一種吡咯基氟硼二吡咯化合物的合成方法及應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明涉及將微生物合成方法與化學(xué)合成方法領(lǐng)域，具體涉及一種吡咯基氟硼二吡咯化合物的合成方法及應(yīng)用,本發(fā)明中的通過微生物粘質(zhì)沙雷氏菌Serratia marcescens y2發(fā)酵產(chǎn)生的三吡咯化合物，母環(huán)7位為甲氧基，3位為甲基和2位為戊烷基的靈菌紅素（PG）。PG氟硼化后得到的熒光染料4,4?二氟?2?戊烷基?3?甲基?5?吡咯基?7?甲氧基?BODIPY可以透過細(xì)胞膜，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)特異染色細(xì)胞器。本發(fā)明獲得熒光染料經(jīng)生物合成與化學(xué)合成結(jié)合的方案，生產(chǎn)及環(huán)境成本低，熒光結(jié)構(gòu)特異性，并可特異性進(jìn)入穿透細(xì)胞膜染色細(xì)胞質(zhì)中細(xì)胞器，不與細(xì)胞核結(jié)合，無細(xì)胞毒性可作為活細(xì)胞示蹤熒光染料。CCTCC M 201617620160405
【專利說明】
一種吡咯基氟硼二吡咯化合物的合成方法及應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及將微生物合成方法與化學(xué)合成方法緊密結(jié)合，將一種微生物的次級(jí)代 謝產(chǎn)物合成為生物學(xué)研究用的熒光染料，一種透過細(xì)胞膜，可以特異性結(jié)合動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)細(xì) 胞器的無細(xì)胞毒性熒光染料。
【背景技術(shù)】
[0002] 靈菌紅素具有低細(xì)胞毒作用，對(duì)腫瘤細(xì)胞作出多方面的攻擊，濃度大于300nM時(shí)具 有明顯的淋巴細(xì)胞抑制作用。靈菌紅素對(duì)一系列的癌細(xì)胞，如肺，結(jié)腸，腎和乳房的癌細(xì)胞 系具有促凋亡作用。
[0003] 氟硼吡咯類化合物(B0DIPY)是一類具有剛性結(jié)構(gòu)的有機(jī)化合物，因大部分化合物 具有較高的熒光量子產(chǎn)率，較窄的熒光發(fā)射光譜，較好的光熱及化學(xué)穩(wěn)定性，較小的分子 質(zhì)量和較低的細(xì)胞毒性而促使科研工作者將其研制成化學(xué)傳感器，熒光探針，長(zhǎng)波熒光染 料等功能性物質(zhì)。
[0004] 關(guān)于B0DIPY的化學(xué)合成方法已日益成熟，1988年，Richard等人利用吡咯醛縮合而 成，其他常用方法包括醛與吡咯縮合再氧化配位、酰氯或酸酐與吡咯的縮合配位、吡咯醛自 身縮合配位以及α、β不飽和酮硝化、成環(huán)再縮合，配位等。2012年，焦麗娟等人從吡咯醛 及吡咯出發(fā)合成一系列帶有吡咯基的長(zhǎng)波長(zhǎng)氟硼二吡咯化合物，很大程度上簡(jiǎn)化了反應(yīng)的 步驟。但以上合成反應(yīng)無一例外在合成聚吡咯類骨架時(shí)都是以醛或吡咯醛類等有毒性有機(jī) 化合物為底物。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于利用本發(fā)膽所提供的產(chǎn)靈菌紅素的微生物粘質(zhì)沙雷氏菌 ?Serraiia ?arcesce/3s y2出發(fā)，將生物合成與化學(xué)合成銜接，以y2為基礎(chǔ)，嘗試新型培養(yǎng)基 大量得到其次級(jí)代謝產(chǎn)物靈菌紅素，最大限度提取后（1.1 g/L，柱層析產(chǎn)率）;本發(fā)明篩選 出最佳化學(xué)反應(yīng)條件對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾，得到熒光染料吡咯基氟硼二吡咯化合物。在此過 程中，一步化學(xué)反應(yīng)即可完成B0DIPY的合成，還不使用醛類化合物作為底物，減少了過程反 應(yīng)中產(chǎn)物的損失，提高了整個(gè)過程產(chǎn)率，拓展了合成方法范圍。核磁，質(zhì)譜，紅外確定其結(jié)構(gòu) 后，將其應(yīng)用于（胃癌BGC-823細(xì)胞株)細(xì)胞的染色，發(fā)現(xiàn)可以對(duì)細(xì)胞器進(jìn)行熒光染色，且對(duì) 細(xì)胞無毒性。
[0006] 本發(fā)明涉及一株產(chǎn)紅色素粘質(zhì)沙雷氏菌y2 (保藏單位：中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中 心;保藏地址：中國(guó)武漢，武漢大學(xué);保藏編號(hào):CCTCC Μ 2016176;保藏時(shí)間：2016年4月5號(hào)， 分類命名為:粘質(zhì)沙雷氏菌Sferraiia ?arcesce/3s y2)，及其產(chǎn)靈菌紅素經(jīng)一步化學(xué)反應(yīng)生 成熒光染料B0DIPY(4，4-二氟-2-戊烷基-3-甲基-5-吡咯基-7-甲氧基），該熒光染料具有特 征戊烷基，應(yīng)用于腫瘤細(xì)胞染色能進(jìn)行細(xì)胞膜，與細(xì)胞器結(jié)合，不與細(xì)胞核結(jié)合;無毒能用 于活細(xì)胞示蹤觀察。
[0007] 所述的一株產(chǎn)紅色素粘質(zhì)沙雷氏菌y2,其特征在于:其16 S序列： aggcgctgtcttacacgtgcggtcgagtggtagcacaagggagcttgctcttgggtgacgagcggcggatggg aaagtaatgtctgggaaactggctgatggagggggataactactgtaaacggtagctaagaccgcataacgtcgcaa gacctaagagggggaccttcgggcctcttgccatcagatgtgcccagatgggattagctagtaggtggggtaatggc tcacctaggcgacgatccctagctggtctgagaggatgaccagccacactggaactgagacacggtccagactecta cgggaggcagcagtggggaatattgcacaatgggcgcaagcctgatgcagccatgccgcgtgtgtgaagaaggcctt cgggttgtaaagcactttcagcgaggaggaaggtggtgagcttaatacgctcatcaattgacgttactcgcagaaga agcaccggctaactccgtgccagcagccgcggtaatacggagggtgcaagcgttaatcggaattactgggcgtaaag cgcacgcaggcggtttgttaagtcagatgtgaaatccccgggctcaacctgggaactgcatttgaaactggcaagct agagtctcgtagaggggggtagaattccaggtgtagcggtgaaatgcgtagagatctggaggaataccggtggcgaa ggcggccccctggacgaagactgacgctcaggtgcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtcc acgctgtaaacgatgtcgatttggaggttgtgcccttgaggcgtggcttccggagctaacgcgttaaatcgaccgcc tggggagtacggccgcaaggttaaaactcaaataaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaat tcgatgcaacgcgaagaaccttacctactcttgacatccagagaactttccagagatggattggtgccttcgggaac tctgagacaggtgctgcatggctgtcgtcgctcgtgttgtgaaatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaaccct tatcctttgttgccagcggttcggccgggaactcaaaggagactgccagtgataaactggaggaaggtggggatgac gtcaagtcatcatggcccttacgagtagggctacacacgttctacaatggcgtatacaaagagaagcgacctcgcga gagcaagcggacctcataaagtaagtcgtagtccggattggagtctgcaactcgactccatgaagtcggaatcgcta gtaatcgtagatcagaatgctacggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccatgggagtggg ttgcaaaagaagtaggtagcttaaccttcgggagggcgctagcactttgat 所述的一株產(chǎn)紅色素粘質(zhì)沙雷氏菌y2，其代謝生產(chǎn)靈菌紅素的方法如下： 從保藏斜面培養(yǎng)基（牛肉膏18 g/L，蔗糖20 g/L，氯化鈣1.1 g/L，瓊脂20 g/L)上挑取 單菌落，轉(zhuǎn)接液體培養(yǎng)基(牛肉膏18 g/L，蔗糖20 g/L，氯化鈣1.1 g/L)，28 °C條件下以200 r/min的轉(zhuǎn)速搖床培養(yǎng)24 h，按5%的接種體積另行擴(kuò)大培養(yǎng)64 h，250 mL三角瓶培養(yǎng)基裝液 量為100mL。固體培養(yǎng)在直徑9 cm培養(yǎng)皿中進(jìn)行，吸取種子培養(yǎng)液300 yL，涂布均勻，28 °C 培養(yǎng)24 h，最大得率。
[0008] 所述的一株產(chǎn)紅色素粘質(zhì)沙雷氏菌y2,其產(chǎn)生的靈菌紅素的萃取方法： 將發(fā)酵液1000 Hz離心15 min，收集分為固液兩相，分別加入50 ml乙醇超聲助溶解5 min，再加入25 ml CH2CI2,最后加入25 ml水，待溶液分層后，萃取。
[0009] 當(dāng)有機(jī)相再不能進(jìn)行進(jìn)一步的提取時(shí)，收集菌體再進(jìn)行離心，萃取，重復(fù)幾次直至 菌體接近無色。液體萃取同樣進(jìn)行萃取，薄層層析檢測(cè)至無靈菌紅素后結(jié)束萃取。有機(jī)相收 集干燥，減壓蒸餾等得粗提物，整個(gè)過程應(yīng)注意避光。
[0010]所述的一株產(chǎn)紅色素粘質(zhì)沙雷氏菌y2,其產(chǎn)生的靈菌紅素的分離純化方法： 濕法裝柱，用CH2C12溶解靈菌紅素粗提物直接上樣。
[0011] 干法裝柱，用CH2C12溶解靈菌紅素粗提物，加入柱層析硅膠，減壓除溶劑，得負(fù)載固 體，上樣。洗脫劑為石油醚與二氯甲烷體積比為1/1的混合系，柱層析過程中，靈菌紅素主要 產(chǎn)物呈鮮紅色的條帶，容易區(qū)分。得到的紅色洗脫液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中45°C減壓濃縮，烘干 后-80°C冷凍過夜，隨后冷凍干燥24h，置于_80°C冰箱中凍存?zhèn)溆谩?br>[0012] 所述的一株產(chǎn)紅色素粘質(zhì)沙雷氏菌y2,以其產(chǎn)生靈菌紅素一步化學(xué)反應(yīng)生成熒光 染料B0DIPY條件： 反應(yīng)過程:在lOOmL圓底燒瓶中加入靈菌紅素（lmmol)，CH2C12 30mL，攪拌溶解或混合均 勻，再加入三乙胺1.4ml，反應(yīng)混合物在-10°C下用注射器逐滴加入BF3'Et20 1.4ml，磁力攪 拌反應(yīng)lOmin后，升溫至30°C，反應(yīng)4小時(shí)后結(jié)束，反應(yīng)完成后加入蒸餾水淬滅，有機(jī)相用 Et20 (3 X 5mL)萃取，無水硫酸鎂干燥，過濾，減壓濃縮除溶劑。柱層析純化(CH2C12: PE=1: 10)得2(56%)。反應(yīng)條件篩選，產(chǎn)物用高效液相檢測(cè)：C18反相柱(Eclipse plus C18, 4.6 x 1 00mm)，液相條件(H2〇:CH3〇H:PH=2的磷酸緩沖溶液=15:80:5)，ti=2 · 4min，t2=12min。 [0013] 優(yōu)化后反應(yīng)條件:CH2C12為溶劑，Et3N與BF3'Et 20為10eq，在30°C下反應(yīng)4小時(shí)為最 佳條件來合成目標(biāo)化合物。
[0014]反應(yīng)化學(xué)式見圖2。 所述的一株產(chǎn)紅色素粘質(zhì)沙雷氏菌y2,以其產(chǎn)生靈菌紅素化學(xué)反應(yīng)所得的B0DIPY(化 合物2)結(jié)構(gòu)特征:經(jīng)核磁共振。^、々、^(^、質(zhì)譜^工外與紫外光譜測(cè)試"亥化合物的結(jié)構(gòu)鑒 定4,4_二氟-2-戊烷基-3-甲基-5-吡咯基-7-甲氧基，是具有立體結(jié)構(gòu)的氟硼化合物（經(jīng) NMR、IR、LC-MS測(cè)試），1號(hào)氫與8號(hào)氫原子相關(guān)，化合物處于順式，具有五烷基。
[0015]所述的一株產(chǎn)紅色素粘質(zhì)沙雷氏菌y2,以其產(chǎn)生靈菌紅素化學(xué)反應(yīng)所得的B0DIPY (化合物2 )用于細(xì)胞染色的方法： 離心收集細(xì)胞樣品于1.5 ml離心管內(nèi)，加入lml固定液重懸細(xì)胞，4°C固定10分鐘或者 更長(zhǎng)時(shí)間。離心去固定液，用PBS洗1遍，洗滌期間手動(dòng)晃動(dòng)。去上清，加入lml PBS或完全培 養(yǎng)液重懸細(xì)胞，再加入5ul濃度為lmg/ml B0DIPY置于37°C染色20-30分鐘。離心去2染料，加 入50-100ul PBS重懸細(xì)胞，并去5-10ul滴于潔凈載玻片上，蓋上潔凈蓋玻片，盡量避免產(chǎn)生 氣泡。熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡下檢測(cè)。激發(fā)波長(zhǎng)為340 nm，480 nnuUV下可持續(xù) lmin,染色1.5 h小時(shí)即可持續(xù)30min分鐘。
[0016]在熒光顯微鏡下觀察，B0DIPY(化合物2)染色效果明顯好于PG。但在熒光顯微鏡下 未能分辨出其染色部位。在激光共聚焦顯微鏡對(duì)其進(jìn)行觀察，三種波長(zhǎng)下（560 nm、500 nm 和365 nm)，觀察到B0DIPY(化合物2)對(duì)BGC-823的細(xì)胞器染色清晰;染色結(jié)果在能在顯微鏡 下看到明亮的紅、綠、藍(lán)色熒光。不特異性染色細(xì)胞核。
[0017] 所述的一株產(chǎn)紅色素粘質(zhì)沙雷氏菌y2,以其產(chǎn)生靈菌紅素化學(xué)反應(yīng)所得的B0DIPY (化合物2 )對(duì)細(xì)胞無毒，能用于細(xì)胞活性染色，示蹤觀察。
[0018] 不同濃度染色劑PG和B0DIPY(化合物2)對(duì)BGC-823細(xì)胞存活率的影響，采用 Biotool Cell Counting Kit_8 (CCK-8)試劑盒完成，0.0001-0.01 mg/ml作用濃度范圍 內(nèi)，作用時(shí)間為48小時(shí)，原反應(yīng)物靈菌紅素(PG)具有毒性，實(shí)驗(yàn)所選濃度范圍內(nèi)，隨著作用 濃度增大，細(xì)胞存活率下降，濃度為〇. 〇lmg/ml時(shí)，細(xì)胞存活率只有4%;但B0DIPY(化合物2) 未顯不毒性。
【附圖說明】
[0019] 圖1細(xì)菌培養(yǎng)時(shí)間產(chǎn)色素及存化后PG層析圖（1，混合體系;2,培養(yǎng)時(shí)間72 h; 3， PG ) 圖2反應(yīng)化學(xué)式(其中反應(yīng)物成分1為靈菌紅素 PG;產(chǎn)物化合物2為熒光化合物B0DIPY) 圖3條件篩選的液相圖（表一 Entry 1) 圖4條件篩選的液相圖（表一 Entry 2) 圖5條件篩選的液相圖（表一 Entry 4) 圖6化合物2的立體結(jié)構(gòu) 圖7化合物2的19F NMR，溶劑為CDC13 圖8化合物2的1H NMR，溶劑為CDC13 圖9化合物2的13C NMR，溶劑為CDC13 圖10化合物2的NOESY圖 圖11化合物2的紅外圖 圖12化合物2的LC-MS圖· 圖13化合物2的裂解圖 圖14熒光顯微鏡下化合物1(PG)對(duì)細(xì)胞的染色效果 圖15熒光顯微鏡下化合物2對(duì)細(xì)胞的染色效果 圖16激光共聚焦掃描顯微鏡下BODIPY2對(duì)細(xì)胞的染色效果 圖17 PG和BODIPY(化合物2)對(duì)BGC-823細(xì)胞存活率的影響。
【具體實(shí)施方式】
[0020] 以下實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。在不背離 本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對(duì)本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改和替換，均屬于本發(fā)明 的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。
[0021] 實(shí)施例1 (1)粘質(zhì)沙雷氏菌yS^ei-raiia ?a_rcesce/3s y2)的分離鑒定： 本發(fā)明涉及一株產(chǎn)紅色素粘質(zhì)沙雷氏菌y2，由2007年5月從南京市郊田野麥田表面分 離獲得，保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心;保藏編號(hào):CCTCC Μ 2016176;保藏時(shí)間：2016年4 月5號(hào)，分類命名為:粘質(zhì)沙雷氏菌ferraiia ?arcescaos y2)，及其產(chǎn)靈菌紅素經(jīng)一步化學(xué) 反應(yīng)生成熒光染料B0DIPY(4，4-二氟-2-戊烷基-3-甲基-5-吡咯基-7-甲氧基），該熒光染料 具有特征戊烷基，應(yīng)用于腫瘤細(xì)胞染色能進(jìn)行細(xì)胞膜，與細(xì)胞器結(jié)合;無毒能用于活細(xì)胞示 蹤觀察。
[0022]所述的一株產(chǎn)紅色素粘質(zhì)沙雷氏菌y2,其特征在于:其16 S序列： aggcgctgtcttacacgtgcggtcgagtggtagcacaagggagcttgctcttgggtgacgagcggcggatggg aaagtaatgtctgggaaactggctgatggagggggataactactgtaaacggtagctaagaccgcataacgtcgcaa gacctaagagggggaccttcgggcctcttgccatcagatgtgcccagatgggattagctagtaggtggggtaatggc tcacctaggcgacgatccctagctggtctgagaggatgaccagccacactggaactgagacacggtccagactecta cgggaggcagcagtggggaatattgcacaatgggcgcaagcctgatgcagccatgccgcgtgtgtgaagaaggcctt cgggttgtaaagcactttcagcgaggaggaaggtggtgagcttaatacgctcatcaattgacgttactcgcagaaga agcaccggctaactccgtgccagcagccgcggtaatacggagggtgcaagcgttaatcggaattactgggcgtaaag cgcacgcaggcggtttgttaagtcagatgtgaaatccccgggctcaacctgggaactgcatttgaaactggcaagct agagtctcgtagaggggggtagaattccaggtgtagcggtgaaatgcgtagagatctggaggaataccggtggcgaa ggcggccccctggacgaagactgacgctcaggtgcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtcc acgctgtaaacgatgtcgatttggaggttgtgcccttgaggcgtggcttccggagctaacgcgttaaatcgaccgcc tggggagtacggccgcaaggttaaaactcaaataaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaat tcgatgcaacgcgaagaaccttacctactcttgacatccagagaactttccagagatggattggtgccttcgggaac tctgagacaggtgctgcatggctgtcgtcgctcgtgttgtgaaatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaaccct tatcctttgttgccagcggttcggccgggaactcaaaggagactgccagtgataaactggaggaaggtggggatgac gtcaagtcatcatggcccttacgagtagggctacacacgttctacaatggcgtatacaaagagaagcgacctcgcga gagcaagcggacctcataaagtaagtcgtagtccggattggagtctgcaactcgactccatgaagtcggaatcgcta gtaatcgtagatcagaatgctacggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccatgggagtggg ttgcaaaagaagtaggtagcttaaccttcgggagggcgctagcactttgat (2)粘質(zhì)沙雷氏菌y2,其代謝生產(chǎn)靈菌紅素的培養(yǎng)方法 從保藏斜面培養(yǎng)基（牛肉膏18 g/L，蔗糖20 g/L，氯化鈣1.1 g/L，瓊脂20 g/L)上挑取 單菌落，轉(zhuǎn)接液體培養(yǎng)基(牛肉膏18 g/L，蔗糖20g/L，氯化鈣1.1 g/L)，28 °C條件下以200 r/min的轉(zhuǎn)速搖床培養(yǎng)24 h，按5%的接種體積另行擴(kuò)大培養(yǎng)64 h，250 mL三角瓶培養(yǎng)基裝液 量為100mL。固體培養(yǎng)在直徑9 cm培養(yǎng)皿中進(jìn)行，吸取種子培養(yǎng)液300 yL，涂布均勻，28 °C 培養(yǎng)24 h(圖1中1、2)。
[0023] (3)粘質(zhì)沙雷氏菌y2產(chǎn)生的靈菌紅素的萃取 將發(fā)酵液1000 Hz離心15 min，收集分為固液兩相，分別加入50 ml乙醇超聲助溶解5 min，再加入25 ml CH2CI2,最后加入25 ml水，待溶液分層后，萃取。
[0024]當(dāng)有機(jī)相再不能進(jìn)行進(jìn)一步的提取時(shí)，收集菌體再進(jìn)行離心，萃取，重復(fù)幾次直至 菌體接近無色。液體萃取同樣進(jìn)行萃取，薄層層析檢測(cè)至無靈菌紅素后結(jié)束萃取。有機(jī)相收 集干燥，減壓蒸餾等得粗提物，整個(gè)過程應(yīng)注意避光。
[0025] (4)粘質(zhì)沙雷氏菌y2產(chǎn)生的靈菌紅素的分離純化 濕法裝柱，用CH2C12溶解靈菌紅素粗提物直接上樣。
[0026]干法裝柱，用CH2C12溶解靈菌紅素粗提物，加入柱層析硅膠，減壓除溶劑，得負(fù)載固 體，上樣。洗脫劑為石油醚與二氯甲烷體積比為1/1的混合系，柱層析過程中，靈菌紅素主要 產(chǎn)物呈鮮紅色的條帶，容易區(qū)分。得到的紅色洗脫液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中45°C減壓濃縮，烘干 后-80 °C冷凍過夜，隨后冷凍干燥24 h，置于-80 °C冰箱中凍存?zhèn)溆茫▓D1中3)。
[0027] (5)化學(xué)反應(yīng)(反應(yīng)式1)過程 在100 mL圓底燒瓶中加入1(1 mmol)，CH2Cl2 30 mL，攪拌溶解或混合均勻，再加入三乙 胺1.4 ml，反應(yīng)混合物在-10 °C下用注射器逐滴加入BF3'Et20 1.4 ml，磁力攪拌反應(yīng)10 min后，升溫至30 °C，反應(yīng)4小時(shí)后結(jié)束，反應(yīng)完成后加入蒸餾水淬滅，有機(jī)相用Et20 (3X5 mL)萃取，無水硫酸鎂干燥，過濾，減壓濃縮除溶劑。柱層析純化(CH2C12: PE=1:10)得2(56%)。 反應(yīng)條件篩選（圖3);產(chǎn)物用高效液相檢測(cè):C18反相柱，Eclipse plus C18, 4.6 X 100mm (H2〇:CH3OH:PH=2的磷酸緩沖溶液=15:80:5)，ti=2.4 min，t2=12 min。
[0028] (6)反應(yīng)物的量篩選過程 首先，我們對(duì)反應(yīng)物的量進(jìn)行篩選(表1);不添加催化劑三乙胺的話(Entry 5)，發(fā)現(xiàn)反 應(yīng)不能進(jìn)行，加入等摩爾的三乙胺與三氟化硼（Entry 1)反應(yīng)幾乎沒有進(jìn)行，加入10 eq (Entry 2)反應(yīng)達(dá)到最好（圖4)，但加入20 eq(Entry 3)時(shí)反應(yīng)就開始有所降低。由此，我們 可以得出三乙胺作為吡咯氫的活化劑，需要和三氟化硼相同的量（10 eq)，才能使反應(yīng)更好 的進(jìn)行，單獨(dú)升高或減少其中一個(gè)化合物的量(Entry 4、6)，都不能得到更高的產(chǎn)率。
[0029]反應(yīng)式1 B0DIPY(化合物2)的合成方法(見圖2) 表1不同反應(yīng)物的量對(duì)產(chǎn)率的影響
[а] 由HPLC所得 (б) 反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間、溶劑的篩選(表2) 隨后，我們進(jìn)行了溫度的篩選，在_l〇°C條件下(Entry 1)，不能反應(yīng)，隨著溫度的升高， 產(chǎn)率也慢慢有所提高(Entry 2、3、4)(圖5)，到30°C產(chǎn)率達(dá)到最高(Entry 5)。40 °C時(shí)產(chǎn)率 反而下降，雜質(zhì)增多。在確定溫度后又對(duì)反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行篩選，得出最佳反應(yīng)時(shí)間為4小時(shí)。太 短的反應(yīng)時(shí)間反應(yīng)產(chǎn)量比較低(Entry 7、8)反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)至6小時(shí)(Entry 9)，產(chǎn)率反而有 所下降；特別是延長(zhǎng)12小時(shí)(Entry 10)，而體系又不加密封時(shí)(Entry 11)，生成的氟硼化合 物竟然分解。在進(jìn)行溶劑的篩選時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)CH2C12較其它溶劑甲醇，Et 20，EA，CH3⑶CH3 (Entry 12、13、14、15、16)的產(chǎn)率高。最終，我們確定以〇12(：12為溶劑4七必與8? 3飛^0為10 eq，在30 °C下反應(yīng)4小時(shí)為最佳條件來合成目標(biāo)化合物。
[0030]表2反應(yīng)條件的篩選
[a]由HPLC所得 實(shí)施例2 BODIPY(化合物2)的結(jié)構(gòu)鑒定 與其他文獻(xiàn)不同，我們得到的沙雷氏菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物靈菌紅素是支鏈為五烷基的靈 菌紅素。在進(jìn)行氟硼化后，我們甚至可以得到具有立體結(jié)構(gòu)的氟硼化合物（圖6)。分析結(jié)構(gòu) 應(yīng)用了 NMR、IR、LC-MS測(cè)試實(shí)驗(yàn)，如圖7、8、9、10、11、12。就是說1號(hào)氫與8號(hào)氫原子相關(guān)，化合 物處于順式(圖6，裂解方式見13 )，該成分具有五烷基。
[0031] 實(shí)施例3: 染色應(yīng)用 (1)染色方法 離心收集細(xì)胞（胃癌細(xì)胞株BGC-823)于1.5 ml離心管內(nèi)，加入1 ml固定液重懸細(xì)胞，4 °C固定10分鐘或者更長(zhǎng)時(shí)間。離心去固定液，用PBS洗1遍，洗滌期間手動(dòng)晃動(dòng)。離心去上清， 加入lml PBS或完全培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，再加入5ul濃度為lmg/ml B0DIPY(化合物2)置于37 °C染色20-30分鐘。離心去染料，加入50-100 ul PBS重懸細(xì)胞，并去5-10 ul滴于潔凈載玻 片上，蓋上潔凈蓋玻片，盡量避免產(chǎn)生氣泡，化合物PG的染色方法相同。熒光顯微鏡或激光 共聚焦顯微鏡下檢測(cè)。
[0032] (2)染色條件優(yōu)化 在篩選染色條件時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)細(xì)胞與2染色10 min，在熒光顯微鏡UV照射下，不到10 s， 就完全淬滅。染色20 min時(shí)，UV下可持續(xù)1 min,染色1.5 h小時(shí)即可持續(xù)30min分鐘以上，與 染色2 d效果基本一致。
[0033]如圖15，在熒光顯微鏡，能清楚地觀察它的染色效果（效果明顯好于PG圖14)。但在 熒光顯微鏡下我們不能分辨出其染色部位。于是，我們選擇了激光共聚焦顯微鏡對(duì)其進(jìn)行 觀察，三種激發(fā)波長(zhǎng)下（560 nm、500 nm和365 nm)，我們可以清楚地觀察到其對(duì)細(xì)胞器進(jìn)行 染色（圖16)。
[0034] (3)PG和B0DIPY(化合物2)細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn) 不同濃度染色劑PG和B0DIPY(化合物2)對(duì)BGC-8 2 3細(xì)胞存活率的影響，采用 BiotoolCellCountingKit-8 (CCK-8)試劑盒完成，在 0.0001-0.01 mg/ml作用濃度范圍 內(nèi)，作用時(shí)間為48 h;原反應(yīng)物靈菌紅素（PG)具有毒性，實(shí)驗(yàn)所選濃度范圍內(nèi)，隨著作用濃 度增大，細(xì)胞存活率下降，濃度為0.01 mg/ml時(shí)，細(xì)胞存活率只有4%;但B0DIPY(化合物2)未 顯示毒性（圖17)。該實(shí)驗(yàn)表明了本發(fā)明中的化合反應(yīng)使得原反應(yīng)物PG，這一對(duì)腫瘤細(xì)胞有 毒性的色素，經(jīng)一步法反應(yīng)生成的B0DIPY類化合物2，有了熒光染料的特征，其特征還體現(xiàn) 在該染料不但能透過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞，特異性染色細(xì)胞器，但不特異性著色細(xì)胞核;進(jìn)一 步，其特征還體現(xiàn)在本發(fā)明生成的B0DIPY類化合物2又去除了原反應(yīng)物PG的細(xì)胞毒性，具有 了新的活細(xì)胞示蹤染料的特性。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一株產(chǎn)紅色素粘質(zhì)沙雷氏菌ferraiia ?arcescaos y2，中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心； 保藏編號(hào):CCTCC M 2016176。2. 權(quán)利要求1所述的一株產(chǎn)紅色素粘質(zhì)沙雷氏菌《Serraiia ?arcesce/3s y2,其產(chǎn)生的 色素靈菌紅素經(jīng)一步化學(xué)反應(yīng)合成BODIPY類化合物(4，4-二氟-2-戊烷基-3-甲基-5-吡咯 基-7-甲氧基-B0DIPY)的方法。3. 權(quán)利要求2所述的一株產(chǎn)紅色素粘質(zhì)沙雷氏菌ferraiia ?arcesce/3s y2,其發(fā)酵產(chǎn) 生色素靈菌紅素用SCN培養(yǎng)基（牛肉膏18 g/L，蔗糖20 g/L，氯化鈣1.1 g/L)最大產(chǎn)率1.1 g/L(柱層析產(chǎn)率)。4. 權(quán)利要求2所述的一株產(chǎn)紅色素粘質(zhì)沙雷氏菌《Serraiia ?arcesce/3s y2,其產(chǎn)生的 色素靈菌紅素經(jīng)一步化學(xué)反應(yīng)合成BODIPY類化合物(4，4-二氟-2-戊烷基-3-甲基-5-吡咯 基-7-甲氧基-B0DIPY)，其一步化學(xué)反應(yīng)條件為：以CH 2Cl2為溶劑，催化劑Et3N與反應(yīng)物 BF3'Et20為I Oeq，在30 °C下反應(yīng)4小時(shí)。5. 權(quán)利要求2所述的BODIPY類化合物(4，4-二氟-2-戊烷基-3-甲基-5-吡咯基-7-甲氧 基-B0DIPY)具有特征集團(tuán)戊烷基，能特異性進(jìn)入穿透細(xì)胞膜染色細(xì)胞質(zhì)中細(xì)胞器，不染色 細(xì)胞核。6. 權(quán)利要求2所述的BODIPY類化合物(4，4-二氟-2-戊烷基-3-甲基-5-吡咯基-7-甲氧 基-B0DIPY)對(duì)細(xì)胞無毒，用于活細(xì)胞示蹤熒光染料的用途，用于觀察細(xì)胞長(zhǎng)期活動(dòng)的實(shí)驗(yàn)。
【文檔編號(hào)】C12R1/43GK105907660SQ201610217491
【公開日】2016年8月31日
【申請(qǐng)日】2016年4月9日
【發(fā)明人】王飛, 羅海瀾, 馬翠云, 游顏杰, 趙麗芳
【申請(qǐng)人】漯河醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校