 使用所測酶活為100%計(jì)，其它所測的酶活以其為基準(zhǔn)計(jì)算相對酶活。由圖5可知，兩種固 定化酶經(jīng)多次重復(fù)使用后，都具有較好的穩(wěn)定性，在經(jīng)過4次使用后，其相對酶活力仍高于 35%。以下為以細(xì)菌纖維素膜塊為載體制備固定化酶的相關(guān)實(shí)施例實(shí)施例2細(xì)菌纖維素膜塊載體的制備從活化的斜面菌種上挑取1環(huán)單菌落接種于IOOmL無菌的種子培養(yǎng)基中，30°C， 100-200rpm條件下培養(yǎng)12h后作為種子液所述的種子培養(yǎng)基包含(質(zhì)量百分比)甘露 醇2.5%，酵母粉0.5%，胰蛋白胨0.5%，pH5.0。以4-10%接種量將液體種子轉(zhuǎn)接至發(fā)酵 培養(yǎng)基中，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基包含(質(zhì)量百分比)甘露醇2.5%，酵母粉0.5%，胰蛋白胨 0.3%, pH5.0;25-3(TC，靜置培養(yǎng)5-14d，傾濾，收集細(xì)菌纖維素膜。將發(fā)酵收集得到的細(xì) 菌纖維素膜用0. 的NaOH在80°C水浴中處理至膜呈乳白色半透明，用去離子水漂洗3_5 次，收集，用0. 1 %的醋酸中和膜內(nèi)殘留的堿液，靜置過夜，用去離子水漂洗2-3次，濾紙吸 干膜表面水分，在液氮中速凍或在低溫冰箱里冷凍，然后在冷凍干燥機(jī)中干燥，將凍干后的 膜切成邊長4-30mm的膜塊，備用。其中，菌種選自醋桿菌、木醋桿菌、產(chǎn)醋醋桿菌、醋化桿菌、許氏醋酸菌、惡臭醋酸 菌、奧爾蘭醋桿菌、彎醋桿菌、巴氏醋桿菌、葡萄糖桿菌、葡萄糖氧化桿菌、農(nóng)桿菌、根瘤菌、 洋蔥假單胞菌、八疊球菌、椰毒假單胞菌、空腸彎曲菌中的一種或幾種。實(shí)施例3固定化漆酶的制備(單純吸附固定)向50mL燒杯中加入pH5. 0、酶活單位，1000U/L的漆酶酶液10mL，加入0. 2g凍干的
細(xì)菌纖維素膜塊并使其浸沒，輕微振蕩3-5min，在4°C條件下吸附24h，取出細(xì)菌纖維素膜塊，用200mM、 pH5. 2的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液漂洗1_2次，吸干膜塊表面水分，4°C冰箱保存?zhèn)溆?。酶?jīng)固定化后與游離酶相比具有如下特征從圖6-10中相對酶活力(同組實(shí)驗(yàn)中 以酶活力最高的為100%，其余的固定化酶或游離酶的活力與之相比，以百分?jǐn)?shù)表示)的變 化可知，固定化酶的最適反應(yīng)溫度為60°C，較游離酶的最適反應(yīng)溫度50°C提高了 10°C。固 定化酶和游離酶的最適反應(yīng)PH均為3. 5，但在pH 3. 5-5. 5之間，固定化酶較游離酶受pH的 影響小。游離酶在40°C較為穩(wěn)定，而固定化酶在50°C較穩(wěn)定，比游離酶提高了 10°C。游離 酶在PH5時(shí)較穩(wěn)定，其酶活在pH4-7的范圍內(nèi)保持90%以上的相對活力；固定化酶在pH4時(shí) 較穩(wěn)定，其酶活在PH3-6的范圍內(nèi)保持80%以上的相對活力。固定化酶的酸堿穩(wěn)定性較游 離酶向酸性方向移動(dòng)了 1個(gè)單位。吸附法固定化漆酶在前4次重復(fù)使用中具有較好的穩(wěn)定 性。實(shí)施例4固定化漆酶的制備及表征(吸附聯(lián)合戊二醛交聯(lián))向50mL燒杯中加入pH5. 0、酶活單位，1000U/L的漆酶酶液10mL，加入0. 2g凍干的 細(xì)菌纖維素膜塊并使其浸沒，輕微振蕩3-5min，在4°C條件下吸附24h，加入5_15mL 2. 5% 的戊二醛溶液，30°C條件下交聯(lián)反應(yīng)lh。取出細(xì)菌纖維素膜塊，用200mM、pH5. 2的醋酸-醋 酸鈉緩沖溶液漂洗1-2次，吸干膜塊表面水分，4°C冰箱保存?zhèn)溆?。酶?jīng)固定化后與游離酶相比具有如下特征從圖11-15中相對酶活力(同組實(shí)驗(yàn) 中以酶活力最高的為100%，其余的固定化酶或游離酶的活力與之相比，以百分?jǐn)?shù)表示)的 變化可知，固定化酶的最佳反應(yīng)溫度(60°c )比游離酶(50°C )提高了 10°C。固定化酶的最 適反應(yīng)pH(4.0)比游離酶(3.0)向堿性方向移動(dòng)了 1個(gè)單位。在50-70°C范圍內(nèi)，固定化酶 的穩(wěn)定性較游離酶高。游離酶在PH5時(shí)較穩(wěn)定，固定化酶在pH4時(shí)較穩(wěn)定，固定化酶的酸堿 穩(wěn)定性較游離酶向酸性方向移動(dòng)了 1個(gè)單位。吸附-交聯(lián)法固定化漆酶在經(jīng)過6次重復(fù)反 應(yīng)使用后其相對酶活力高于70%。具有較好的重復(fù)利用效果。實(shí)施例5固定化葡萄糖氧化酶的制備及表征(單純吸附固定)向50mL燒杯中加入pH5. O、酶活單位1700U/L的葡萄糖氧化酶的酶液10mL，加入 0. 2g凍干的細(xì)菌纖維素膜塊并使其浸沒，輕微振蕩3-5min，在4°C條件下吸附24h。取出細(xì) 菌纖維素膜塊，用200mM、pH7. O的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液漂洗1_2次，吸干膜塊表面 水分，4°C冰箱保存?zhèn)溆?。酶?jīng)固定化后與游離酶相比具有如下特征從圖16-20中相對酶活力(同組實(shí)驗(yàn) 中以酶活力最高的為100%，其余的固定化酶或游離酶的活力與之相比，以百分?jǐn)?shù)表示)的 變化可知，酶經(jīng)吸附固定化后，其最適反應(yīng)溫度較游離酶提高了 5°c，隨著溫度的升高，游離 酶酶活迅速下降，而固定化酶在70°C仍保持39%的相對酶活力。固定化酶的最適反應(yīng)pH較 游離酶向酸性方向移動(dòng)了 2個(gè)單位，為pH5. O。酶經(jīng)吸附固定化后，其溫度穩(wěn)定性較游離酶 得到了較大提高，在40°C仍保持85%以上的酶活力。其酸堿穩(wěn)定性也有一定程度的提高， 游離酶和固定化酶在PH6. O的條件下最穩(wěn)定，但固定化酶在pH3-8范圍內(nèi)的酸堿穩(wěn)定性均 略高于游離酶。固定化酶具有一定的重復(fù)使用效果，在使用3次后活力有一定下降。實(shí)施例6
固定化葡萄糖氧化酶的制備及表征(吸附聯(lián)合戊二醛交聯(lián))向50mL燒杯中加入pH5. 0、酶活單位1700U/L的葡萄糖氧化酶的酶液10mL，力口 入0. 2g凍干的細(xì)菌纖維素膜塊并使其浸沒，輕微振蕩3-5min，在4°C條件下吸附24h，加 入5-15mL 2. 5%的戊二醛溶液，30°C條件下交聯(lián)反應(yīng)lh。取出細(xì)菌纖維素膜塊，用200mM、 pH7. O的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液漂洗1-2次，吸干膜塊表面水 分，4°C冰箱保存?zhèn)溆?。酶?jīng)固定化后與游離酶相比具有如下特征從圖21-25中相對酶活力(同組實(shí)驗(yàn) 中以酶活力最高的為100%，其余的固定化酶或游離酶的活力與之相比，以百分?jǐn)?shù)表示)的 變化可知，酶經(jīng)吸附-交聯(lián)固定化后，其最適反應(yīng)溫度較游離酶提高了 5°c，隨著溫度的升 高，游離酶酶活迅速下降，而固定化酶在60°C仍保持50%以上的酶活力。固定化酶的最適 反應(yīng)PH為6.0，較游離酶向酸性方向移動(dòng)了 1個(gè)單位。酶經(jīng)吸附-交聯(lián)固定化后，其溫度 穩(wěn)定性得到了較大提高，在60°C仍保持45%以上的酶活力。其酸堿穩(wěn)定性有一定程度的提 高，游離酶在PH6. O的條件下最穩(wěn)定，而固定化酶在pH5. O條件下最穩(wěn)定，較游離酶向酸性 方向移動(dòng)了一個(gè)單位。固定化酶在經(jīng)過6次重復(fù)使用后其相對酶活力仍高于70%，具有較 好的重復(fù)利用效果。實(shí)施例7細(xì)菌纖維素膜塊固定化漆酶的影響以實(shí)施例1中所制備的細(xì)菌纖維素膜塊為材料，按照實(shí)施例2的方法固定化漆酶， 所不同的是固定化所用的細(xì)菌纖維素膜塊大小不同、膜塊數(shù)目不同、吸附時(shí)間不同、加酶量 不同。從表1-4中可以看出，隨著膜塊尺寸的增大，固定化酶的活力逐漸減小，膜的尺寸大 小為7mmX 7mm時(shí)，固定化酶活力為9. 70U/g載體，蛋白載量此時(shí)最大，為3. 20mg蛋白/g載 體。隨著膜塊數(shù)目(即膜塊相對表面積)的增加，固定化酶的活力逐漸增大，當(dāng)膜塊數(shù)目為 4時(shí)，固定化酶活力達(dá)9. 77U/g載體，蛋白載量此時(shí)達(dá)到最大。膜塊數(shù)目為3時(shí)，比活力最高 為2. 63U/mg蛋白。隨著吸附時(shí)間的增加，固定化酶活力逐漸增大，在4小時(shí)后增加較為緩 慢，在4小時(shí)時(shí)固定化酶的比活力達(dá)到最大，為0. 47U/mg蛋白。隨著加酶量的增加，固定化 酶活力逐漸增大，在加酶量超過1. 5mL后，酶活增加較緩慢，在加酶量為0. 5mL時(shí)，比酶活最 大，為4. 43U/mg蛋白。表1.細(xì)菌纖維素膜塊大小對固定化漆酶的影響
膜塊尺寸 mmXmm7X7 10X10 15X15 20X20
固定化酶活力(U/g載體) 9708A26M 89
蛋白載量(mg蛋白/g載體)3.203.032.722.13比活力(U/mg 蛋白)3.022.782.452.77 活力回收率(％) 2.34 3.73 4.49 8.00 理論吸附率(％) 13.35 18.63 22.07 39.22表2.細(xì)菌纖維素膜塊相對表面積對固定化漆酶的影響膜塊數(shù)目 234
固定化酶活力(U/g載體)5.657 58Λ8977
蛋白載量(mg蛋白/g載體)2.432.873.223.96比活力(U/mg 蛋白)2.3 32.462.632.48 活力回收率(％)6.126.797.388.55 理論吸附率(％)31.0635.6638.6142.33表3.吸附時(shí)間對細(xì)菌纖維素固定化漆酶的影響
吸附時(shí)間(h)05 12468~
固定化酶活力(U/g 載體)~L8682.9863.4194.7734.9035.046
蛋白載量(mg 蛋白/g 載體)5.707.257.3210.1112.4812.31比活力(U/mg蛋白) 0.330.410.460.470.390.41 活力回收率(％) 0.410.720.901.061.141.22 理論吸附率(％) 27.6128.4229.9034.7034.4534.67表4.加酶量對細(xì)菌纖維素固定化漆酶的影響
加酶量(mL) 02505 1L5 2~固定化酶活力(U/g 載體)3.28IsI5Λ35M623^ 蛋白載量(mg 蛋白/g 載體)0.910.864.9712.3417.86 比活力(U/mg 蛋白)3.594.431.030.460.35
活力回收率(％)2.6481.6941.1390.9910.881
理論吸附率(％)26.4723.1620.4619.0619.07實(shí)施例8細(xì)菌纖維素膜塊對固定化葡萄糖氧化酶的影響以實(shí)施例1中所制備的細(xì)菌纖維素膜塊為材料，按照實(shí)施例3的方法固定化葡萄 糖氧化酶，所不同的是固定化所用的細(xì)菌纖維素膜塊大小不同、膜塊數(shù)目不同、吸附時(shí)間不 同、加酶量不同。從表5-6中可以看出，隨著膜塊尺寸的增大，固定化酶的活力逐漸減小，比 活力先增加后減小，在膜塊尺寸為15mmX 15mm時(shí)比活力達(dá)到最大，為28. 84U/mg蛋白。隨著 膜塊數(shù)目(相對表面積)的增加，固定化酶活力逐漸增大，比活力逐漸減小，在膜塊數(shù)目為4 時(shí)，固定化酶活力為132. 12U/g載體，比活力為43. 60U/mg蛋白。隨著吸附時(shí)間的增加，固 定化酶活力先增大后減小，在吸附時(shí)間為6小時(shí)時(shí)，固定化酶活力最大為415. 03U/g載體。 比活力在吸附時(shí)間為4小時(shí)時(shí)達(dá)到最大，為181.89U/mg蛋白。隨著加酶量的增加，固定化 酶活力逐漸增大，當(dāng)加酶量大于ImL后，酶活增加緩慢。比活力先增大后減小，在加酶量為0. 75mL時(shí)達(dá)到最大，為107. 18U/mg蛋白。表5.細(xì)菌纖維素膜塊大小 對固定化葡萄糖氧化酶的影響
權(quán)利要求
一種以球形細(xì)菌纖維素為載體制備固定化酶的方法，包括(1)細(xì)菌纖維素小球的制備將活化的斜面菌種接入pH4.8～5.2的種子培養(yǎng)基，在25～30℃、100～200rpm條件下培養(yǎng)12～16h制得液體種子，以體積百分比為4～10％接種量將液體種子轉(zhuǎn)接至pH4.8～5.2的發(fā)酵培養(yǎng)基中，每500mL錐形瓶中含有200～300mL發(fā)酵培養(yǎng)液，25～30℃，80～200rpm條件下培養(yǎng)48～96h，傾濾，得細(xì)菌纖維素小球；(2)細(xì)菌纖維素小球的處理將發(fā)酵收集得到的細(xì)菌纖維素小球用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1％的NaOH在80～90℃水浴中處理30～120min，用去離子水漂洗3～5次，收集，用體積分?jǐn)?shù)為0.1％的醋酸中和小球內(nèi)殘留的堿液，靜置12～24h，用去離子水漂洗2～3次，在水中保持其球狀形態(tài)，將小球取出，吸干表面水分，在液氮中速凍或在低溫冰箱里冷凍，然后在冷凍干燥機(jī)中干燥后獲得白色纖維素小球；(3)細(xì)菌纖維素小球固定化酶的制備以細(xì)菌纖維素小球?yàn)檩d體采用物理吸附法或吸附～交聯(lián)法制備固定化酶。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種以球形細(xì)菌纖維素為載體制備固定化酶的方法，其特征 在于，所述步驟(1)的菌種選自醋桿菌、木醋桿菌、產(chǎn)醋醋桿菌、醋化桿菌、許氏醋酸菌、惡 臭醋酸菌、奧爾蘭醋桿菌、彎醋桿菌、巴氏醋桿菌、葡萄糖桿菌、葡萄糖氧化桿菌、農(nóng)桿菌、根 瘤菌、洋蔥假單胞菌、八疊球菌、椰毒假單胞菌、空腸彎曲菌中的一種或幾種。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種以球形細(xì)菌纖維素為載體制備固定化酶的方法，其特征 在于，所述步驟(1)中的種子培養(yǎng)基，按重量百分比，包含葡萄糖2.0%，酵母粉0.5%，胰 蛋白胨 0. 5%, Na2HPO4 · 12H20 0. 27%，檸檬酸 0. 115% 0
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種以球形細(xì)菌纖維素為載體制備固定化酶的方法，其特征 在于，所述步驟(1)中的發(fā)酵培養(yǎng)基，按重量百分比，包含葡萄糖2.0%，酵母粉0. 5 %，胰 蛋白胨 0. 3%, Na2HPO4 · 12H20 0. 27%，檸檬酸 0. 115% 0
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種以球形細(xì)菌纖維素為載體制備固定化酶的方法，其特征 在于，所述步驟⑶中物理吸附法，包括5 IOml的100 5000U/L酶液中加入細(xì)菌纖維 素小球0. 05 0. 4g并使其浸沒，輕微振蕩3 5min，在4°C條件下吸附6 24h，取出細(xì)菌 纖維素小球，用緩沖溶液漂洗1 2次，吸干小球表面水分，4°C冰箱保存。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種以球形細(xì)菌纖維素為載體制備固定化酶的方法，其特征 在于，所述步驟⑶中吸附 交聯(lián)法，包括5 IOml的100 5000U/L酶液中加入細(xì)菌纖 維素小球0. 05 0. 4g并使其浸沒，輕微振蕩3 5min，在4°C條件下吸附6 24h，以Ig纖 維素小球25 200mL戊二醛溶液的比例加入質(zhì)量體積百分比為25%的戊二醛溶液，20 30°C攪拌條件下交聯(lián)反應(yīng)1 3h，取出細(xì)菌纖維素小球，用緩沖溶液漂洗1 2次，吸干小 球表面水分，4°C冰箱保存。
7.一種以細(xì)菌纖維素膜塊為載體制備固定化酶的方法，包括(1)將細(xì)菌纖維素膜用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 的NaOH在80 90°C水浴中處理30 120min 至膜呈乳白色半透明，用去離子水漂洗3-5次，收集，用體積分?jǐn)?shù)為0. 的醋酸中和膜內(nèi) 殘留的堿液，靜置12 24h，用去離子水漂洗2-3次，濾紙吸干膜表面水分，將膜切成膜塊， 在液氮中速凍或在低溫冰箱里冷凍，然后在冷凍干燥機(jī)中干燥，備用；或?qū)⑷ルx子水漂洗的膜在冷凍干燥機(jī)中凍干后，將凍干后的膜切成膜塊，備用；(2)固定化酶的制備以細(xì)菌纖維素膜塊為載體采用物理吸附法或吸附 交聯(lián)法制備固定化酶。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的一種以細(xì)菌纖維素膜塊為載體制備固定化酶的方法，其特征 在于所述步驟⑵中物理吸附法，包括5 IOml的100 5000U/L酶液中加入細(xì)菌纖維 素膜塊0. 002 0. 5g并使其浸沒，輕微振蕩3 5min，在4°C條件下吸附0. 5 24h，取出 細(xì)菌纖維素膜塊，用緩沖溶液漂洗1 2次，吸干膜塊表面水分，4°C冰箱保存。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的一種以細(xì)菌纖維素膜塊為載體制備固定化酶的方法，其特征 在于所述步驟⑵中吸附 交聯(lián)法，包括5 IOml的100 5000U/L酶液中加入細(xì)菌纖 維素膜塊0. 002 0. 5g并使其浸沒，輕微振蕩3-5min，在4°C條件下吸附0. 5_24h，以Ig纖 維素膜25 200mL戊二醛溶液的比例加入質(zhì)量體積百分比為25%的戊二醛溶液5_15mL， 20-30°C條件下交聯(lián)反應(yīng)l_3h，取出細(xì)菌纖維素膜塊，用緩沖溶液漂洗1 2次，吸干膜塊表 面水分，4°C冰箱保存。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種以細(xì)菌纖維素小球/膜塊為載體制備固定化酶的方法，包括發(fā)酵制備細(xì)菌纖維素小球或細(xì)菌纖維素膜；然后用0.1％的NaOH在80～90℃水浴中處理30～120min，去離子水漂洗，收集，用0.1％的醋酸中和殘留的堿液，靜置，去離子水漂洗，將小球或膜塊取出，吸干表面水分，冷凍，然后冷凍干燥后備用；最后采用物理吸附法或吸附～交聯(lián)法制備固定化酶。本發(fā)明的細(xì)菌纖維素小球/膜塊能高效吸附生物酶，最大限度地保持酶的活性，且安全環(huán)保，方法簡單，易于操作，可控性強(qiáng)。
文檔編號C12R1/41GK101967471SQ20101053181
公開日2011年2月9日 申請日期2010年11月4日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月10日
發(fā)明者曹張軍, 楊光, 楊雪霞, 洪楓 申請人:東華大學(xué)