一種來源于長(zhǎng)柄石杉的l-賴氨酸脫羧酶基因序列的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種來源于長(zhǎng)柄石杉的L-賴氨酸脫羧酶 基因序列。
【背景技術(shù)】
[0002] 石杉科植物屬古老的蕨類植物，普遍含有石杉?jí)A甲（Huperzine A)，石杉?jí)A甲是 一種高效、高選擇性的中樞乙酰膽堿酯酶抑制劑，對(duì)治療中老年癡呆及重癥肌無力具有顯 著療效而引起世界廣泛關(guān)注。由于石杉?jí)A甲目前尚未能人工合成，藥品生產(chǎn)完全依賴野 生資源，石杉科植物生長(zhǎng)緩慢、生物量小，野生資源遠(yuǎn)不能滿足需求，石杉?jí)A甲生物合成成 為生產(chǎn)石杉?jí)A甲最有潛力的途徑之一。石杉?jí)A甲生物合成的起始物已經(jīng)被證實(shí)為L(zhǎng)-賴 氨酸，L-賴氨酸脫羧酶（lysine decarboxylase，LDC)為石杉?jí)A甲生物合成途徑上第一 個(gè)關(guān)鍵限速酶，對(duì)該酶基因的克隆及分析將有助于闡明石杉?jí)A生物合成代謝途徑。本發(fā) 明首先對(duì)南方地區(qū)石杉科植物中資源儲(chǔ)量大的廣布種長(zhǎng)柄石杉（/fcperzia serraiarar. 的總RNA進(jìn)行提取再反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模板，利用RT- PCR技術(shù) 擴(kuò)增獲得長(zhǎng)柄石杉LDC基因，采用RACE技術(shù)獲得的長(zhǎng)柄石杉L-賴氨酸脫羧酶基因全長(zhǎng)序 列。并預(yù)測(cè)了其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，為進(jìn)一步闡明石杉科植物石杉?jí)A甲生物合成途徑奠定基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的在于提供一種來源于長(zhǎng)柄石杉的L-賴氨酸脫羧酶基因序列，及其 氨基酸序列，是人們對(duì)石杉科植物L(fēng)DC基因的研宄除蛇足石杉外的一種新的植物(長(zhǎng)柄石 杉系蛇足石杉的一個(gè)變種，福建省及周邊地區(qū)廣布種)，是研宄石杉?jí)A甲生物合成的基礎(chǔ)。 長(zhǎng)柄石杉LDC基因序列的獲得豐富了為數(shù)不多的石杉科植物石杉?jí)A生物合成與代謝調(diào)控 途徑中涉及到的關(guān)鍵酶基因序列，同時(shí)也為L(zhǎng)-賴氨酸脫羧酶基因的轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)夯實(shí)了基礎(chǔ)。
[0004] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案： 一種來源于長(zhǎng)柄石杉的L-賴氨酸脫羧酶基因序列，所述基因序列如SEQ ID NO. 1所 示。所述氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
[0005] 制備方法包括如下： (1)總RNA的提取和純化： 取長(zhǎng)柄石杉新鮮材料，使用康為世紀(jì)TRIzon RNA試劑盒提取總RNA。
[0006] (2) LDC基因中間片段的克隆 A.中間片段cDNA第一鏈的合成 以步驟（1)長(zhǎng)柄石杉葉片總RNA作為模板，利用Promega公司的M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶，按照 該試劑盒說明書提供的反應(yīng)條件和步驟進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，將RNA反轉(zhuǎn)錄成第一鏈互補(bǔ)鏈DNA (cDNA)。
[0007] B. PCR 擴(kuò)增 以步驟A所得的中間片段的cDNA第一鏈作為模板，對(duì)LDC基因進(jìn)行擴(kuò)增，引物為 LysD-F : 5' -GCAGCAGTGGCAAGAAGA-3'，LysD-R : 5' -TGGGCAGTTGAAGCAGAC-3'。
[0008] 反應(yīng)體系：cDNA 2.5 yL，10 X Buffer 5.0以1^1(^111〇1/1上下游引物各 1.25yL, dNTP mix (10 mM each) I. 5 μ L，25 mM MgC12 4· 5 μ L，5u. μ L-ITaq 酶 0· 75 μ L，終體積為30. 0 μ L。
[0009] 反應(yīng)程序：95 °C預(yù)變性3 min ;然后進(jìn)行32個(gè)循環(huán)：95 °C變性30 s，50. (TC退火 30 s，72°C延伸45 s;循環(huán)結(jié)束后72°C延伸反應(yīng)5 min，4°C條件下保存。
[0010] (3)長(zhǎng)柄石杉LDC基因全長(zhǎng)的調(diào)取 采用RACE技術(shù)獲得長(zhǎng)柄石杉L-賴氨酸脫羧酶基因全長(zhǎng)序列，所用引物見(表1)。RACE 結(jié)果經(jīng)過純化回收，連接載體，轉(zhuǎn)化后提取質(zhì)粒測(cè)序。5' -RACE測(cè)序結(jié)果與3' -RACE測(cè)序 結(jié)果經(jīng)過DNAman軟件拼接后得到L-賴氨酸脫羧酶基因全長(zhǎng)序列。
[0011] 該技術(shù)關(guān)鍵在于： 1、長(zhǎng)柄石杉LDC基因的中間片段的獲得。
[0012] 2、長(zhǎng)柄石杉LDC基因的3'端的克隆。
[0013] 3、長(zhǎng)柄石杉LDC基因的5'端的克隆。
[0014] 4、基因序列的拼接及克隆。
[0015] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：該序列是一種新的L-賴氨酸脫羧酶基因序列，使人們對(duì)該基 因的認(rèn)識(shí)進(jìn)一步拓展到長(zhǎng)柄石杉。并且根據(jù)L-賴氨酸脫羧酶是一種將L-賴氨酸脫羧生成 1，5_戊二胺（尸胺）的關(guān)鍵酶，1，5_戊二胺是重要的醫(yī)藥中間體和尼龍材料前體。因此在 長(zhǎng)柄石杉中對(duì)該基因序列的解明，將為探析L-賴氨酸脫羧酶工作機(jī)制提供依據(jù)，為1，5-戊 二胺的富集提供基礎(chǔ)，在生物制藥、農(nóng)業(yè)、高聚物制備上將有廣泛的應(yīng)用前景。
【附圖說明】
[0016] 圖1長(zhǎng)柄石杉L-賴氨酸脫羧酶基因目的條帶。
[0017] 圖 2 RACE 產(chǎn)物電泳圖。M 為 DNA Marker ;1 為 5'- RACE ; 2 為 3'- RACE。
[0018] 圖3 L-賴氨酸脫羧酶三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。
【具體實(shí)施方式】
[0019] 實(shí)施例1 (1)總RNA的提取和純化： 取長(zhǎng)柄石杉新鮮材料，使用康為世紀(jì)TRIzon RNA試劑盒提取總RNA。
[0020] (2) LDC基因中間片段的克隆 A.中間片段cDNA第一鏈的合成 以步驟（1)長(zhǎng)柄石杉葉片總RNA作為模板，利用Promega公司的M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶，按照 該試劑盒說明書提供的反應(yīng)條件和步驟進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，將RNA反轉(zhuǎn)錄成第一鏈互補(bǔ)鏈DNA (cDNA)。
[0021] B. PCR 擴(kuò)增 以步驟A所得的中間片段的cDNA第一鏈作為模板，對(duì)LDC基因進(jìn)行擴(kuò)增，引物為 LysD-F : 5' -GCAGCAGTGGCAAGAAGA-3'，LysD-R : 5' -TGGGCAGTTGAAGCAGAC-3'。
[0022] 反應(yīng)體系：cDNA 2.5 μ L，10 X Buffer 5.0 μ L，10 ymol/L 上下游引物各 1.25yL, dNTP mix (10 mM each) I. 5 μ L，25 mM MgC12 4. 5 μ L，5u. μ L-ITaq 酶 0· 75 μ L，終體積為30. 0 μ L。
[0023] 反應(yīng)程序：95 °C預(yù)變性3 min ;然后進(jìn)行32個(gè)循環(huán)：95 °C變性30 s，50. (TC退火 30 s，72°C延伸45 s;循環(huán)結(jié)束后72°C延伸反應(yīng)5 min，4°C條件下保存。
[0024] (3)長(zhǎng)柄石杉LDC基因全長(zhǎng)的調(diào)取 采用RACE技術(shù)獲得長(zhǎng)柄石杉L-賴氨酸脫羧酶基因全長(zhǎng)序列，所用引物見表1。RACE 結(jié)果經(jīng)過純化回收，連接載體，轉(zhuǎn)化后提取質(zhì)粒測(cè)序。5' -RACE測(cè)序結(jié)果與3' -RACE測(cè)序 結(jié)果經(jīng)過DNAman軟件拼接后得到L-賴氨酸脫羧酶基因全長(zhǎng)序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0025] 表1 L-賴氨酸脫羧酶基因調(diào)取的擴(kuò)增引物
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種來源于長(zhǎng)柄石杉的L-賴氨酸脫羧酶基因序列，其特征在于：所述基因序列如 SEQ ID NO. 1 所示。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種來源于長(zhǎng)柄石杉的L-賴氨酸脫羧酶基因序列，其特征在 于：所述氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
3. -種如權(quán)利要求1所述的來源于長(zhǎng)柄石杉的L-賴氨酸脫羧酶基因序列的制備方法， 其特征在于：所述方法包括如下：（1)總RNA的提取和純化；（2) LDC基因中間片段的克??； (3)長(zhǎng)柄石杉LDC基因全長(zhǎng)的調(diào)取。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的所述的來源于長(zhǎng)柄石杉的L-賴氨酸脫羧酶基因序列的制備 方法，其特征在于：步驟（2)中采用的PCR擴(kuò)增引物為L(zhǎng)ysD-F :5'-GCAGCAGTGGCAAGAAGA-3'， LysD-R : 5'-TGGGCAGTTGAAGCAGAC-3'。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種來源于長(zhǎng)柄石杉的L-賴氨酸脫羧酶基因序列，所述序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。該序列是一種LDC基因序列，是人們對(duì)石杉科植物L(fēng)DC基因的研究除蛇足石杉外的一種新的植物（長(zhǎng)柄石杉系蛇足石杉的一個(gè)變種，福建省及周邊地區(qū)廣布種），是研究石杉?jí)A甲生物合成的基礎(chǔ)。長(zhǎng)柄石杉LDC基因序列的獲得豐富了為數(shù)不多的石杉科植物石杉?jí)A生物合成與代謝調(diào)控途徑中涉及到的關(guān)鍵酶基因序列，同時(shí)也為L(zhǎng)-賴氨酸脫羧酶基因的轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)夯實(shí)了基礎(chǔ)。
【IPC分類】C12N15-60, C12N15-10
【公開號(hào)】CN104878032
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510294528
【發(fā)明人】張君誠(chéng), 宋育紅, 陳作毅, 張杭穎
【申請(qǐng)人】三明學(xué)院
【公開日】2015年9月2日
【申請(qǐng)日】2015年6月2日