一種環(huán)磷腺苷的藥物組合物及其醫(yī)藥用圖
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種環(huán)磷腺苷的藥物組合物及其醫(yī)藥用途，本發(fā)明提供的環(huán)磷腺苷的藥物組合物中含有環(huán)磷腺苷和一種從五味子的干燥果實中分離得到的結(jié)構(gòu)新穎的天然產(chǎn)物化合物（Ⅰ），環(huán)磷腺苷和該天然產(chǎn)物化合物（Ⅰ）單獨作用時，對黑色素瘤的治療效果較弱；二者聯(lián)合作用時，對黑色素瘤的治療效果顯著提高，可以開發(fā)成治療黑色素瘤的藥物，與現(xiàn)有技術(shù)相比具有突出的實質(zhì)性特點和顯著的進步。
【專利說明】
一種環(huán)磷腺苷的藥物組合物及其醫(yī)藥用途
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及環(huán)磷腺苷的新用途，具體涉及一種環(huán)磷腺苷的藥 物組合物及其對黑色素瘤的治療作用。
【背景技術(shù)】
[0002] 為蛋白激酶致活劑，系核苷酸的衍生物。它是在人體內(nèi)廣泛存在的一種具有生理 活性的重要物質(zhì)，由三磷酸腺苷在腺苷環(huán)化酶催化下生成，能調(diào)節(jié)細胞的多種功能活動。作 為激素的第2信使，在細胞內(nèi)發(fā)揮激素調(diào)節(jié)生理機能和物質(zhì)代謝作用，能改變細胞膜的功 能，促使網(wǎng)織肌漿質(zhì)內(nèi)的鈣離子進入肌纖維，從而增強心肌收縮，并可促進呼吸鏈氧化酶的 活性，改善心肌缺氧，緩解冠心病癥狀及改善心電圖。
[0003] 環(huán)磷腺苷為參與調(diào)節(jié)細胞功能的第二信使物質(zhì)，其作用非常廣泛，注射大劑量的 環(huán)磷腺苷，能使心肌收縮力增強，引起血壓升高，心輸出量增高。并能舒張平滑肌、擴張冠狀 動脈血管、改善肝功能、促進神經(jīng)再生、抑制皮膚外層上皮細胞分裂及轉(zhuǎn)化異常細胞的功 能、促進呼吸鏈氧化酶的活性及改善心肌缺氧等。
[0004] 黑色素瘤，又稱惡性黑色素瘤，是來源于黑色素細胞的一類惡性腫瘤，常見于皮 膚，亦見于黏膜、眼脈絡(luò)膜等部位。黑色素瘤是皮膚腫瘤中惡性程度最高的瘤種，容易出現(xiàn) 遠處轉(zhuǎn)移。早期診斷和治療因而顯得尤為重要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種環(huán)磷腺苷的藥物組合物，該藥物組合物中含有環(huán)磷腺 苷和一種從草本中分離得到的結(jié)構(gòu)新穎的天然產(chǎn)物，環(huán)磷腺苷和該天然產(chǎn)物可以協(xié)同治療 黑色素瘤。
[0006] 本發(fā)明的上述目的是通過下面的技術(shù)方案得以實現(xiàn)的： 一種具有下述結(jié)構(gòu)式的化合物（I)，
[0007] 一種環(huán)磷腺苷的藥物組合物，包括環(huán)磷腺苷、如上所述的化合物a)和藥學上可以 接受的載體。
[0008]如上所述的化合物（I)的制備方法，包含以下操作步驟：（a)將五味子的干燥果實 粉碎，用75~85%乙醇熱回流提取，合并提取液，濃縮至無醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯和水 飽和的正丁醇萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；（b)步驟(a) 中正丁醇取物用大孔樹脂除雜，先用15%乙醇洗脫8個柱體積，再用70%乙醇洗脫12個柱體 積，收集70%洗脫液，減壓濃縮得70%乙醇洗脫濃縮物；（c)步驟(b)中70%乙醇洗脫濃縮物用 正相硅膠分離，依次用體積比為70:1、35:1、15:1和5:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到4個 組分；（d)步驟(c)中組分4用正相硅膠進一步分離，依次用體積比為8:1、5:1和2:1的二氯甲 烷-甲醇梯度洗脫得到3個組分;（e)步驟(d)中組分2用十八烷基硅烷鍵合的反相硅膠分離， 用體積百分濃度為75%的甲醇水溶液等度洗脫，收集9~15個柱體積洗脫液，洗脫液減壓濃縮 得到化合物(I)。
[0009] 進一步地，步驟(a)中，用80%乙醇熱回流提取，合并提取液。
[0010]進一步地，所述大孔樹脂為D101型大孔吸附樹脂。
[0011] 如上所述的化合物(I)在制備治療黑色素瘤的藥物中的應(yīng)用。
[0012] 如上所述的環(huán)磷腺苷的藥物組合物在制備治療黑色素瘤的藥物中的應(yīng)用。
[0013]本發(fā)明的優(yōu)點： 本發(fā)明提供的環(huán)磷腺苷的藥物組合物中含有環(huán)磷腺苷和一種從五味子中分離得到的 結(jié)構(gòu)新穎的天然產(chǎn)物，環(huán)磷腺苷和該天然產(chǎn)物單獨作用時，對黑色素瘤的治療效果較弱;二 者聯(lián)合作用時，對黑色素瘤的治療效果顯著提高，可以開發(fā)成治療黑色素瘤的藥物。本發(fā)明 與現(xiàn)有技術(shù)相比具有突出的實質(zhì)性特點和顯著的進步。
【具體實施方式】
[0014] 下面結(jié)合實施例進一步說明本發(fā)明的實質(zhì)性內(nèi)容，但并不以此限定本發(fā)明保護范 圍。盡管參照較佳實施例對本發(fā)明作了詳細說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當理解，可以對 本發(fā)明的技術(shù)方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實質(zhì)和范圍。
[0015] 實施例1:化合物(I)分離制備及結(jié)構(gòu)確證 試劑來源：乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、二氯甲烷為分析純，購自上海凌峰化學試 劑有限公司，甲醇，分析純，購自江蘇漢邦化學試劑有限公司。
[0016] 分離方法：（a)將五味子的干燥果實（5kg)粉碎，用80%乙醇熱回流提?。?0LX 3 次），合并提取液，濃縮至無醇味(4L)，依次用石油醚(4L X 3次）、乙酸乙酯(4L X 3次)和水飽 和的正丁醇(4LX3次)萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；（b) 步驟(a)中乙酸乙酯萃取物用D101型大孔樹脂除雜，先用15%乙醇洗脫8個柱體積，再用70% 乙醇洗脫12個柱體積，收集70%洗脫液，減壓濃縮得70%乙醇洗脫濃縮物；（c)步驟(b)中70% 乙醇洗脫濃縮物用正相硅膠分離，依次用體積比為70 :1 (8個柱體積）、35 :1 (8個柱體積）、 15:1(8個柱體積)和5:1(10個柱體積)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到4個組分；（d)步驟(c) 中組分4用正相硅膠進一步分離，依次用體積比為8:1 (8個柱體積）、5:1 (10個柱體積)和2:1 (5個柱體積)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到3個組分;（e)步驟(d)中組分2用十八烷基硅烷 鍵合的反相硅膠分離，用體積百分濃度為75%的甲醇水溶液等度洗脫，收集9~15個柱體積洗 脫液，洗脫液減壓濃縮得到化合物（I) (295mg，HPLC歸一化純度大于98%)。
[0017] 結(jié)構(gòu)確證:黃色粉末;冊431-1^顯示[1+!1]+為111/2 395.1921，結(jié)合核磁特征可得 分子式為C23H26N2〇4，不飽和度為12。核磁共振氫譜數(shù)據(jù)δ Η(ppm，DMSO-?，500MHz ) : H-3 (4.13， d,/=4.9Hz),H-5a(3.12,dd,/=11.2,6.2Hz),H-5b(2.74,dd,/=11.2,4.0Hz),H-6(6.02,dd, /=6.2,4.0Hz),H-10(6.84,d,/=8.7Hz),H-ll(7.32,t,/=8.7Hz),H-12(7.13,d,/=8.7Hz), H-14a(2.23，m)，H-14b(l ·92，(Η，/=12·2,3·5Ηζ)，Η-15(3· 13，dtJ=12.2,4.2Hz)，H-17 (7.40,m),H-18(l.09,t,/=8.8Hz),H-19(3.76,q,/=8.8Hz,2H),H-21(5.62,s),9-0Me (3.81，8)，17-<116(3.84,8)，22-(116(3.62,8);核磁共振碳譜數(shù)據(jù)3。( ？?111，0150-辦，1251抱）： 164.2(C，2-C)，50.2(CH，3-C)，47.2(CH2,5-C)，124.3(CH，6-C)，130.7(C，7-C)，113.2(C，8-C)，159.3(C，9-C)，112.9(CH，10-C)，130.2(CH，11-C)，117.8(CH，12-C)，148.3(C，13-C)， 26.6(CH2，14-C)，31.3(CH，15-C)，110.3(C，16-C)，160.9(CH，17-C)，13.4(CH 3，18-C)，61.2 (CH2，19-C)，99.6(C，20-C)，135.2(CH，21-C)，168.1(C，22-C)，55.8(9-0Me)，61.3(17-OMehSOJUS-OMeXUV譜圖中的最大吸收帶222nm、347nm與394nm表明含有吲哚片段。氫譜 核磁數(shù)據(jù)表明：該結(jié)構(gòu)中存在一組ABX偶合特征的質(zhì)子信號δΗ6.84( lH，d J=8.7Hz，H-10)， 7.32(t，/=8.7Hz，H-l 1)與7.13(d，/=8.7Hz，H-l2)。此外，氫譜與碳譜核磁數(shù)據(jù)表明化合物 結(jié)構(gòu)中含有一個甲氧基丙烯酸甲酯基片段，一個乙基片段，一個甲氧基苯片段，這些信息 提示該化合物可能是9-甲氧基-Corynanthe類單砲生物堿。HMBC譜中，Η2-19與C-20和C-21 的相關(guān)性表明乙基片段連接在C-20位上。在Corynanthe類單砲生物堿的生物合成途徑中H-15總是處在α位，據(jù)R0ESY譜分析，H-15與H_14b存在相關(guān)信號，說明H_14b也為α構(gòu)型;此外， R0ESY中的Η-3與H-14a的相關(guān)信號歸屬了 Η-3為β構(gòu)型。綜合氫譜、碳譜、HMBC譜和R0ESY譜， 以及文獻關(guān)于相關(guān)類型核磁數(shù)據(jù)，可基本確定該化合物如下所示，立體構(gòu)型進一步通過ECD 試驗確定，理論值與實驗值基本一致。
[0018]
[0019]實施例2:對黑色素瘤的治療作用 一、材料和儀器 人Α375黑色素瘤細胞株由第三軍醫(yī)大學贈?；衔铮↖)自制，制備方法見實施例1， HPLC歸一化純度大于98%<^ΜΕΜ培養(yǎng)基、0.25%胰酶購自美國Gibco公司。MTT (3-(4,5-二 甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽；四甲基偶氮唑藍）、DMS0(二甲基亞砜）、BrdU購自美 國Sigma公司。鼠抗BrdU多克隆抗體購自美國ABcam公司。山羊抗鼠二抗購自美國Cell signaling公司。Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒購自美國Promega公司。
[0020]恒溫C02培養(yǎng)箱，普通冰箱，-80度冰箱均為美國Forma公司產(chǎn)品。超凈工作臺（中國 蘇州凈化工程公司）。倒置顯微鏡，倒置熒光顯微鏡(Olympus公司）。電熱恒溫培養(yǎng)箱（中國 上海躍進醫(yī)療器械廠）。自動酶標儀（日本W(wǎng)ako公司）。紫外分光光度儀(美國Beckman公司）。 J6-HC高速離心機(美國Beckman公司）。低溫微量離心機(德國Eppendorf公司）。振蕩搖床 (美國Forma公司）。
[0021]二、試驗方法 1、細胞培養(yǎng) 1.1細胞復蘇 將凍存在液氮罐中的A375黑色素瘤細胞取出，迅速放入37°C的溫水中，輕輕搖動使 其盡快融化(大約lmin)。然后吸出細胞懸液，加入到已加有2mL培養(yǎng)基的離心管中，輕輕吹 打混勻，800r/min，離心5min，棄去上層培養(yǎng)基。用含有10%FBS和1%的青霉G/鏈霉素的 DMEM培養(yǎng)基8mL制成細胞懸液后，接種至10cm培養(yǎng)盤中。然后置于5% C02、37°C恒溫培養(yǎng)箱 中進行培養(yǎng)。
[0022] 1.2細胞傳代 顯微鏡下觀察細胞融合度達80%_90%時即可進行傳代。先用2mL PBS洗滌細胞2次，然后 加入0.25%的胰酶lmL。輕輕水平搖動培養(yǎng)盤，使消化液能覆蓋細胞的表面，然后置于37°C 溫箱中消化約lmin。置于顯微鏡下見細胞變圓回縮，然后迅速加入lmL含有FBS的培養(yǎng)基終 止消化。輕輕吹打至細胞分散均勻，然后根據(jù)細胞密度按照1:2或1:3傳代，重新接種于 新的培養(yǎng)盤中，置于5% C02、37°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0023] 1.3細胞凍存 取1盤處于對數(shù)生長期的細胞，胰酶消化并收集到離心管中，l〇〇〇r/min離心5min，棄 上清。然后加入lmL凍存液，輕輕吹散細胞制成細胞懸液，將細胞懸液加入到1.5mL的凍 存管中。在凍存管上標明細胞的名稱，保存時間，保存者的姓名。先將凍存管放入4°C冰箱， 放置約30min。接著置于-20°C冰箱，放置約2h。然后放于-80°C超低溫冰箱中放置過夜。第 二天將凍存的細胞置于液氮罐中長期保存。
[0024] 2、細胞計數(shù)法繪制細胞生長曲線 (1) 取對數(shù)生長期A375黑色素瘤細胞，計數(shù)，調(diào)整細胞密度為2 X 104/mL。 (2) 將細胞懸液接種于12孔板中，1.5mL/孔。 (3) 12h后，待細胞貼壁，換lmL無血清DMEM培養(yǎng)基，并分別用5ymol/L環(huán)磷腺苷、5μπιο1/ L化合物（I)、2.5ymol/L環(huán)磷腺苷與2.5ymol/L化合物（I)組合物、DMS0【對于DMS0稀釋的藥 物，控制DMS0濃度在1/1000以下，確保對細胞無害】處理，每組細胞設(shè)3個平行孔，置于5% C02、37。。恒溫培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。
[0025] (4)分別于0h、24h、48h、72h終止培養(yǎng)，收集各組細胞，加0.25%胰蛋白酶消化，離 心，重懸。
[0026] (5 )細胞計數(shù)：吸取細胞混懸液1 OyL，加入等體積的臺酚藍區(qū)分活細胞，吸取1 OyL 混合液輕輕加入細胞計數(shù)板凹槽中，保證無空隙和氣泡。倒置顯微鏡下，計數(shù)周邊四個大方 格內(nèi)的細胞數(shù)，代入公式:原細胞混懸液濃度(細胞數(shù)/mL)=(4個大方格的細胞數(shù)/4) X104 X稀釋倍數(shù)。
[0027] (6)計算活細胞數(shù)目，繪制細胞生長曲線。 3、MTT法檢測細胞增殖 (1)取對數(shù)生長期的A375細胞，消化，離心，重懸，計數(shù)，調(diào)整細胞懸液中細胞的密度 為 2X104/mL。
[0028] (2)將各組細胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板中，200yL每孔，每組細胞3個平行孔，同時 設(shè)空白對照孔（只加入培養(yǎng)基）。
[0029] (3)12h待細胞貼壁后，換200yL無血清DMEM培養(yǎng)基，并分別用5ymol/L環(huán)磷腺 苷、5μηιο 1/L化合物（I)、2.5μηιο 1/L環(huán)磷腺苷與2.5μηιο 1/L化合物（I)組合物、DMS0處理。 [0030] (4)分別于0、1、2、3、4天終止培養(yǎng)。
[0031] (5)向每孔加入濃度為5mg/mL的四甲基偶氮唑藍(MTT)20yL繼續(xù)培養(yǎng)細胞4h。
[0032] (6)吸棄各小孔內(nèi)的培養(yǎng)基，加入200yL DMS0,在微振蕩器上振蕩lOmin，使結(jié)晶 物充分溶解。
[0033] (7)以空白對照孔調(diào)零，采用自動酶標儀測定各孔570 nm處的吸光光度值(0D 值），以對應(yīng)的0D值表示細胞增殖能力，各組取3個平行孔的平均值，以時間為橫軸，以各 吸光度值為縱軸繪制細胞生長曲線。
[0034] 4、統(tǒng)計分析 應(yīng)用SPSS 18.0統(tǒng)計分析軟件，采用兩獨立樣本t檢驗及單因素方差分析進行數(shù)據(jù) 分析，數(shù)據(jù)用Z ±S表示，P〈0.05為有統(tǒng)計學意義。
[0035]三、結(jié)果及結(jié)論 1、 細胞形態(tài)觀察及計數(shù)結(jié)果 細胞形態(tài)觀察及計數(shù)顯示，環(huán)磷腺苷與化合物（I)組合物處理A375細胞48h、72h后，活 細胞數(shù)顯著降低，抑制效果顯著優(yōu)于環(huán)磷腺苷或化合物（I)單獨作用48h或72h，差異具有統(tǒng) 計學意義(P<〇.〇5)。
[0036] 結(jié)果見表1。
[0037] 表1對A375細胞增殖的影響(細胞計數(shù)法，單位：Xl04/mL) (Z土S，n=3)
2、 MTT法實驗結(jié)果 MTT結(jié)果顯示，環(huán)磷腺苷或化合物（I)單獨作用、環(huán)磷腺苷與化合物（I)組合物組合作用 均能抑制A375細胞增殖，且環(huán)磷腺苷與化合物（I)組合作用時的抑制效果顯著優(yōu)于環(huán)磷腺 苷或化合物(I)單獨作用的抑制效果(P<〇.05)。
[0038] 結(jié)果見表2。
[0039] 表2對A375細胞增殖的抑制(MTT法，0D570) (Z土 S，n=3)
結(jié)論:環(huán)磷腺苷與化合物（I)的組合物可以顯著抑制A375細胞的增殖，其抑制作用顯著 高于環(huán)磷腺苷或化合物（I)單獨對A375細胞的抑制。環(huán)磷腺苷與化合物（I)之間存在協(xié)同作 用。
[0040]上述實施例的作用在于說明本發(fā)明的實質(zhì)性內(nèi)容，但并不以此限定本發(fā)明的保護 范圍。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當理解，可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進行修改或者等同替換， 而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實質(zhì)和保護范圍。
【主權(quán)項】
1. 一種具有下述結(jié)構(gòu)式的化合物（I)，2. -種環(huán)稱腺巧的藥物組合物，其特征在于：包括環(huán)憐腺巧、如權(quán)利要求1所述的化合 物(I)和藥學上可W接受的載體。3. 權(quán)利要求1所述的化合物（I)的制備方法，其特征在于，包含W下操作步驟：（a)將五 味子的干燥果實粉碎，用75~85%乙醇熱回流提取，合并提取液，濃縮至無醇味，依次用石油 酸、乙酸乙醋和水飽和的正下醇萃取，分別得到石油酸萃取物、乙酸乙醋萃取物和正下醇萃 取物；（b)步驟(a)中正下醇取物用大孔樹脂除雜，先用15%乙醇洗脫8個柱體積，再用70%乙 醇洗脫12個柱體積，收集70%洗脫液，減壓濃縮得70%乙醇洗脫濃縮物；（C)步驟(b)中70%乙 醇洗脫濃縮物用正相硅膠分離，依次用體積比為70:1、35:1、15:1和5:1的二氯甲燒-甲醇梯 度洗脫得到4個組分；（d)步驟(C)中組分4用正相硅膠進一步分離，依次用體積比為8:1、5:1 和2:1的二氯甲燒-甲醇梯度洗脫得到3個組分；（e)步驟(d)中組分2用十八烷基硅烷鍵合的 反相硅膠分離，用體積百分濃度為75%的甲醇水溶液等度洗脫，收集9~15個柱體積洗脫液， 洗脫液減壓濃縮得到化合物(I)。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的化合物（I)的制備方法，其特征在于:步驟(a)中，用80%乙醇熱 回流提取，合并提取液。5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的化合物（I)的制備方法，其特征在于:所述大孔樹脂為DlOl型 大孔吸附樹脂。6. 權(quán)利要求1所述的化合物（I)在制備治療黑色素瘤的藥物中的應(yīng)用。7. 權(quán)利要求2所述的環(huán)憐腺巧的藥物組合物在制備治療黑色素瘤的藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號】A61P35/00GK105906626SQ201610321228
【公開日】2016年8月31日
【申請日】2016年5月16日
【發(fā)明人】徐珍
【申請人】蘇州畢諾佳醫(yī)藥技術(shù)有限公司