連接酶16°C連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E. coli JM109感受 態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布氨芐青霉素含量100 μ g 的LB瓊脂平板，經(jīng)37°C培養(yǎng)8-10h，挑 選轉(zhuǎn)化子于氨芐青霉素含量100 μ g 的LB液體培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)8-10h，然后提取質(zhì)粒， 得到重組質(zhì)粒 pETDuet-1-plc-XynA〇
[0030] 木聚糖酶的表達(dá)與制備：將pETDuet-1-plc-XynA質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E. coli BL21 (DE3)宿 主菌，在氨芐青霉素含量100 μ g · mr1的LB瓊脂平板上經(jīng)37°C培養(yǎng)8-10h，挑選轉(zhuǎn)化子在 LB液體培養(yǎng)基中37°C培養(yǎng)8-10h，保藏菌種作為上罐用菌種。
[0031] 將上述構(gòu)建的重組菌和對(duì)照菌以同樣方法進(jìn)行3L罐發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，培養(yǎng)方法為：從甘 油管中吸取100 μ L菌液，接種于含有100 μ g · mr1氨芐青霉素的工業(yè)級(jí)LB培養(yǎng)基（裝液 量50/25011^)中，37°〇、200印111.111^ 1培養(yǎng)811。將種子以10%的接種量接入11^〇^31^全自 動(dòng)發(fā)酵罐中，發(fā)酵培養(yǎng)基（微量元素液10.0 mL，甘油8. Og ·Ι^，（NH4)2HP044. Og ·Ι^，酵母粉 (工業(yè)級(jí)）2. Og · L-1，檸檬酸 I. 7g · L-1，蛋白胨（工業(yè)級(jí)）1.0 g · L-1，MgSO4 · 7Η201· 4g · L-1， ΚΗ2Ρ0413· 5g · ΙΛ 微量元素液：FeSO 4 · 7Η2010· Og · ΙΛ ZnSO4 · 7Η205· 3g · ΙΛ CuSO4 · 5Η203· Og · Γ1，MnSO4 · 4Η200· 5g · Γ1，Na2B4O7 · IOH2OO. 23g · Γ1，CaCl22. Og · I/1， (NH4)6Mo7O24O. Ig · Γ1)初始裝液量I. 2L。誘導(dǎo)前培養(yǎng)溫度為37°C，誘導(dǎo)后培養(yǎng)溫度28°C， pH7. 0,溶氧20%。當(dāng)發(fā)酵初始碳源甘油基本消耗完時(shí)，開始流加補(bǔ)料液；流加方式為指 數(shù)流加，比生長(zhǎng)速率控制在μ =〇.21ι'當(dāng)菌體干重約為7. 5左右時(shí)，加入甘氨酸，加 量為IOg · Γ1;菌體干重約為25左右時(shí)，開始誘導(dǎo)，誘導(dǎo)方法為恒速流加乳糖，乳糖加量 0.1 g 開始誘導(dǎo)后，每3h取樣一次，測(cè)定菌體干重和培養(yǎng)基中酶活變化，培養(yǎng)基中 酶活不再上升時(shí)，發(fā)酵過程結(jié)束。
[0032] 含有質(zhì)粒pETDuet-1-plc-XynA的重組菌接罐后6h培養(yǎng)基中甘油耗盡，開始流加 補(bǔ)料，接罐后15h開始流加乳糖誘導(dǎo)，誘導(dǎo)后24h胞外酶活達(dá)到最高值893. 2U · ml/1，占總 酶活的85%，生產(chǎn)強(qiáng)度約為26. TOwr1 發(fā)酵過程中沒有明顯的起泡現(xiàn)象。含有質(zhì)粒 pETDuet-1-XynA的對(duì)照菌接罐后6h培養(yǎng)基中甘油耗盡，開始流加補(bǔ)料，接罐后15. 5h開始 流加乳糖誘導(dǎo)，誘導(dǎo)后48h胞外酶活達(dá)到最高值582. 7U · ml/1，約占總酶活的79%，生產(chǎn)強(qiáng) 度 11. 6U · ml/1 · h'
[0033] 對(duì)這一木聚糖酶來說，若細(xì)胞中合成的重組蛋白不能及時(shí)轉(zhuǎn)運(yùn)，就會(huì)形成大量的 包涵體。磷脂酶C與木聚糖酶共表達(dá)時(shí)提高了細(xì)胞膜的透性，使木聚糖酶能夠及時(shí)快速的 轉(zhuǎn)運(yùn)至胞外。提高蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)速率同時(shí)降低了包涵體形成量，從而提高了木聚糖酶的胞外酶 活。對(duì)比兩者的生產(chǎn)強(qiáng)度及含有質(zhì)粒pETDuet-1-plc-XynA的重組菌上罐實(shí)驗(yàn)過程中不起 泡沫的現(xiàn)象，將木聚糖酶與Bacillus cereus磷脂酶C共表達(dá)的方法提高了木聚糖酶的生 產(chǎn)效率，同時(shí)產(chǎn)酶過程調(diào)控方便。
[0034] 實(shí)施例3 :葡萄糖異構(gòu)酶與磷脂酶C在E. coli中的共表達(dá)3L罐發(fā)酵
[0035] pETDuet-1-plc-glu 重組質(zhì)粒的構(gòu)建：將 pETDuet-1-plc 質(zhì)粒和克隆到 pET24a(+) 中的NCBI編號(hào)為AAZ55638的葡萄糖異構(gòu)酶基因的pET24a(+)-glu進(jìn)行Nde I和Xho I雙 酶切，酶切產(chǎn)物割膠回收后，再用T4連接酶16°C連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E. coli JM109感 受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布氨芐青霉素含量100 μ g · ml/1的LB瓊脂平板，經(jīng)37°C培養(yǎng)過夜， 挑選轉(zhuǎn)化子于氨芐青霉素含量100 μ g · ml/1的LB液體培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，然后提取質(zhì)粒，得 到重組質(zhì)粒 pETDuet-1-plc-gluo
[0036] 葡萄糖異構(gòu)酶的表達(dá)與制備：將pETDuet-1-plc-glu轉(zhuǎn)化E. coli BL21 (DE3)宿主 菌，在氨芐青霉素含量100 μ g · ml/1的LB固體平板上經(jīng)37°C培養(yǎng)8-10h，挑選轉(zhuǎn)化子在LB 液體培養(yǎng)基中37°C培養(yǎng)8-10h，保存菌種作為3L罐實(shí)驗(yàn)種子。
[0037] 將上述構(gòu)建的重組菌進(jìn)行3L罐發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，培養(yǎng)方法為：從甘油管中吸取100 μ L菌 液，接種于含有100 μ g 氨芐青霉素的工業(yè)級(jí)LB培養(yǎng)基（裝液量50/250mL)中，37°C、 200印111*1]1；[]^1培養(yǎng)811。將種子以10%的接種量接入11^〇^31^全自動(dòng)發(fā)酵罐中，初始裝液 量1.2匕誘導(dǎo)前后培養(yǎng)溫度均為37°0，？!17.0，溶氧20%。當(dāng)發(fā)酵初始碳源甘油基本消耗 完時(shí)，開始流加補(bǔ)料液；流加方式為指數(shù)流加，比生長(zhǎng)速率控制在μ =〇.2h'當(dāng)菌體干重 約為7. 5左右時(shí)，加入甘氨酸，加量為IOg噸、菌體干重約為25左右時(shí)，開始誘導(dǎo)，誘導(dǎo)方 法為恒速流加乳糖，乳糖加量〇. Ig · Γ1 · h'開始誘導(dǎo)后，每3h取樣一次，測(cè)定菌體干重 和培養(yǎng)基中酶活變化，培養(yǎng)基中酶活不再上升時(shí)，發(fā)酵過程結(jié)束。
[0038] 重組菌接罐后6. 5h培養(yǎng)基中甘油耗盡，開始流加補(bǔ)料，接罐后15. 5h開始誘導(dǎo)，誘 導(dǎo)后24h培養(yǎng)基中酶活達(dá)到最高30.1 U · ml/1，約占總酶活的83%，而同樣條件下沒有共表 達(dá)磷脂酶C的菌株的胞外分泌為零。3L罐實(shí)驗(yàn)過程中沒有出現(xiàn)明顯的起泡現(xiàn)象。
[0039] 雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技 術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動(dòng)與修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范 圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定的為準(zhǔn)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種促進(jìn)目標(biāo)蛋白胞外表達(dá)的方法，其特征在于，所述方法是將氨基酸序列為SEQ ID NO. 1所示的磷脂酶C基因和目標(biāo)蛋白基因在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中共表達(dá)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法具體是：將磷脂酶C基因和目標(biāo) 蛋白基因克隆到表達(dá)載體上，得到重組質(zhì)粒，然后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到宿主菌中得到重組大 腸桿菌，重組大腸桿菌發(fā)酵培養(yǎng)生產(chǎn)目標(biāo)蛋白，收集發(fā)酵上清液。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述表達(dá)質(zhì)粒為pETDuet-1、 pCOLADuet-1、pUC 系列、pET 系列、p!7-7 或 pGEX 中的任意一種。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述宿主菌為E. coli BL21 (DE3)、E. coli W3110、E.coli JM109、E.coli JM109(DE3)或 E.coli DH5a。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述目標(biāo)蛋白是天然在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的蛋 白質(zhì)或者天然分泌至細(xì)胞外的蛋白質(zhì)。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述目標(biāo)蛋白為木聚糖酶或葡萄糖異構(gòu) 酶。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法具體是：（1)獲取不含信號(hào)肽的 磷脂酶C成熟蛋白基因，連接至pMD18-T simple vector，獲得質(zhì)粒pMD18-T-plc; (2) 將pETDuet-1質(zhì)粒和pMD18-T-plc進(jìn)行雙酶切，連接酶連接過夜后，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化 入E. coli JM109感受態(tài)細(xì)胞，得到重組質(zhì)粒pETDuet-1-plc ; (3) 將PETDuet-1-plc和含有目標(biāo)蛋白基因的重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，連接酶連接 過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E. coli JM109感受態(tài)細(xì)胞，得到含有目標(biāo)蛋白基因的重組質(zhì)粒 pETDuet-1-plc ； (4) 將含有目標(biāo)蛋白基因的重組質(zhì)粒pETDuet-1-plc導(dǎo)入宿主大腸桿菌； (5) 發(fā)酵培養(yǎng)步驟（4)構(gòu)建的重組大腸桿菌生產(chǎn)目標(biāo)蛋白，收集發(fā)酵上清液。
8. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述發(fā)酵培養(yǎng)具體是：將種子以5-10% 的接種量接種，誘導(dǎo)前培養(yǎng)溫度為25-37°C，誘導(dǎo)后培養(yǎng)溫度25-37°C，pH 6. 5-7. 5,溶氧 20-30% ;當(dāng)發(fā)酵初始碳源甘油基本消耗完時(shí)，開始流加補(bǔ)料液，所述補(bǔ)料液按指數(shù)流加，比 生長(zhǎng)速率控制在U =0. 1-0. 31T1;當(dāng)菌體干重3-lOg.L-1時(shí)，加入S-lSg.L-1甘氨酸；菌體 干重15-25g ? I71時(shí)，開始誘導(dǎo)，誘導(dǎo)方法為恒速流加乳糖，乳糖加量0. 05-0. 5g ? P ? 1T1， 測(cè)定菌體干重和培養(yǎng)基中酶活變化，培養(yǎng)基中酶活不再上升時(shí)，發(fā)酵過程結(jié)束。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1-8任一所述方法得到的目標(biāo)蛋白。
10. 權(quán)利要求9所述目標(biāo)蛋白在食品、飼料、造紙領(lǐng)域的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種促進(jìn)目標(biāo)蛋白胞外表達(dá)的方法及其應(yīng)用，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。是將Bacillus cereus磷脂酶C和目標(biāo)蛋白(包括胞內(nèi)定位蛋白和胞外定位蛋白)在大腸桿菌中共表達(dá)，可提高胞外定位目標(biāo)蛋白生產(chǎn)強(qiáng)度，實(shí)現(xiàn)胞內(nèi)定位目標(biāo)蛋白胞外表達(dá)，提高生產(chǎn)效率、簡(jiǎn)化后提取工藝，具有較高的學(xué)術(shù)意義和應(yīng)用價(jià)值。
【IPC分類】C12N15-70, C12R1-19, C12N9-42, C12N15-67, C12N9-92
【公開號(hào)】CN104878033
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510213072
【發(fā)明人】吳敬, 宿玲恰, 姜琪
【申請(qǐng)人】江南大學(xué)
【公開日】2015年9月2日
【申請(qǐng)日】2015年4月29日