一種促進(jìn)目標(biāo)蛋白胞外表達(dá)的方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種促進(jìn)目標(biāo)蛋白胞外表達(dá)的方法及其應(yīng)用，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng) 域。
【背景技術(shù)】
[0002] 基因工程菌表達(dá)的重組蛋白的定位方式有兩種：胞內(nèi)定位，在一系列伴侶蛋白的 輔助下，合成于核糖體的蛋白定位在細(xì)胞基質(zhì)中；胞外定位，在核糖體中合成后，目的蛋白 在自身的功能序列和宿主菌分泌系統(tǒng)的作用下轉(zhuǎn)運(yùn)至胞外基質(zhì)。這兩種定位方式中，胞外 定位不僅有助于蛋白折疊，還有利于降低包涵體的形成量，同時(shí)能夠避免下游純化時(shí)的破 碎細(xì)胞等操作，簡化純化步驟、降低成本，減少雜蛋白對(duì)產(chǎn)品的污染。因此，胞外定位在工業(yè) 生產(chǎn)中較胞內(nèi)定位有優(yōu)勢(shì)。
[0003] 大腸桿菌（Escherichia coli)表達(dá)系統(tǒng)作為目前應(yīng)用最廣泛、研宄最透徹的表達(dá) 系統(tǒng)之一，在培養(yǎng)周期長短、實(shí)驗(yàn)操作簡便度等方面具有顯著優(yōu)勢(shì)。天然情況下，大腸桿菌 具有I-V型5種蛋白分泌途徑，其中研宄應(yīng)用最多的是I型和II型分泌途徑，又以II型分泌 途徑中SecB介導(dǎo)的分泌途徑采用較多。通常大腸桿菌中的重組蛋白合成速率是較高的，但 是重組蛋白的分泌速率各不相同，很多不能夠滿足生產(chǎn)需要，因此強(qiáng)化大腸桿菌重組蛋白 的分泌效率意義十分重要。
[0004] 研宄表明，Thermobifida fusca角質(zhì)酶具有磷脂酶B活性，能夠水解磷脂酰乙醇 胺（PE，大腸桿菌細(xì)胞膜磷脂的主要成分）。T.fusca角質(zhì)酶能夠通過破壞大腸桿菌細(xì)胞 膜使得細(xì)胞能夠向外進(jìn)行非特異性滲漏從而達(dá)到促進(jìn)重組蛋白胞外表達(dá)的目的。然而， T. fusca角質(zhì)酶水解磷脂分子的產(chǎn)物之一是溶血磷脂，它有類似表面活性劑的功能，會(huì)在發(fā) 酵過程中誘發(fā)大量的泡沫，不利于發(fā)酵調(diào)控和工業(yè)放大。
[0005] 本發(fā)明選取兩種重要的工業(yè)用酶木聚糖酶和葡萄糖異構(gòu)酶作為報(bào)告蛋白。內(nèi) 切-β -1，4-木聚糖酶可從木聚糖主鏈內(nèi)部隨機(jī)作用于β -1，4-糖苷鍵，將木聚糖分解成低 聚木糖，在食品、飼料、造紙等行業(yè)均具有廣泛的應(yīng)用前景。葡萄糖異構(gòu)酶，又稱木糖異構(gòu) 酶，能將葡萄糖、木糖、核糖等醛糖催化異構(gòu)為相應(yīng)的酮糖，目前，其主要應(yīng)用領(lǐng)域?yàn)閷⑵咸?糖轉(zhuǎn)化為果糖從而制備果葡糖漿。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明提供了一種促進(jìn)重組蛋白胞外表達(dá)的方法，是將氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示的磷脂酶C基因和目標(biāo)蛋白基因（包括胞內(nèi)和胞外蛋白）在宿主菌大腸桿菌中共 表達(dá)，經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)后收集發(fā)酵上清液。
[0007] 所述方法，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，具體是：將磷脂酶C基因和目標(biāo)蛋白基因 克隆到表達(dá)載體上，得到重組質(zhì)粒，然后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到宿主菌中得到重組大腸桿菌，重 組大腸桿菌發(fā)酵培養(yǎng)生產(chǎn)目標(biāo)蛋白，收集發(fā)酵上清液。
[0008] 所述磷脂酶C基因，在發(fā)明的一種實(shí)施方式中，來自Bacillus cereus磷脂酶C基 因 （NCBI 編號(hào)：CAA45502)。
[0009] 所述表達(dá)載體，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，為pETDuet-1、pCOLADuet-Ι等雙啟 動(dòng)子載體；pUC系列，pET系列，pT7-7, pGEX等任意一種。
[0010] 所述重組質(zhì)粒，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，為pET2〇M+)-XynA或 pET24a(+)-glu〇
[0011] 所述宿主菌，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，為E. coli BL21(DE3)、E. coli W3110、 E.coli JM109、E.coli JM109(DE3)或 E.coli DH5a 等任意一種。其中優(yōu)選 E.coli BL21(DE3) 〇
[0012] 所述目標(biāo)蛋白包括胞內(nèi)定位和胞外定位蛋白。胞內(nèi)定位蛋白是指在一系列伴侶蛋 白的輔助下，合成于核糖體后仍定位在細(xì)胞基質(zhì)中的蛋白，例如：葡萄糖異構(gòu)酶（GI，NCBI 編號(hào)：AAZ55638);胞外定位蛋白是指在細(xì)胞內(nèi)合成后通過宿主菌蛋白分泌途徑跨膜轉(zhuǎn)運(yùn) 至胞外的目標(biāo)蛋白；例如：內(nèi)切-β-1，4-木聚糖酶（XynA，NCBI編號(hào)：AGM16410)。
[0013] 所述方法，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，包括：
[0014] (1)獲取不含信號(hào)肽的磷脂酶C成熟蛋白基因，連接至pMD18_T simple vector， 獲得質(zhì)粒pMD18-T-plc ;
[0015] (2)將pETDuet-1質(zhì)粒和pMD18-T-plc進(jìn)行雙酶切，連接酶連接過夜后，連接產(chǎn)物 轉(zhuǎn)化入E. coli JM109感受態(tài)細(xì)胞，得到重組質(zhì)粒pETDuet-1-plc ;
[0016] (3)將PETDuet-1-plc和含有目標(biāo)蛋白基因的重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，連接酶連 接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E. coli JM109感受態(tài)細(xì)胞，得到含有目標(biāo)蛋白基因的重組質(zhì)粒 pETDuet-1-plc ；
[0017] (4)將含有目標(biāo)蛋白基因的重組質(zhì)粒pETDuet-1-plc導(dǎo)入宿主大腸桿菌；
[0018] (5)發(fā)酵培養(yǎng)步驟（4)構(gòu)建的重組大腸桿菌生產(chǎn)目標(biāo)蛋白，收集發(fā)酵上清液。
[0019] 所述發(fā)酵培養(yǎng)，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，具體是：將種子以5-10%的接種量 接種，誘導(dǎo)前培養(yǎng)溫度為25-37°C，誘導(dǎo)后培養(yǎng)溫度25-37°C，pH6. 5-7. 5,溶氧20-30% ;當(dāng) 發(fā)酵初始碳源甘油基本消耗完時(shí)，開始流加補(bǔ)料液，所述補(bǔ)料液按指數(shù)流加，比生長速率控 制在μ =0.1-0. 31Γ1;當(dāng)菌體干重3-10時(shí)，加入5-158·!^甘氨酸；菌體干重15-25時(shí)，開 始誘導(dǎo)，誘導(dǎo)方法為恒速流加乳糖，乳糖加量〇. 05-0. 5g · Γ1 · 1Γ1，測(cè)定菌體干重和培養(yǎng)基 中酶活變化，培養(yǎng)基中酶活不再上升時(shí)，發(fā)酵過程結(jié)束。在此條件下進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，都能夠 顯著提高目標(biāo)蛋白的胞外酶活比例。
[0020] 本發(fā)明的有益效果：
[0021] (1)利用磷脂酶C中的磷脂酰膽堿特異性磷脂酶C除了具有磷脂酰膽堿活性外，還 具有磷脂酰乙醇胺活性的特點(diǎn)，通過共表達(dá)Bacillus cereus磷脂酶C，使大腸桿菌細(xì)胞膜 透性提高，不僅提高了目標(biāo)蛋白的胞外酶活比例和生產(chǎn)強(qiáng)度，而且不存在產(chǎn)物誘發(fā)泡沫的 問題，方便了產(chǎn)酶過程調(diào)控更有利于工業(yè)生產(chǎn)的應(yīng)用。
[0022] (2)胞外定位目標(biāo)蛋白生產(chǎn)強(qiáng)度顯著提高，例如共表達(dá)木聚糖酶的重組菌，誘 導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)間從48h可縮短至24h，胞外酶活也從582. 7U · ι?Γ1提高到了 893. 2U · mL Λ 胞外酶活占總酶活的比例從79 %提高到了 85 %，生產(chǎn)強(qiáng)度從11. 6U · ml/1 · IT1提高到了 26. 9U · ml/1 · 1Γ1，而且上罐實(shí)驗(yàn)過程中不起泡沫的現(xiàn)象。同時(shí)胞內(nèi)定位目標(biāo)蛋白的胞外分 泌量從0提高到了 83%。
【具體實(shí)施方式】
[0023] 發(fā)酵培養(yǎng)基：按 IL 計(jì)，蛋白胨 0· 9-1. lg，酵母粉 I. 9-2. lg，（ΝΗ4)2ΗΡ043· 9-4. lg， KH2P0413-14g，檸檬酸I. 5-2g，無水硫酸鎂0. 6-0. 7g，甘油7. 5-8. 5g，微量元素液 9. 5-10. 5ml，ρΗ6· 8-7. 0 微量元素液：FeSO4 ·7Η209· 5-10. 5g .171，ZnSO4 ·7Η202· 0-2. 5g .171， CuSO4 · 5Η200· 9-1. Ig · Γ1，MnSO4 · 4Η200· 45-0. 55g · Γ1，Na2B4O7 · IOH2OO. 2-0. 25g · Γ1， CaCl2L 9-2. Ig · Γ1，（MM)6Mo7O240.0 9-0.1 lg · Γ1。
[0024] 實(shí)施例1 :磷脂酶C在大腸桿菌Ε. coli BL21 (DE3)中的表達(dá)
[0025] pETDuet-1-plc重組質(zhì)粒的構(gòu)建：將pETDuet-1質(zhì)粒（購自Novagen公司）和攜帶 有磷脂酶C基因（氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示）的pMD18-T-plc進(jìn)行Nco I、Hind III 雙酶切，酶切產(chǎn)物割膠回收后，T4連接酶16°C連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E. coli JM109,涂布 于氨芐青霉素含量100 μ g 的LB瓊脂平板，37°C培養(yǎng)8-10h，挑選轉(zhuǎn)化子于氨芐青霉素 含量100 μ g · ml/1的LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)8-10h，提取質(zhì)粒，得到重組質(zhì)粒pETDuet-1-plc。
[0026] 磷脂酶C的表達(dá)與制備：將pETDuet-1-plc質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E. coli BL21 (DE3)宿主菌， 在氨芐青霉素含量100 μ g 的LB瓊脂平板上37°C培養(yǎng)8-10h，挑選轉(zhuǎn)化子在氨芐青霉 素含量100 μ g 的LB液體培養(yǎng)基中37°C培養(yǎng)8-10h，后以5%接種量接入TB液體培養(yǎng) 基（甘油 5g · L-1，蛋白胨 12g · L-1，酵母膏 24g · L-1，Κ2ΗΡ0412· 54g · L-1，ΚΗ2Ρ042· 31g · L-1) 發(fā)酵液體培養(yǎng)基（含100 μ g · ml/1氨芐青霉素）37°C培養(yǎng)2h后用0. 4mM IPTG (異丙基硫 代-β-D半乳糖苷）誘導(dǎo)約20h。
[0027] 發(fā)酵液于4°C，SOOOrpm離心10min，共表達(dá)菌發(fā)酵液上清和細(xì)胞中的磷脂酶C酶活 分別為14. 2U .πιΓ1和0. 7U ·πι廠S胞外酶活占總酶活的95. 3%。胞外酶活比例可以評(píng)判磷 脂酶C提高細(xì)胞膜透性引起的酶胞外滲漏的潛力，比例越高越好。根據(jù)磷脂酶C自身的胞 外酶活所占比例可以對(duì)此初步判斷。
[0028] 實(shí)施例2 :木聚糖酶與磷脂酶C在Ε. coli中的共表達(dá)3L罐發(fā)酵
[0029] pETDuet-1-plc-XynA 重組質(zhì)粒的構(gòu)建：PETDuet-1-plc 質(zhì)粒和克隆到 pET20b (+) 中的NCBI編號(hào)為AGM16410的木聚糖酶基因的pET20b(+)-XynA進(jìn)行Nde I和Xho I雙酶 切，酶切產(chǎn)物割膠回收后，再用T4