專利名稱：黃牛pcsk1基因的單核苷酸多態(tài)性及其檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子遺傳學(xué)領(lǐng)域，涉及以黃牛的功能基因的單核苷酸多態(tài)性(SNP)作 為分子遺傳標(biāo)記，特別涉及三種黃牛PCSKI基因的單核苷酸多態(tài)性及其檢測方法。
背景技術(shù)：
黃牛是我國的主要的畜牧之一，但是現(xiàn)在面臨著優(yōu)秀黃牛品種種源不足和種群遺 傳品質(zhì)較差的壓力。傳統(tǒng)的育種方法應(yīng)用測試動物的表現(xiàn)型和其親代、祖代及其它親屬在 小的動物模型中的遺傳信息，設(shè)想性狀受到許多基因遺傳差異的影響，每個(gè)基因?qū)π誀钣?相對較小的貢獻(xiàn)，因此對性狀的估計(jì)不可避免有些偏差。分子遺傳標(biāo)記是近年來現(xiàn)代遺傳 學(xué)發(fā)展最快的領(lǐng)域之一，新的方法正在不斷涌現(xiàn)，已定位的標(biāo)記基因數(shù)目與日俱增。這將為 數(shù)量遺傳學(xué)提供分子水平信息，家畜育種也將跨入分子育種階段。應(yīng)用分子遺傳標(biāo)記的現(xiàn) 代育種技術(shù)是加快良種選育和提高種群遺傳品質(zhì)，從而增加黃牛的產(chǎn)肉量和改善肉品質(zhì)的 先進(jìn)的有效的方法。分子遺傳標(biāo)記輔助選擇就是將現(xiàn)代生物技術(shù)與常規(guī)選擇方法相結(jié)合，通過對遺傳 標(biāo)記的選擇來間接選擇控制某性狀的數(shù)量性狀位點(diǎn)(QTL)，使之能夠同時(shí)利用標(biāo)記位點(diǎn)信 息和數(shù)量性狀的表型信息，更準(zhǔn)確估計(jì)動物個(gè)體的育種值，提高選擇效率，加快育種進(jìn)展。 標(biāo)記輔助選擇主要經(jīng)歷了三個(gè)階段第一階段是家畜各性狀間的遺傳分析；第二階段是蛋 白質(zhì)(酶)標(biāo)記對數(shù)量性狀的標(biāo)記階段；第三個(gè)階段是分子遺傳標(biāo)記階段。隨著分子標(biāo)記 技術(shù)日漸成熟與豐富，使覆蓋整個(gè)基因組的標(biāo)記成為可能，通過與QTL間的連鎖分析，實(shí)現(xiàn) 分子標(biāo)記輔助選擇的目標(biāo)。單核苷酸多態(tài)性(Single Nucleotide Polymorphism, SNP)作為新的遺傳標(biāo)記已 廣泛應(yīng)用于基因定位、克隆、遺傳育種及多樣性的研究。SNP是基因組中存在的一種數(shù)量非 常豐富的變異形式，占人類基因組中遺傳多態(tài)性的90%以上。SNP與罕見的變異不同，通常 在種群中頻率等于或小于的此種變異被稱為突變，而只有頻率大于時(shí)才被稱為單 核苷酸多態(tài)性。目前，主要采用幾種不同的方法來發(fā)現(xiàn)SNPs: DNA序列測定方法、PCR-SSCP與DNA 測序結(jié)合法、AS-PCR方法、PCR-RFLP法、TaqMam技術(shù)與分子信標(biāo)(Molecular Beacons)等。 在這些SNP檢測技術(shù)中，(I)DNA序列測定法是最為準(zhǔn)確的SNP檢測方法，但是，其檢測費(fèi)用 極其昂貴，且需要有DNA測序儀等大型儀器，同時(shí)，在測序過程中需要非常熟練的技術(shù)人員 和經(jīng)驗(yàn)，所以，DNA序列測定法不是一種應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)際的理想SNP檢測方法；(2) PCR-SSCP 與DNA測序結(jié)合法檢測SNP可以適當(dāng)降低檢測費(fèi)用，但是，PCR-SSCP的實(shí)驗(yàn)過程比較長，操 作比較繁瑣，且實(shí)驗(yàn)過程中存在假陽性問題，所以，也并非理想的SNP檢測手段；(3)AS-PCR 方法作為一種新型的SNP檢測方法，在未來的應(yīng)用領(lǐng)域中具有非常廣闊的前景，但是，該方 法需要設(shè)計(jì)特別的引物，且只能針對特定的基因位點(diǎn)，同時(shí)，檢測過程中還存在誤檢的概 率，因此，目前不具有普遍應(yīng)用的特點(diǎn)；(4) TaqMam技術(shù)與分子信標(biāo)(Molecular Beacons) 都是在熒光能量轉(zhuǎn)移(Fluorescence Resornance Energ Transfer，F(xiàn)RET)基礎(chǔ)上建立起來的，利用熒光標(biāo)記及儀器達(dá)到檢測目的。焦磷酸測序(Pyrosequencing)則是利用測序過程 中可釋放的焦磷酸和酶類產(chǎn)生熒光，是不依賴平板膠或毛細(xì)管電泳、不依賴DNA的熒光標(biāo) 記技術(shù)，很可能成為未來的主流技術(shù)。(5) RFLP-PCR方法是一種檢測SNP的有效技術(shù)，在發(fā) 現(xiàn)SNP位點(diǎn)后引入限制性內(nèi)切酶進(jìn)行切割，然后進(jìn)行瓊脂糖、聚丙烯凝膠電泳分析，就能準(zhǔn) 確地鑒別SNP位點(diǎn)。RFLP-PCR方法不僅具有DNA測序法的準(zhǔn)確性，又克服了費(fèi)用昂貴、繁瑣 操作、假陽性的缺點(diǎn)，而且所檢測的序列位點(diǎn)無特殊性要求。PCSKs是一類絲氨酸蛋白酶，負(fù)責(zé)許多激素原和神經(jīng)肽前體的剪切和成熟。到 目前為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn) 9 種 PCSKs 包括 PCSKl (PCI/3, PCl)，PCSK2 (PC2)，PCSK3 (furin)， PCSK4 (PC4)，PCSK5 (PC5/6)，PCSK6(PACE4)，PCSK7(PC7/8)，PCSK8(SKI)，PCSK9(NARC-I)。其 中前7種PCs在堿性氨基酸末端分開，且這些堿性氨基酸具有一致序列Arg/Lys/His-X-X/ Lys/Arg-Arg，它的下游X表示除Cys外的任何氨基酸，后兩種PCs在非基本氨基酸末端分 開。大量研究顯示PCs在健康和疾病如腫瘤發(fā)生，肥胖癥，糖尿病，病毒感染，細(xì)菌致病機(jī) 理，動脈粥樣硬化和神經(jīng)退行性變疾病中發(fā)揮不同的作用。PCSKl的轉(zhuǎn)錄物最初是在神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的，PCSKl能生成一種前蛋白轉(zhuǎn) 化酶，它可激活人體內(nèi)控制食欲的胰島素、胰高血糖素以及令人產(chǎn)生飽脹感的阿黑皮素原 (POMC)等。PCSKl大量存在于腦垂體的垂體前葉(AL)中，PCSK2存在于神經(jīng)中葉(NIL). PCSKl和PCSK2共同參與POMC的激活過程。在AL中POMC被轉(zhuǎn)化成ACTH(促腎上腺皮質(zhì)激 素)和β _LPR( β-促脂肪動用激素)，在NIL中ACTH被進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為a-MSH(a-促黑色 素細(xì)胞激素)和CLIP (中間葉促皮質(zhì)樣態(tài))，β-UR進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為i3-MSH(i3-促黑色素細(xì) 胞激素)和β -END ( β -內(nèi)啡肽)。為此，PCSKl基因遺傳變異或SNP位點(diǎn)在動物生產(chǎn)實(shí)踐 中對生長發(fā)育性狀具有重要的作用。關(guān)于動物PCSKl基因遺傳變異的研究國內(nèi)外多見于人、鼠等動物，而少見黃牛 PCSKl基因遺傳變異或SNP研究的報(bào)道。由于目前黃牛PCSKl基因遺傳變異領(lǐng)域的研究匱 乏，使該基因位點(diǎn)的功能研究及該基因遺傳變異與經(jīng)濟(jì)性狀(如生長發(fā)育性狀)關(guān)聯(lián)的研 究成為空白。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明解決的問題在于提供黃牛PCSKl基因單核苷酸多態(tài)性檢測方法及其應(yīng)用， 尋找與黃牛經(jīng)濟(jì)性狀相關(guān)的SNP作為分子標(biāo)記，加快黃牛良種繁育速度。本發(fā)明通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)三種黃牛PCSKl基因的單核苷酸多態(tài)性，其基因單核苷酸多態(tài)性包括黃牛PCSKl基因第44686位為T或G的單核苷酸多態(tài)性。上述黃牛PCSKl基因的單核苷酸多態(tài)性的檢測方法為以包含PCSKl基因的待測黃牛全基因組DNA為模板，以引物對P為引物，PCR擴(kuò)增 黃牛PCSKl基因；用限制性內(nèi)切酶HinfI消化PCR擴(kuò)增產(chǎn)物之后，再對酶切后的擴(kuò)增片段 進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳；根據(jù)電泳結(jié)果鑒定黃牛PCSKl基因第44686位的單核苷酸多態(tài) 性；所述的引物對P為上游引物P1 TCAAAGCAATCACCAAAGAAG 21 ；
下游引物P2 ACAAAACACCCACTTCAGACA 21。所述的PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?4°C預(yù)變性 5min ；94°C變性 30s，62. 5°C退火 30s，72°C延伸 30s，35 個(gè)循環(huán)；72°C 延伸lOmin。所述的聚丙烯酰胺凝膠電泳為濃度為12%的聚丙烯酰胺凝膠電泳。所述的根據(jù)聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)PCSKl基因第44686位的堿基多態(tài)性為TT型 表現(xiàn)203bp和103bp ；TG型表現(xiàn)306bp、203bp和103bp ；GG型表現(xiàn):306bp。與現(xiàn)有技術(shù)相 比，本發(fā)明具有以下有益的技術(shù)效果本發(fā)明公開了與黃牛生長發(fā)育相關(guān)的功能基因PCSKl的核苷酸多態(tài)性，該核苷酸 多態(tài)性能夠作為一個(gè)分子遺傳標(biāo)記，利用標(biāo)記位點(diǎn)信息和數(shù)量性狀的表型信息，更準(zhǔn)確估 計(jì)動物個(gè)體的育種值，提高選擇效率，加快育種進(jìn)展。本發(fā)明對PCSKl基因的SNP進(jìn)行了基因分型和基因頻率分析，以及與三種黃牛體 尺性狀之間進(jìn)行了性狀關(guān)聯(lián)分析；結(jié)果顯示PCSKl基因的核苷酸多態(tài)位點(diǎn)能夠成為分子遺 傳輔助育種的標(biāo)記。本發(fā)明提供的檢測方法為PCSKl基因的SNP與體尺性狀關(guān)系的建立奠定了基礎(chǔ)， 以便用于中國黃牛標(biāo)記輔助選擇，快速建立遺傳資源優(yōu)良的黃牛種群。


圖1為黃牛血樣基因組DNA電泳檢測圖；圖2為黃牛PCSKl基因第14外顯子及側(cè)翼區(qū)306bp克隆測序PCR產(chǎn)物電泳圖；圖3為黃牛PCSKl基因第14外顯子及側(cè)翼區(qū)306bp PCR產(chǎn)物的HinfI酶切電泳檢 測PCSKl基因多態(tài)性的電泳結(jié)果圖；泳道1，3，4，6 :GG基因型個(gè)體(306bp)；泳道2、7 :TG基 因型個(gè)體(306bp，203bp，103bp)；泳道 5 :TT 基因型個(gè)體(203bp，103bp) ；M =Marker (622bp, pBR322DNA/Msp I Markers)。圖4為黃牛PCSKl基因SNP的不同基因型測序峰圖。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明以PCSKl基因保守序列設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增PCSKl基因第14外顯子及側(cè)翼區(qū) 306bp片段，分別以三種黃牛品種的基因組為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并對PCR產(chǎn)物純化，經(jīng)測 序后尋找該擴(kuò)增片段的單核苷酸多態(tài)；針對發(fā)現(xiàn)的單核苷酸多態(tài)進(jìn)行性狀關(guān)聯(lián)性分析，并 提供其檢測方法，使得PCSKl基因的核苷酸多態(tài)性成為一種能夠快速、方便檢測的分子遺 傳標(biāo)記，為加快建立具有優(yōu)質(zhì)經(jīng)濟(jì)性狀的黃牛種群提供依據(jù)。a、黃牛PCSKl基因部分DNA序列的克隆及其多態(tài)性的檢測1、黃牛血樣的采集及處理取黃牛血樣10mL，加入0. 5mol/L的EDTA 500 μ L抗凝，緩慢顛倒3次后放入冰 盒，-80°C保存?zhèn)溆?。本?shí)施例采用了 3個(gè)黃牛品種，具體如表1所示。表1奶山羊樣品來源表
權(quán)利要求
黃牛PCSK1基因的單核苷酸多態(tài)性，其特征在于，其基因單核苷酸多態(tài)性包括黃牛PCSK1基因第44686位為T或G的單核苷酸多態(tài)性。
2.黃牛PCSKl基因的單核苷酸多態(tài)性的檢測方法，其特征在于，包括以下步驟 以包含PCSKl基因的待測黃牛全基因組DNA為模板，以引物對P為引物，PCR擴(kuò)增黃牛PCSKl基因；用限制性內(nèi)切酶HinfI消化PCR擴(kuò)增產(chǎn)物之后，再對酶切后的擴(kuò)增片段進(jìn)行聚 丙烯酰胺凝膠電泳；根據(jù)電泳結(jié)果鑒定黃牛PCSKl基因第44686位的單核苷酸多態(tài)性； 所述的引物對P為上游引物 Pl TCAAAGCAATCACCAAAGAAG 21 ； 下游引物 P2 :ACAAAACACCCACTTCAGACA 21。
3.如權(quán)利要求2所述的黃牛PCSKl基因的單核苷酸多態(tài)性的檢測方法，其特征在于，所 述的PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?4°C預(yù)變性5min ；94°C變性30s, 62. 5°C退火30s，72°C延伸30s，35個(gè)循環(huán)；72°C延伸 IOmin0
4.如權(quán)利要求2所述的黃牛PCSKl基因的單核苷酸多態(tài)性的檢測方法，其特征在于，所 述的聚丙烯酰胺凝膠的濃度為12%。
5.如權(quán)利要求2所述的黃牛PCSKl基因的單核苷酸多態(tài)性的檢測方法，其特征在于，所 述的根據(jù)聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)PCSKl基因第44686bp位為TT型表現(xiàn)203bp和103bp ； TG 型表現(xiàn)306bp、203bp 和 103bp ；GG 型表現(xiàn)306bp。
全文摘要
本發(fā)明公開了黃牛PCSK1基因的單核苷酸多態(tài)性及其檢測方法，其基因單核苷酸多態(tài)性包括以包含PCSK1基因的待測黃牛全基因組DNA為模板，以引物對P為引物，PCR擴(kuò)增黃牛PCSK1基因；用限制性內(nèi)切酶HinfI消化PCR擴(kuò)增產(chǎn)物之后，再對酶切后的擴(kuò)增片段進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳；根據(jù)電泳結(jié)果鑒定黃牛PCSK1基因第44686bp的堿基多態(tài)性。該方法是一種在DNA水平上篩查和檢測與黃牛生長發(fā)育性狀密切相關(guān)的分子遺傳標(biāo)記，以用于黃牛的輔助選擇和分子育種，加快黃牛良種繁育速度。
文檔編號C12Q1/68GK101962684SQ20101053156
公開日2011年2月2日 申請日期2010年11月4日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月4日
發(fā)明者單俐敏, 張春雷, 房興堂, 汪琴, 陳宏 申請人:徐州師范大學(xué)