一種精氨酸脫羧酶及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種精氨酸脫羧酶及其應(yīng)用，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明通過基因組數(shù)據(jù)庫挖掘及同源序列比對等虛擬篩選手段，結(jié)合分子生物學手段從腐敗希瓦氏菌中克隆獲得精氨酸脫羧酶基因。采用分子生物學和過程優(yōu)化等手段，提高精氨酸脫羧酶生產(chǎn)菌株產(chǎn)酶能力，通過優(yōu)化催化體系，建立高效生物催化生產(chǎn)胍基丁胺的平臺。發(fā)酵得到的粗酶液經(jīng)純化后進行轉(zhuǎn)化，反應(yīng)體系成分明確，有利于后續(xù)產(chǎn)物提取純化。在37℃條件下，脫羧酶具有較高的活性，同時也有利于宿主細胞大腸桿菌的生長，在該溫度下，反應(yīng)速度得到極大的提高，轉(zhuǎn)化周期需24h，胍基丁胺產(chǎn)量可達61?71g/L，轉(zhuǎn)化率達68?82％。
【專利說明】
一種精氨酸脫羧酶及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種精氨酸脫羧酶及其應(yīng)用，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 胍基丁胺(Agmatine)又稱為鯡精胺，分子式C5H14N4,-種內(nèi)源性可樂定置換物質(zhì) (clonidine displacing substance ,CDS)，是咪唑啉受體的激動劑a〗-腎上腺素能受體的 非兒茶酚胺配體。它存在于生物體多種組織和細胞中，在生物體代謝中起到重要作用，具有 多種生物學功能。在心血管系統(tǒng)，胍基丁胺能降低心率、平均動脈壓、左室壓、外周血管阻力 指數(shù)等;在泌尿系統(tǒng)，胍基丁胺能增加腎小球過濾率和絕對近端沖吸收;在胃腸道，胍丁胺 能增加胃酸和胃蛋白酶的分泌，使粘膜厚度變薄，惡化應(yīng)激引起的粘膜病變等;在糖代謝條 件中，胍丁胺能增加胰島素的分泌，此外，近年的研究表明，胍基丁胺還能抑制多種細胞(包 括血管平滑肌細胞、星型膠質(zhì)細胞、內(nèi)皮細胞、肝癌細胞和腎小管上皮細胞等)的增殖。
[0003] 隨著人們對胍基丁胺生理作用研究的深入，胍基丁胺顯示了廣闊的臨床應(yīng)用前 景，特別是在神經(jīng)系統(tǒng)中的應(yīng)用前景尤其引入注意。此外，硫酸胍基丁胺也有多種藥理學活 性，是一種極具開發(fā)價值的戒毒類藥物。在食品、化工、藥物制備和臨床等領(lǐng)域，國內(nèi)外需求 巨大，市場應(yīng)用前景廣闊。
[0004] 胍基丁胺的生產(chǎn)方法主要有化學法和生物酶法。目前化學法主要用于制備硫酸胍 基丁胺，以1，4_ 丁二胺為原料，對它進行單胺基保護，再使用1-硝基胍基-3,5_二甲基對另 一個胺基進行硝胍化，后經(jīng)還原、脫保護、成鹽最終制得硫酸胍基丁胺。該路線步驟多、收率 低、成本高、不適合大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)。生物酶法主要是使用精氨酸脫羧酶(Arginine decarboxylase，EC 4.1.1.19)，這是一種5磷酸P比咳醛(輔酶PLP)依賴型的脫羧酶。該酶 可以L-精氨酸為底物，經(jīng)脫羧基后生成胍基丁胺。目前精氨酸脫羧酶的來源在植物、動物和 微生物體內(nèi)廣為分布。酶法生產(chǎn)胍基丁胺工藝簡單，周期短，耗能低，專一性強，收率高，提 取方便。
[0005] 但是，在酶法生產(chǎn)胍基丁胺的過程中，如何獲得低成本高效的酶源是關(guān)鍵問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明提供了一種精氨酸脫羧酶及其應(yīng)用，包括構(gòu)建含有精氨酸脫羧酶的工程 菌，并利用該工程菌生產(chǎn)精氨酸脫羧酶，所得精氨酸脫羧酶可進一步用于轉(zhuǎn)化L-精氨酸生 產(chǎn)胍基丁胺。
[0007] 本發(fā)明的第一個目的是提供一種編碼精氨酸脫羧酶的基因，所述基因的核苷酸序 列如SEQ ID NO. 1所示。
[0008] 本發(fā)明的第二個目的是提供所述基因編碼的精氨酸脫羧酶，所述精氨酸脫羧酶的 氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0009] 本發(fā)明的第三個目的是提供表達所述基因的重組菌株，其特征在于，表達核苷酸 序列為SEQ ID NO. 1所示的精氨酸脫羧酶基因；所述重組菌株是將SEQ ID NO. 1所示的基因 克隆到pET28a質(zhì)粒上，然后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到E.coliBL21(DE3)中進行表達。
[0010]本發(fā)明的第四個目的是提供一種應(yīng)用所述精氨酸脫羧酶生產(chǎn)胍基丁胺的方法，所 述方法以精氨酸脫羧酶作為催化劑轉(zhuǎn)化L-精氨酸生產(chǎn)胍基丁胺。
[0011]在本發(fā)明的一種實施方式中，所述精氨酸脫羧酶氨基酸序列是SEQ ID NO.2所示 的序列。
[0012] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述精氨酸脫羧酶核苷酸序列是SEQ ID NO.1所示 的序列。
[0013] 在本發(fā)明的一種實施方式中，以精氨酸脫羧酶作為催化劑轉(zhuǎn)化L-精氨酸生產(chǎn)胍基 丁胺時，精氨酸脫羧酶的添加量為4.0-6.0 X 104U/L、底物精氨酸濃度為100-200g/L，轉(zhuǎn)化 溫度為30-37°(：，轉(zhuǎn)化時間12-2411。
[0014] 在本發(fā)明的一種實施方式中，以精氨酸脫羧酶作為催化劑轉(zhuǎn)化L-精氨酸生產(chǎn)胍基 丁胺時，還添加終濃度為20mmol/L硫酸鎂和終濃度為60mmol/L 5-磷酸吡哆醛。
[0015] 在本發(fā)明的一種實施方式中，以精氨酸脫羧酶作為催化劑轉(zhuǎn)化L-精氨酸生產(chǎn)胍基 丁胺時，投酶量為6.0 X 104U/L。
[0016]在本發(fā)明的一種實施方式中，所述轉(zhuǎn)化是在搖床中進行，搖床轉(zhuǎn)速為150-250rpm。
[0017] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述精氨酸脫羧酶的制備過程包括以下步驟：（1)將 編碼SEQ ID N0.1序列的基因克隆到pET28a，然后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到E.coliBL21(DE3)中得 到基因工程菌；（2)誘導基因工程菌表達精氨酸脫羧酶，然后收集菌體；（3)將菌體洗滌后， 破碎離心取上清液，經(jīng)純化后得純酶液。
[0018] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述誘導是將重組菌株培養(yǎng)至0D6QQ為0.4-0.6，加入 終濃度為〇. 05-0.15mmol/L的IPTG進行誘導，14-18h后收集菌體。
[0019]在本發(fā)明的一種實施方式中，所述誘導表達，是將重組菌株培養(yǎng)至0D6QQ為0.6，加 入終濃度為0.1mm〇l/L的IPTG，在30°C下進行誘導，16h后收集菌體。
[0020]在本發(fā)明的一種實施方式中，所述純化是將菌體破碎，收集上清液過膜并經(jīng)過鎳 柱純化，獲得酶液。
[0021 ]本發(fā)明還要求保護所述精氨酸脫羧酶在食品、化工、化妝品，以及制備藥物方面的 應(yīng)用。
[0022]在本發(fā)明中，IU精氨酸脫羧酶是指在最適催化條件(37°C、pH8.5)下，Imin內(nèi)催化1 μπιο?精氨酸轉(zhuǎn)化生成Iymol胍基丁胺所需的酶量 [0023]本發(fā)明的有益效果：
[0024] 1、本發(fā)明是使用來源于腐敗希瓦氏菌的精氨酸脫羧酶轉(zhuǎn)化L-精氨酸生產(chǎn)胍基丁 胺，該酶在大腸桿菌內(nèi)表達后，仍表現(xiàn)出很高的活力，可以滿足工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)的需求。
[0025] 2、添加純酶進行轉(zhuǎn)化，反應(yīng)體系成分清晰，有利于后續(xù)產(chǎn)物提純。在37°C，產(chǎn)量可 達61.4g/L，整個轉(zhuǎn)化過程的平均生產(chǎn)強度為2.6g/L/h，轉(zhuǎn)化率達82.1 %。
【附圖說明】
[0026]圖1是鎂離子和輔酶PLP濃度對胍基丁胺產(chǎn)量的影響;A:輔酶PLP對胍基丁胺產(chǎn)量 的影響;B，鎂離子濃度對胍基丁胺產(chǎn)量的影響；
[0027]圖2是投酶量對胍基丁胺產(chǎn)量的影響；
[0028]圖3是L-精氨酸轉(zhuǎn)化生產(chǎn)胍基丁胺的化學方程式； 圖4是轉(zhuǎn)化液質(zhì)譜圖；131.15處為胍基丁胺質(zhì)譜峰； 圖5是轉(zhuǎn)化液高效液相色譜圖。
【具體實施方式】
[0029]精氨酸脫羧酶酶活力的測定：
[0030] 10mmol/L L-精氛酸，2.5mmol/L硫酸儀，0.6mmol/L 5-憐酸吡咳酸，0.05g/L純酶， 緩沖液50mmol/L Tris-HChpH 8.5,溫度37°C。酶活定義:在37°C和pH 8.5的條件下，Imin 內(nèi)降解Ιμπ?ο? L-精氨酸產(chǎn)生Ιμπ?ο?胍基丁胺的酶量為一個酶活力單位。
[0031] 胍基丁胺產(chǎn)量檢測：
[0032] 取轉(zhuǎn)化液1000 Orpm離心2min，收集上清液，并以硫酸胍基丁胺作為標準品，配制標 準溶液。將適度稀釋后的上清液和標準溶液分別與鄰苯二甲醛(OPA)衍生，經(jīng)0.22μπι微孔濾 膜過濾后，用高效液相色譜法測定胍基丁胺的含量。標準曲線在25-100mg/L之間呈現(xiàn)良好 的線性關(guān)系，回歸方程:y = 6.01 X 10-5X-0.02，R2 = 0.9996。
[0033] 高效液相色譜法測定L-瓜氨酸的含量：
[0034] 色譜柱:Z0RBAX SB-Aq;流動相:A:磷酸鹽緩沖液(pH 5.3)，B:乙腈-甲醇-磷酸鹽 (體積比為5:3:1)，用0.22μπι濾膜過濾，超聲脫氣;柱溫:35°C ;檢測波長:激發(fā)波長330nm，發(fā) 射波長465nm;進樣量：12μ1 (樣品8μ1+0ΡΑ4μ1);流速：lmL/min。
[0035] 實施例1:含精氨酸脫羧酶基因工程菌的構(gòu)建
[0036] 按以下方法構(gòu)建含精氨酸脫羧酶的基因工程菌：
[0037] (1)通過分子生物學手段用序列分別如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示的引物1:
[0038] 5，-CGGAATTCATGAATGATTGGTCTATTGATGAT-3，和引物2:
[0039] 5 ' -CCGCTCGAGTTAAGAAAAATCTTCTAAATAA-3 '將來自于腐敗希瓦氏菌的精氨酸脫羧 酶基因（氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示)進行PCR擴增:體 系中加入rTaq酶，95 °C預變性5min，94°C變性30s，55 °C退火30s，72°C延伸2 . Omin，30個循 環(huán)，最后72 °C延伸IOmin;
[0040] (2)用限制性內(nèi)切酶EcoR I和Xho I將目的基因和表達載體pET28a 37°C酶切4h; [00411 (3)用T4連接酶分別將酶切并膠回收后的目的基因和質(zhì)粒pET28a 16°C連接12h;
[0042] (4)將構(gòu)建好的表達質(zhì)粒導入E.coli BL21(DE3)，在含有卡納霉素的LB平板中培 養(yǎng) 12h;
[0043] (5)將平板中長出的菌落進行PCR及酶切驗證，將含有目的基因的質(zhì)粒進行測序驗 證，選出目的基因完全正確的菌株，即為表達精氨酸脫羧酶基因工程菌。
[0044] 實施例2:精氨酸脫亞胺酶的誘導表達
[0045] 按以下方法誘導基因工程菌表達：
[0046] (1)將構(gòu)建的基因工程菌接入LB斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)12h;
[0047] (2)接一環(huán)斜面種子到LB培養(yǎng)基內(nèi)，培養(yǎng)6h;
[0048] (3)將種子液接入LB發(fā)酵培養(yǎng)基內(nèi)，培養(yǎng)至OD6qq為0.6，在16，25和37°C三個溫度下 誘導，分別加入終濃度為〇. 05，0.1，0.2和0.4mmol/L的IPTG，誘導4，8，10和16h后收集菌體， 無菌生理鹽水洗滌菌體。
[0049] 實施例3:轉(zhuǎn)化條件對胍基丁胺產(chǎn)量的影響
[0050] 培養(yǎng)實施例1構(gòu)建的基因工程菌，并誘導其表達精氨酸脫羧酶，然后收集基因工程 菌菌體，并用無菌生理鹽水洗滌菌體兩次；
[0051] 使用鎳柱進行蛋白純化，用Bradford試劑盒檢測蛋白濃度;采用不同轉(zhuǎn)化體系，用 高效液相色譜法分別測定轉(zhuǎn)化液中胍基丁胺的含量。
[0052] (1)轉(zhuǎn)化體系為:純酶5.0 X 104U/L、底物精氨酸濃度為140g/L，轉(zhuǎn)化溫度為37°C， 轉(zhuǎn)化時間24h;該轉(zhuǎn)化條件下胍基丁胺的產(chǎn)量可達71.9g/L，整個轉(zhuǎn)化過程的平均生產(chǎn)強度 為3.(^/〇^11)，轉(zhuǎn)化率達68.7%。
[0053] (2)轉(zhuǎn)化體系為:純酶6.0 X 104U/L、底物精氨酸濃度為100g/L，轉(zhuǎn)化溫度為37°C， 轉(zhuǎn)化時間24h，搖床轉(zhuǎn)速200rpm;胍基丁胺的產(chǎn)量可達61.4g/L，整個轉(zhuǎn)化過程的平均生產(chǎn)強 度為2 · 6g/(L · h)，轉(zhuǎn)化率達82 · 1 %。
[0054]實施例4:鎂離子濃度對胍基丁胺產(chǎn)量的影響
[0055]在轉(zhuǎn)化溫度為37°C、pH 8.5、濕菌體濃度為358/1的條件下，轉(zhuǎn)化反應(yīng)111，研究鎂離 子濃度（l-6mmol/L)對胍基丁胺產(chǎn)量的影響。結(jié)果如圖IA所示，當鎂離子濃度低于4mmol/L 時，胍基丁胺的產(chǎn)量隨著底物濃度的增加而增加；當?shù)孜餄舛葹?mmol/L時，胍基丁胺的產(chǎn) 量達到最高，為3.3g/L，此時轉(zhuǎn)化率為22.1 %，生產(chǎn)強度為3.3g/(L · h);當鎂離子濃度超過 4mmol/L時，胍基丁胺的產(chǎn)量反而降低。可能是因為:金屬離子濃度過高，反應(yīng)體系離子強度 增大，改變了精氨酸脫羧酶的構(gòu)象，對轉(zhuǎn)化反應(yīng)產(chǎn)生了不利影響。
[0056]實施例5:輔酶PLP與底物的比例對胍基丁胺產(chǎn)量的影響
[0057] 在轉(zhuǎn)化溫度為37°(：、？!18.5、底物濃度為2(^/1的條件下，轉(zhuǎn)化反應(yīng)211，研究輔酶?1^ 與底物比例對胍基丁胺產(chǎn)量的影響，結(jié)果如圖IB所示。結(jié)果顯示：當輔酶PLP與底物的摩爾 比小于0.06時，胍基丁胺的產(chǎn)量隨著二者摩爾比增加而增加；當輔酶PLP與底物的摩爾比為 0.06時，胍基丁胺的產(chǎn)量達到最高，為6.7g/L，此時轉(zhuǎn)化率為44.8%，生產(chǎn)強度為3.4g/(L · h);當輔酶PLP與底物的摩爾比超過0.06時，胍基丁胺的產(chǎn)量反而降低。
[0058]實施例6:純酶液添加量對胍基丁胺產(chǎn)量的影響
[0059]為驗證純酶液添加量對酶促脫羧生產(chǎn)胍基丁胺的影響，在底物濃度為100g/L，硫 酸鎂添加量2〇111111〇1/1，輔酶？1^添加量6〇111111〇1/1，轉(zhuǎn)化溫度為37°(：，？!18.5的條件下轉(zhuǎn)化 12h，以1.0-6.0 X 104U/L不同純酶添加量參與反應(yīng)，考察其對胍基丁胺產(chǎn)量的影響。結(jié)果如 圖2所示，在5.0 X IO4IVL酶濃度以下，胍基丁胺的產(chǎn)量隨酶濃度的增加而顯著增加；當酶濃 度達到5.0-6.OX IO4IVL之后，酶濃度增加對胍基丁胺產(chǎn)量增加的效果并不顯著。說明在此 時對酶而已，底物濃度已達到飽和，酶所有活性位點均被底物占據(jù)。當酶濃度為1.0 X IO4U/ L時，胍基丁胺的產(chǎn)量為39. lg/L，生產(chǎn)強度為1.6g/(L · h)，轉(zhuǎn)化率52.1 % ;當酶濃度為6.0 X IO4IVL時，胍基丁胺的產(chǎn)量為61.4g/L，生產(chǎn)強度為2.6g/(L · h)，轉(zhuǎn)化率82.1 %。另外，該 過程中酶濃度提高6倍，胍基丁胺產(chǎn)量提高了 1.6倍。
[0060]雖然本發(fā)明已以較佳實施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技 術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動與修飾，因此本發(fā)明的保護范 圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定的為準。
【主權(quán)項】
1. 一種編碼精氨酸脫羧酶的基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。2. 表達權(quán)利要求1所述基因的重組菌株。3. 權(quán)利要求1所述基因編碼的精氨酸脫羧酶，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO.2 所示。4. 一種應(yīng)用權(quán)利要求3所述精氨酸脫羧酶生產(chǎn)胍基丁胺的方法，其特征在于，作為催化 劑轉(zhuǎn)化L-精氨酸生產(chǎn)胍基丁胺。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述精氨酸脫羧酶的獲得是將重組表達所 述精氨酸脫羧酶的菌體破碎，收集上清液過膜并經(jīng)過鎳柱純化，獲得純化后的酶液。6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述精氨酸脫羧酶添加量4.0-6.0 X 104U/ L，所述L-精氨酸濃度100-200g/L;在30-37 °C、pH 8.0-9.0條件下，轉(zhuǎn)化時間為12-24h。7. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，還添加終濃度為20mmol/L硫酸鎂和終濃度 為50-70mmol/L 5-磷酸吡哆醛。8. 根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的方法，其特征在于，所述精氨酸脫羧酶是誘導重組菌株表 達獲得的；所述重組菌株是將SEQ ID NO. 1所示的基因克隆到pET28a質(zhì)粒上，然后將重組質(zhì) 粒轉(zhuǎn)化到E. co 1 i BL21 (DE3)得到的。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述方法，其特征在于，所述誘導是將重組菌株培養(yǎng)至0D6QQ為0.4- 0.6，加入終濃度為0.05-0.15mmol/L的IPTG進行誘導，14-18h后收集菌體。10. 權(quán)利要求3所述精氨酸脫羧酶在食品、化工、藥物制備等方面的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N9/88GK105861529SQ201610363114
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年5月27日
【發(fā)明人】劉立明, 孫安然, 宋偉, 劉佳, 羅秋玲
【申請人】江南大學