Ndm-1 鎖核酸探針修飾電極及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了NDM-1鎖核酸探針修飾電極及其制備方法和應(yīng)用，具體是設(shè)計(jì)鎖核酸修飾探針，固定在電極表面為特異性探針，其中鎖核酸探針的5’端修飾有巰基，通過(guò)Au-S鍵的化學(xué)鍵合可將其固定到電極表面，鎖核酸探針與目標(biāo)基因的部分序列相互補(bǔ)，本發(fā)明獲得的電極為多重耐藥菌的檢測(cè)提供了全新思路和檢測(cè)手段。
【專利說(shuō)明】NDM-I鎖核酸探針修飾電極及其制備方法和應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于電化學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及NDM-I鎖核酸（Locked nucleic acid,LNA) 探針修飾電極，還涉及該電極的制備方法和應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 目前研究報(bào)道的傳感器表面固定的大多是DNA探針，存在諸多缺點(diǎn)。探針長(zhǎng)度一 般為20個(gè)堿基左右，DNA探針與較長(zhǎng)的祀序列雜交時(shí)，結(jié)合力不高，堿基錯(cuò)配識(shí)別能力低。 另外，由于單鏈DNA無(wú)法與未解旋的雙鏈祀序列直接結(jié)合，所W待檢測(cè)的標(biāo)本需經(jīng)PCR擴(kuò)增 后才能與之反應(yīng)。同時(shí)，NDM-I探針的反應(yīng)受離子強(qiáng)度的影響，酸性或堿性環(huán)境中DNA固定 數(shù)量最多，而中性條件下雜交效果最好，固定雙鏈探針比固定單鏈探針時(shí)雜交效果好，分析 原因可能是單鏈固定時(shí)會(huì)對(duì)雜交產(chǎn)生更大的空間障礙。眾多的研究者均未能很好地解決上 述問(wèn)題，從而無(wú)法提高DNA探針的特異性。而LNA的出現(xiàn)是解決W上問(wèn)題的理想途徑。
[0003] 鎖核酸是一種新型、特殊的雙環(huán)狀寡核巧酸衍生物，含有一個(gè)或多個(gè) 2' -0, 4' -C-亞甲基-B-D-巧喃核糖核酸單體，結(jié)構(gòu)中核糖的2' -0, 4' -C位通過(guò)不同的縮水 作用形成氧亞甲基橋、硫亞甲基橋或胺亞甲基橋，連接成環(huán)形，巧喃糖的結(jié)構(gòu)鎖定在C3內(nèi) 型的N構(gòu)型，形成了剛性的縮合結(jié)構(gòu)，降低了核糖體構(gòu)象的可塑性，增強(qiáng)了磯酸鹽骨架局部 結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，從而形成剛性縮合結(jié)構(gòu)。相比其他寡核巧酸，LNA具有諸多優(yōu)勢(shì)；（1)和DNA、 RNA互補(bǔ)的雙鏈有很強(qiáng)的熱穩(wěn)定性；（2)抗3'脫氧核巧酸酶降解的穩(wěn)定性；（3)LNA-DNA雜 交物能激活RNaseH ; (4)與RNA/DNA雜交時(shí)，具有較強(qiáng)的堿基錯(cuò)配識(shí)別力；(6)水溶性好； (7)高效的自動(dòng)寡聚化作用，合成方法簡(jiǎn)單。
[0004] NDM-I多重耐藥菌是指攜帶NDM-I耐藥基因的細(xì)菌。NDM-I耐藥酶其全稱是"新德 里金屬-目-內(nèi)醜胺酶"，是一種高效耐藥酶。研究顯示，抗生素濫用是NDM-I出現(xiàn)的首要原 因，目前DM-I多重耐藥菌正在全球快速傳播，其感染病例在全球均有分布，死亡率高。多重 耐藥菌所帶來(lái)的風(fēng)險(xiǎn)越來(lái)越大，防控形勢(shì)極為嚴(yán)峻，該類細(xì)菌對(duì)幾乎所有抗生素都具有抗 藥性。NDM-I耐藥基因可W在細(xì)菌之間傳播，從而使對(duì)抗生素敏感的細(xì)菌獲得耐藥性。因 此，研發(fā)NDM-I直接快速特異的檢測(cè)方法，具有重要意義。
[0005] 目前，NDM-I多重耐藥菌的診斷主要包括篩查、表型確認(rèn)和基因確證等3個(gè)步驟。 表型篩查是在細(xì)菌藥物敏感性測(cè)定中，W美洛培南或亞胺培南紙片法化-B法）或最低抑菌 濃度0OC)測(cè)定法對(duì)腸桿菌科細(xì)菌產(chǎn)酶情況進(jìn)行初步篩查；表型確認(rèn)是采用雙紙片協(xié)同實(shí) 驗(yàn)或亞胺培南（美洛培南）/邸TA復(fù)合紙片，進(jìn)行K-B法藥敏試驗(yàn)來(lái)判定產(chǎn)金屬酶；基因確 證是采用NDM-I的基因特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物測(cè)序，確定菌株是否攜帶NDM-I基因。 但該些診斷方法存在著費(fèi)時(shí)煩瑣、敏感性和特異性較低及檢測(cè)成本高等缺陷。
[0006] 電化學(xué)DNA生物傳感器具有分析時(shí)間短、設(shè)備微型化、特異性強(qiáng)、靈敏度高、檢測(cè) 限低、使用簡(jiǎn)單W及成本低廉等顯著優(yōu)點(diǎn)。目前電化學(xué)生物傳感器的研究主要是致力于提 高傳感器的特異性和靈敏度，而特異性和靈敏度在很大程度上受探針與互補(bǔ)鏈間的相互作 用影響，因此，利用LNA探針提高電化學(xué)生物傳感器的特異性是檢測(cè)NDM-I的基因的關(guān)鍵。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 有鑒于此，本發(fā)明的目的之一在于提供NDM-I鎖核酸探針修飾電極；本發(fā)明的目 的之二在于提供所述NDM-I鎖核酸探針修飾電極的制備方法；本發(fā)明的目的之H在于提供 含有檢測(cè)NDM-I的電化學(xué)生物傳感器；本發(fā)明的目的之四在于提供所述NDM-I鎖核酸探針 修飾電極或所述電化學(xué)傳感器的應(yīng)用；本發(fā)明的目的之五在于提供利用所述檢測(cè)NDM-I的 電化學(xué)生物傳感器檢測(cè)NDM-I基因的方法。
[000引為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：
[0009] 1、NDM-I鎖核酸探針修飾電極，所述電極是在金電極表面固定5'端修飾琉基的 NDM-ILNA探針，最后封閉非特異性吸附位點(diǎn)而得。
[0010] 優(yōu)選的，所述5'端修飾琉基的NDM-I鎖核酸探針的核巧酸序列如SEQ ID NO. 1所 /Jn O
[0011] 2、所述NDM-I鎖核酸探針修飾電極的制備方法，包括如下步驟：
[001引 a.將金電極打磨，拋光，清潔，干燥，得清潔的金電極，備用；
[0013] b.向步驟a所得清潔的金電極表面滴加含5'端修飾琉基的NDM-I LNA探針的溶 液，修飾后用琉基己醇溶液封閉，超純水清洗得NDM-I鎖核酸探針修飾電極。
[0014] 優(yōu)選的，步驟a是將金電極分別用0. 3 U m、0. 05 U m的Al2〇3粉末打磨拋光，每次打 磨后用水洗凈，再分別于硝酸、丙麗和超純水中各超聲洗涂，干燥，備用。
[0015] 優(yōu)選的，步驟b是向步驟a所得清潔的金電極表面滴加5'端修飾琉基的NDM-I LNA 探針濃度為0. 5?2. 5 y M的溶液，固定后用濃度為Immol/L的琉基己醇溶液封閉，清洗得 NDM-I鎖核酸探針修飾電極。
[0016] 更優(yōu)選的，所述5'端修飾琉基的NDM-I LNA探針的濃度為1. 5 y M。
[0017] 更優(yōu)選的，5'端修飾琉基的NDM-I LNA探針固定的條件為37C下恒溫1小時(shí)。
[0018] 3、檢測(cè)NDM-I的電化學(xué)生物傳感器，包括工作電極、對(duì)電極、參比電極和為測(cè)試底 液；所述工作電極為所述NDM-I鎖核酸探針修飾電極，所述對(duì)電極為笛電極，所述參比電極 為飽和甘隸電極，所述為測(cè)試底液為抑7.4的含2111111〇1/11(3化佑腳6-1(4。6化腳6和5111111〇1/1 KCl的PBS溶液。
[0019] 4、所述NDM-I鎖核酸探針修飾電極或所述檢測(cè)NDM-I的電化學(xué)生物傳感器在檢測(cè) NDM-I基因中的應(yīng)用。
[0020] 5、利用所述檢測(cè)NDM-I的電化學(xué)生物傳感器檢測(cè)NDM-I基因的方法，包括如 下步驟：將NDM-I鎖核酸探針修飾電極與樣品溶液雜交后，然后W NDM-I鎖核酸探針修 飾電極為工作電極，笛電極為對(duì)電極，飽和甘隸電極為參比電極，pH 7.4的含2mmol/L KjFe (CN) e-K/e (CN) e和5mmol/L KCl的PBS溶液為測(cè)試底液構(gòu)建電化學(xué)生物傳感器，采用 循環(huán)伏安法進(jìn)行掃描測(cè)定，電位掃描范圍為-0. 3V?0. 7V，電位掃描速率為50mv/s，根據(jù)雜 交前后峰電流變化檢測(cè)NDM-I基因。
[0021] 本發(fā)明的有益效果在于：本研究利用鎖核酸的高特異性，針對(duì)NDM-I全基因組，設(shè) 計(jì)針對(duì)NDM-I基因的LNA，將NDM-I LNA探針固定在金電極后獲得NDM-I鎖核酸探針修飾 電極，然后與電化學(xué)技術(shù)相融合獲得檢測(cè)NDM-I基因的電化學(xué)生物傳感器，從而構(gòu)建檢測(cè) NDM-I基因的技術(shù)平臺(tái)，為多重耐藥菌的檢測(cè)提供簡(jiǎn)單、快速、靈敏、特異的檢測(cè)工具。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[002引為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益效果更加清楚，本發(fā)明提供如下附圖：
[002引 圖1為不同修飾電極的循環(huán)伏安圖。a ;裸電極在抑7. 4含有2mmol/L K3Fe(CN)e-K/e(CN)e和5mmol/L KCl的PBS中循環(huán)伏安曲線；b ;電極表面修飾LNA探針后在 pH 7. 4 含有 2mmol/L Kg化（CN)e-K/e(CN)6 和 5mmol/L KCl 的 PBS 中循環(huán)伏安曲線；C ;LNA 探針修飾、琉基己醇封閉后的電極在抑7. 4含有2mmol/L K3化(CN) e-K4Fe (CN) e和5mmol/L KCl的PBS中循環(huán)伏安曲線；d ;檢測(cè)液中加入NDM-I祀序列后，電極在抑7. 4含有2mmol/ L KsFe(We-KJeKN)B和5mm0l/L KCl的PBS中循環(huán)伏安曲線；e ;裸電極在抑7. 4不含 2mmol/L K3Fe(CN)e-K/e(CN)e 和 5mmol/L KCl 的 PBS 中的循環(huán)伏安曲線。
[0024] 圖2為不同濃度探針修飾電極的循環(huán)伏安圖。

【具體實(shí)施方式】
[0025] 下面將結(jié)合附圖，對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)的描述。實(shí)施例中未注明具體 條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件或按照制造廠商所建議的條件。
[0026] 本發(fā)明的思路是利用鎖核酸的高特異性，針對(duì)NDM-I全基因組，設(shè)計(jì)并合成NDM-I LNA探針，并在LNA探針5'端修飾琉基，NDM-I LNA探針的序列為5' -SH-(Og。-gcttttggt K￡ct￡cctgat-3'(甜代表琉基基團(tuán)，下劃線部分堿基經(jīng)鎖核酸修飾）（SEQ ID NO. 1)，將LNA 技術(shù)與電化學(xué)技術(shù)相融合創(chuàng)建了用于檢測(cè)NDM-I基因的電化學(xué)DNA生物傳感器。具體方法 是；先設(shè)計(jì)針對(duì)NDM-I全系列的特異性LNA探針，并在LNA探針5'端修飾有琉基，利用Au-S 鍵的化學(xué)鍵合可將鎖核酸探針固定到電極表面；檢測(cè)時(shí)利用特異性探針與目標(biāo)基因的部分 序列相互補(bǔ)，當(dāng)雜交溶液中含有目標(biāo)基因時(shí)，特異性探針與其對(duì)應(yīng)的互補(bǔ)序列雜交形成復(fù) 合物，該復(fù)合物在電極表面發(fā)生還原-氧化反應(yīng)，從而產(chǎn)生電化學(xué)信號(hào)；如果雜交溶液中不 含目標(biāo)序列，則與特異性鎖核酸探針不能發(fā)生雜交反應(yīng)，所檢測(cè)的目標(biāo)基因無(wú)法通過(guò)雜交 修飾到電極表面，其產(chǎn)生電化學(xué)信號(hào)的強(qiáng)度很弱，同時(shí)還可W通過(guò)檢測(cè)電流信號(hào)大小來(lái)判 斷互補(bǔ)序列與錯(cuò)配序列。
[0027] 實(shí)施例1
[0028] NDM-I鎖核酸探針修飾電極的制備方法，包括如下步驟：
[002引 a.金電極的清洗：取直徑為3mm的金電極，分別用0. 3 y m、0. 05 U m的AI2O3粉末 打磨拋光成鏡面，每次打磨后均用超純水沖洗，再分別于硝酸、丙麗及超純水中各超聲洗涂 Smin，干燥，得清洗的金電極，備用。
[0030] b. LNA探針的固定；取20 y L 5'端修飾琉基的濃度為1. 5 y mol/L的NDM-I LNA 探針溶液滴加于已清洗的金電極表面，然后于37C下恒溫箱中恒溫1小時(shí)，使鎖核酸通過(guò) Au-S鍵的化學(xué)鍵合將其修飾到電極的表面，再將電極浸入濃度為Immol/L的琉基己醇溶 液中封閉非特異性吸附位點(diǎn)1小時(shí)，封閉后用水清洗電極，即得鎖核酸修飾NDM-I探針的 NDM-I電極，4°C避光保存?zhèn)溆谩?br> [0031] C.雜交反應(yīng)：將NDM-I LNA探針修飾電極分別浸泡在150 y 1終濃度為100 y g/L 的NDM-I祀序列溶液（pH7. 40. Imol/L PB巧中，于37°C恒溫雜交45分鐘。
[0032] 實(shí)施例2、組建檢測(cè)NDM-I的電化學(xué)生物傳感器
[0033] W NDM-I鎖核酸探針修飾電極作為工作電極，飽和甘隸電極為參比電極，笛電極 作為對(duì)電極組建檢測(cè)NDM-I的電化學(xué)生物傳感器。將制備好的電化學(xué)傳感器聯(lián)入電化學(xué)工 作站，W pH 7. 4 的含 2mmol/L KjFe (CN) e-K/e (CN) e，Smmol KCl 的 PBS 為測(cè)試底液，然后在 室溫下利用循環(huán)伏安法進(jìn)行掃描測(cè)定，工作電位為-0. 3V?0. 7V，掃描速度為50mV/s。檢測(cè) NDM-I的電化學(xué)生物傳感器的檢測(cè)原理為：利用NDM-I鎖核酸探針修飾電極表面發(fā)生雜交 反應(yīng)后，生成的雜交復(fù)合物阻礙了電極表面的電子傳遞，使傳感器響應(yīng)電流變化值增大。該 信號(hào)變化的大小A I與雜交反應(yīng)的程度呈正相關(guān)，A I值越大，表明與電極表面固定的LNA 探針結(jié)合的檢測(cè)物越多。NDM-I鎖核酸探針修飾電極測(cè)定的初始還原峰電流記為I。；當(dāng)核 酸雜交反應(yīng)結(jié)束后，測(cè)定的還原峰電流并記為I ;則峰電流在核酸雜交反應(yīng)前后變化A I = I - I。。W下W此原理為依據(jù)對(duì)NDM-I進(jìn)行檢測(cè)。
[0034] 實(shí)施例3、檢測(cè)NDM-I鎖核酸探針修飾電極的電化學(xué)特性
[0035] 利用循環(huán)伏安法表征電極在修飾及檢測(cè)過(guò)程中的電化學(xué)特性，具體檢測(cè)方法為： 將不同階段的電極按實(shí)施例2的方法組建電化學(xué)生物傳感器后，分別將電極浸泡在150 U L NDM-I祀序列終濃度為100 y g/L的溶液（pH7. 40. Imol/L磯酸鹽溶液）中，在37C恒溫箱 中雜交45分鐘。雜交過(guò)程中傳感器采用H電極體系測(cè)量傳感器電流，獲得的循環(huán)伏安曲線 如圖1所示。
[003引其中，曲線a為裸金電極在抑7. 4含有2mmol/L Ks [Fe (CN) 6] /? [Fe (CN) 6] 和5mmol/l KCl的PBS溶液中的循環(huán)伏安曲線，在PBS溶液中加入了氧化還原探針 IUFeKN)6]/KJFeKN)6]，所W循環(huán)伏安曲線出現(xiàn)了一對(duì)準(zhǔn)可逆的氧化還原峰；曲線b為 NDM-I 鎖核酸探針修飾電極在抑7. 4 含有 2mmol/L Ks [Fe (CN) e] /? [Fe (CN) e]和 5mmol/ I KCl的PBS溶液中的循環(huán)伏安曲線，由于鎖核酸探針的磯酸骨架帶負(fù)電荷，溶液中的 [Fe (CN) 6] 3-同樣帶有負(fù)電荷，同種電荷相排斥，導(dǎo)致[Fe (CN) 6] 3-的電子在金電極表面?zhèn)鬟f 速度減慢，在一定程度上阻礙了溶液中導(dǎo)電離子在電極表面的電子傳遞，因此氧化還原峰 的峰電流值有所降低，當(dāng)LNA探針修飾電極后，為了防止LNA"倒伏"在電極表面而出現(xiàn)非特 異吸附，而采用琉基己醇封閉非特異性吸附位點(diǎn)；曲線C為琉基己醇封閉后的循環(huán)伏安曲 線，可見琉基己醇在封閉非特異性吸附位點(diǎn)的同時(shí)也阻礙了電子的傳輸，因此峰電流值進(jìn) 一步減?。磺€d為NDM-I鎖核酸探針修飾電極與含100 y g/L的NDM-I的溶液反應(yīng)后的循 環(huán)伏安曲線，由于電極表面的雜交復(fù)合物是沒(méi)有電活性的生物大分子，進(jìn)一步阻礙了電極 表面的電子傳輸，與曲線C相比，氧化還原峰的峰電流在賠育前后響應(yīng)電流明顯降低；曲線 e為鎖核酸修飾NDM-I探針的NDM-I電極在抑7. 4不含2mmol/L Ks[Fe (CN) e] /? [Fe (CN) e] 和5mmol/l KCl的PBS中的循環(huán)伏安曲線，由于體系中缺少氧化還原活性物質(zhì)，在-0. 3V? 0. 7V掃描范圍內(nèi)，LNA探針修飾電極在PBS溶液中未出現(xiàn)明顯的氧化還原峰。W上實(shí)驗(yàn)結(jié) 果表明，NDM-I鎖核酸探針修飾電極能夠檢測(cè)NDM-I祀序列，并且組建的檢測(cè)NDM-I的電化 學(xué)生物傳感器也能檢測(cè)NDM-I祀序列。
[0037] -個(gè)檢測(cè)周期結(jié)束后，再進(jìn)行下一個(gè)LNA濃度的檢測(cè)，操作步驟同上。通過(guò)檢測(cè)反 應(yīng)前后響應(yīng)電流的變化，檢測(cè)終濃度分別為0. 5、1. 0、1. 5、2. 0、2. 5 y mol/L探針溶液進(jìn)行 雜交反應(yīng)所引起的A I及反應(yīng)所需時(shí)間。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取平均值，W驗(yàn)證傳感器的重復(fù)性。
[0038] 實(shí)施例4、LNA探針最佳濃度的優(yōu)化
[0039] 為了確定LNA探針的最佳濃度，本實(shí)施例對(duì)LNA的濃度進(jìn)行了優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。首先將 LNA探針溶液配制成濃度分別為0. 5 y M、I. O y M、I. 5 y M、2. O y M、2. 5 y M的溶液，然后分別 將它們修飾于金電極表面，制備成不同濃度NDM-I鎖核酸探針修飾電極，并測(cè)定其循環(huán)伏 安響應(yīng)電流，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2所示。結(jié)果顯示，修飾LNA探針前后電極的循環(huán)伏安曲線有明 顯改變，說(shuō)明探針已成功固定于電極上。從圖2還可W看出，LNA修飾的電極的電流響應(yīng)變 化值隨LNA探針濃度的增大呈先增大后下降的趨勢(shì)，當(dāng)LNA探針濃度由0. 5 y M依次增至 1. 5 y M時(shí)，響應(yīng)電流變化值呈上升的趨勢(shì)；而當(dāng)LNA探針濃度從1. 5 y M遞增至2. 5 y M時(shí)， 響應(yīng)電流變化值則呈遞減趨勢(shì)；其中，當(dāng)LNA探針濃度為1. 5 y M時(shí)，傳感器的響應(yīng)電流變化 值最大。因此，LNA探針的最佳濃度為1. 5 y M。
[0040] 實(shí)施例5、NDM-I電化學(xué)生物傳感器的靈敏度和特異性試驗(yàn)
[0041] 為了證實(shí)LNA探針的高特異性，選用LNA探針和DNA探針?lè)謩e與幾種不同匹配程 度的祀序列進(jìn)行雜交反應(yīng)，具體序列如下（下劃線部分堿基為錯(cuò)配堿基）：
[0042] (1)完全匹配（Tl) ;5,-atcaggcagccaccaaaagc-3，（SEQ ID NO. 2);
[0043] (2) 一個(gè)堿基錯(cuò)配（T2) ;5' -atca￡gcagccaccaaaagc_3'（SEQ ID NO. 3);
[0044] (3) H個(gè)堿基錯(cuò)配訂3) ;5' -atcaccgagccaccaaaagc-3' (SEQ ID NO. 4)；
[0045] (4)五個(gè)堿基錯(cuò)配（T4) 5' -atcaccgtcccaccaaaagc-3' (SEQ ID NO. 5)；
[0046] 上述四種不同祀序列，在最佳反應(yīng)條件下，分別與固定在電極表面上的LNA及DM 探針進(jìn)行雜交反應(yīng)，比較幾種不同情況下的電流變化差值A(chǔ) I之間的差異。結(jié)果顯示，當(dāng)與 完全互補(bǔ)的祀序列（Tl)雜交時(shí)，所引起的A I (峰電流變化差值）為11. 33 + 0. 47 uA，而 DNA探針雜交反應(yīng)所引起的A I為10. 27 + 0. 40 uA，二者相比具有顯著性差異（P<0. 05)。 當(dāng)祀序列有一個(gè)堿基錯(cuò)配（T2)時(shí)，LNA雜交所引起的A I值驟降至3. 37 + 0. 15 uA，而DNA 探針雜交反應(yīng)引起的A I值仍有9. 06 + 0. 49 y A，二者相比具有非常顯著性差異（P<0. 01)。 當(dāng)祀序列有H個(gè)堿基錯(cuò)配（T3)時(shí)LNA與祀序列結(jié)合峰電流的變化值極小，為0. 7 y A，但 DNA探針的A I值卻仍有6. 90 + 0. 36 uA，二者相比具有非常顯著性差異（P<0. 01)。當(dāng)祀 序列有五個(gè)堿基錯(cuò)配（T4)時(shí)LNA已無(wú)法與祀序列結(jié)合而檢測(cè)不到峰電流的變化，但DNA探 針的A I值卻仍有2. 26 + 0. 21 y A，二者相比具有非常顯著性差異（P<0. 01)。LNA與對(duì)應(yīng)的 NDM-I探針相比，其特異性明顯增強(qiáng)。產(chǎn)生上述結(jié)果的原因是LNA與核酸分子結(jié)合力強(qiáng)、特 異性高，且LNA/DNA、LNA/RNA的結(jié)合較DNA/DNA、DNA/RNA的雜交分子具有更高的熱穩(wěn)定性。 因此LNA與核酸序列的結(jié)合有著極高的特異性，LNA能夠區(qū)分正確配對(duì)及錯(cuò)配的序列，LNA 對(duì)互補(bǔ)DNA的錯(cuò)配容忍程度比相應(yīng)的DNA/DNA更低，本實(shí)施例中用LNA分別與祀序列雜交 時(shí)，發(fā)現(xiàn)與不同的祀序列發(fā)生雜交反應(yīng)所引起的峰電流變化有顯著差異，當(dāng)與錯(cuò)配H個(gè)堿 基的祀序列雜交，基本檢測(cè)不到峰電流的改變，和上述理論基本符合，說(shuō)明LNA對(duì)堿基錯(cuò)配 的識(shí)別能力強(qiáng)，用LNA作探針可大大提高核酸雜交檢測(cè)的特異性，同時(shí)由于LNA本身所具有 的優(yōu)越性，與普通的LNA相比可結(jié)合更多的祀序列，在一定程度上也可提高反應(yīng)的靈敏度。 兩種探針與不同互補(bǔ)程度的祀序列雜交反應(yīng)實(shí)時(shí)檢測(cè)結(jié)果見表1。
[0047] 表1、LNA和DNA探針與完全匹配及錯(cuò)配的祀序列雜交反應(yīng)結(jié)果P±S.D.)
[0048]

【權(quán)利要求】
1. NDM-1鎖核酸探針修飾的電極，其特征在于，所述電極是在金電極表面固定5'端修 飾疏基的NDM-1LNA探針，最后用疏基乙醇封閉非特異性吸附位點(diǎn)而得。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述NDM-1LNA探針修飾的電極，其特征在于：所述5'端修飾巰基 的NDM-1鎖核酸探針的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
3. 權(quán)利要求1或2所述NDM-1LNA探針修飾電極的制備方法，其特征在于：包括如下步 驟： a. 將金電極打磨，拋光，清潔，干燥，得清潔的金電極，備用； b. 向步驟a所得清潔的金電極表面滴加含5'端修飾巰基的NDM-1LNA探針溶液，修飾 完成后用巰基己醇溶液封閉，超純水清洗得NDM-1LNA探針修飾電極。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于：步驟a是將金電極分別用0. 3 μ m、 0. 05 μ m的A1203粉末打磨拋光，每次打磨后用超純水洗凈，再分別于硝酸、丙酮和超純水中 各超聲洗滌，干燥，備用。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于：步驟b是向步驟a所得清潔的金電 極表面滴加5'端修飾巰基的NDM-1LNA探針，濃度為0. 5?2. 5 μ Μ的溶液，修飾后用濃度 為lmmol/L的巰基己醇溶液封閉，清洗得NDM-1LNA探針修飾電極。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于：所述5'端修飾巰基的NDM-1LNA探 針的濃度為1. 5 μ M，所述鎖核酸的濃度為1. 5 μ M。
7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于：5'端修飾巰基的NDM-1LNA探針固定 的條件為37°C下恒溫1小時(shí)。
8. 檢測(cè)NDM-1的電化學(xué)生物傳感器，其特征在于：包括工作電極、對(duì)電極、參比電 極和測(cè)試底液；所述工作電極為權(quán)利要求1或2所述NDM-1LNA探針修飾電極，所述對(duì) 電極為鉬電極，所述參比電極為飽和甘萊電極，所述為測(cè)試底液為pH7. 4的含2mmol/ LK3Fe (CN) 6-K4Fe (CN) 6 和 5mmol/L KC1 的 PBS 溶液。
9. 權(quán)利要求1?2任一項(xiàng)所述NDM-1LNA探針修飾電極或權(quán)利要求8所述檢測(cè)NDM-1 的電化學(xué)生物傳感器在檢測(cè)NDM-1基因中的應(yīng)用。
10. 利用權(quán)利要求8所述檢測(cè)NDM-1的電化學(xué)生物傳感器檢測(cè)NDM-1基因的方法，其 特征在于，包括如下步驟：將NDM-1LNA探針修飾電極與樣品溶液雜交后，然后以NDM-1LNA 探針修飾電極為工作電極，鉬電極為對(duì)電極，飽和甘汞電極為參比電極，PH7. 4的含2mmol/ LK3Fe (CN) 6-K4Fe (CN) 6和5mmol/L KC1的PBS溶液為測(cè)試底液構(gòu)建電化學(xué)生物傳感器，采用 循環(huán)伏安法進(jìn)行掃描測(cè)定，電位掃描范圍為-〇. 3V?0. 7V，電位掃描速率為50mv/s，根據(jù)雜 交前后峰電流變化檢測(cè)NDM-1基因。
【文檔編號(hào)】G01N27/327GK104237353SQ201410557136
【公開日】2014年12月24日 申請(qǐng)日期:2014年10月20日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月20日
【發(fā)明者】張立群, 王云霞, 府偉靈 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院