［s,s］-edds生物合成基因和蛋白和用于生物合成[s,s]-edds的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及用于生物合成[S,S]?乙二胺二琥珀酸（[S,S]?EDDS）的分離的核酸和蛋白或肽、表達(dá)載體和缺失載體、宿主細(xì)胞和缺失突變體、用于生物合成[S,S]?EDDS的方法和試劑盒。
【專利說明】[S, S]-EDDS生物合成基因和蛋白和用于生物合成[S, S]-EDDS 的方法
[0001 ] 說明書 應(yīng)用領(lǐng)域和現(xiàn)有技術(shù) 本發(fā)明涉及用于生物合成[S，s]-乙二胺二琥珀酸（[S，S]-EDDS)的分離的核酸和蛋白 或肽、表達(dá)載體和缺失載體、日本擬無枝酸菌(Amycolatopsis japonicum)屬的宿主細(xì)胞和 缺失突變體和用于生物合成[S，S ] -EDDS的方法和試劑盒。
[0002] 乙二胺二琥珀酸(EDDS，也被稱為乙二胺二琥珀酸）是六齒的螯合劑。EDDS具有兩 個(gè)立體中心且因此存在三個(gè)不同的立體異構(gòu)體，即[1?，1?]4003、[3,3]4003和[1?，3]-(內(nèi)消 旋）-EDDS。已證實(shí)僅有[S，S] -EDDS立體異構(gòu)體可完全生物降解（Schowanek等人， Chemosphere (1997), 34(11): 2375-91)〇
[0003] 此外，EDDS是乙二胺四乙酸（EDTA)(廣泛使用且也是六齒的螯合劑）的結(jié)構(gòu)異構(gòu) 體。這兩種化合物在其化學(xué)特征上，特別是在其與金屬離子形成絡(luò)合物的能力方面非常相 似。因此，EDDS和EDTA對(duì)一整系列的金屬離子展示出相當(dāng)?shù)慕j(luò)合物形成常數(shù)。
[0004]由于其顯著的形成絡(luò)合物的能力，數(shù)十年來EDTA已在各種不同領(lǐng)域中用于去除金 屬離子，且目前是最常用的絡(luò)合劑。其與銅（II)、鎳（II)、鐵(III)和鈷（II)離子，且也與重 金屬離子和與鈣離子和鎂離子形成特別穩(wěn)定的絡(luò)合物。
[0005] 因此，EDTA特別作為軟水劑添加至洗滌劑中，在造紙和紡織工業(yè)領(lǐng)域中用于穩(wěn)定 化漂白浴(Bleichbad)，且以鐵、銅和鋅絡(luò)合物的形式用作肥料。此外，EDTA在醫(yī)療領(lǐng)域中用 于治療重金屬中毒。
[0006] 缺點(diǎn)是EDTA不可生物降解，同時(shí)可因此在無處不在的水中檢測(cè)到。因此，其特別被 認(rèn)為是生態(tài)有害的，這是因?yàn)槠淇蓮某练e物中溶解出重金屬并因此使它們具有生物可用 性。
[0007] 在該背景下期望的是，根據(jù)可持續(xù)材料政策，通過等效的但生物可降解的化合物 取代EDTA。
[0008] 由于與m)TA相當(dāng)?shù)慕j(luò)合物形成常數(shù)，以生物可降解的立體異構(gòu)體[S，S]-EDDS形式 的EDDS通常是合適的替代物。
[0009] [S，S]-EDDS在三價(jià)鈷存在下由L-天冬氨酸和1，2_二溴甲烷的化學(xué)合成是熟知的 (Neal和Rose, Inorganic Chemistry (1968)，7(11): 2405-12)。缺點(diǎn)是在此作為毒性副 產(chǎn)物產(chǎn)生的溴化氫，其必須復(fù)雜地去除。此外，所述合成使用化石反應(yīng)物完成。
[0010] 此外，非對(duì)映選擇性的化學(xué)方法是熟知的，其中使馬來酸或馬來酸酐與乙二胺反 應(yīng)，由此除50 %的內(nèi)消旋-EDDS外還產(chǎn)生[R，R]-EDDS和[S，S]-EDDS作為外消旋混合物。然 而，由于只有[S，S]-EDDS的低產(chǎn)率和基本上非常復(fù)雜的外消旋物分離，該方法通常不適合 用于工業(yè)應(yīng)用。
[0011]用于制備[S，S]-EDDS的生物催化的方法公開于EP 0 731 171 A2。使用該文所述 的方法，可由富馬酸和乙二胺在具有裂解酶活性的微生物的作用下以高達(dá)97%的光學(xué)純度 獲得[S，S]-EDDS。另一種用于制備[S，S]-EDDS的生物催化的方法在EP 1 043 400 A1中公 開，其中可由馬來酸和乙二胺在具有馬來酸異構(gòu)酶活性的微生物和金屬離子的存在下以高 達(dá)98%的光學(xué)純度獲得[S，S]-EDDS。然而，以上兩種生物催化的方法基于使用不能由所用微 生物自身提供的合成前體。
[0012] 另外熟知的是借助細(xì)菌物種日本擬無枝酸菌生物合成[S，S]-EDDS(Zwicker等 人，Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology (1997); 19(4): 280- 285)。然而，在此的缺點(diǎn)是該生物合成依賴于鋅，且在培養(yǎng)基中2 μΜ的鋅濃度就可導(dǎo)致[S， S]-EDDS的合成幾乎完全中斷(Cebulla I.，論文（1995)，Tubingen大學(xué)）。
[0013] 在無鋅反應(yīng)條件下借助日本擬無枝酸菌通過使用優(yōu)化的培養(yǎng)基來制備[S，S]_ EDDS的方法在W0 96/36725 A1中描述。
[0014]對(duì)于[S，S]-EDDS的一般生物合成方法而言的問題特別是如下事實(shí)，即由于鋅依賴 性和與其相關(guān)的低產(chǎn)率，更大規(guī)模的合成應(yīng)用被證明是困難和不經(jīng)濟(jì)的。因此，在培養(yǎng)基和 發(fā)酵器中產(chǎn)生無鋅環(huán)境涉及巨大的費(fèi)用且?guī)缀醪豢尚小?br>[0015] 目的和實(shí)現(xiàn)方式 基于該背景，本發(fā)明的目的因此是提供用于生物合成[S，S]_EDDS的蛋白或肽、核酸、基 因簇、載體、宿主細(xì)胞、細(xì)菌細(xì)胞以及方法和試劑盒。
[0016] 該目的通過根據(jù)權(quán)利要求1、4、6和9的蛋白或肽、通過根據(jù)權(quán)利要求2、3、7和8的 核酸、通過具有權(quán)利要求5的特征的基因簇、通過根據(jù)權(quán)利要求10和13的特征的載體、通過 具有權(quán)利要求11的特征的宿主細(xì)胞、通過具有權(quán)利要求12的特征的細(xì)菌細(xì)胞、通過具有權(quán) 利要求15的特征的方法以及通過具有權(quán)利要求16的特征的試劑盒實(shí)現(xiàn)。如權(quán)利要求13定義 的載體的優(yōu)選實(shí)施方案描述在從屬權(quán)利要求14中。全部權(quán)利要求的條文在此通過明確引用 并入本說明書的內(nèi)容。
[0017] 本發(fā)明人首先成功地以日本擬無枝酸菌為例鑒定和提供能用于生物合成[S，S]_ 乙二胺二琥珀酸(在下文稱為[S，S]_EDDS)的基因和蛋白。
[0018] 此外，本發(fā)明人首先成功地解釋基于所述生物合成的鋅依賴性的機(jī)理。
[0019] 由此，特別有利的是相比于一般方法更經(jīng)濟(jì)且更高效地制備[S，S ] -EDDS，特別是 以更高產(chǎn)率和更大純度。對(duì)此，下文描述的本發(fā)明主題是基礎(chǔ)。
[0020] 在第一個(gè)方面中，本發(fā)明涉及分離的蛋白或肽，其優(yōu)選對(duì)于生物合成[S，S]-EDDS 的部分合成步驟具有功能性，即使得能夠進(jìn)行這樣的部分合成步驟。
[0021] 在本發(fā)明的范圍中，術(shù)語"生物合成"限定的不僅是[S，S]-EDDS的胞內(nèi)合成，還包 括攝取進(jìn)入細(xì)胞和從細(xì)胞排出（經(jīng)由細(xì)胞膜的運(yùn)輸）。
[0022] 所述蛋白或肽包含或由選自以下的氨基酸序列構(gòu)成：SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 3、SEQ ID No. 5、SEQ ID No. 7、SEQ ID No. 9、SEQ ID No. 11、SEQ ID No. 13、SEQ ID No. 15、SEQ ID No. 17、SEQ ID No. 19、SEQ ID No. 21、SEQ ID No. 23、SEQ ID No. 25、 SEQ ID No. 27、SEQ ID No. 29、SEQ ID No. 31、SEQ ID No. 33、SEQ ID No. 35、SEQ ID No. 37、SEQ ID No. 39、SEQ ID No. 41、SEQ ID No. 43、SEQ ID No. 45、SEQ ID No. 47、 SEQ ID No. 49、SEQ ID No. 51、SEQ ID No. 53、SEQ ID No. 55、SEQ ID No. 57和SEQ ID No. 59〇
[0023]在本發(fā)明范圍中，術(shù)語"蛋白"可以不僅是指單個(gè)本發(fā)明的蛋白或肽，還可以是指 多種不同的本發(fā)明的蛋白或肽的組合。
[0024] 本發(fā)明的蛋白或肽可以通過化學(xué)或重組，即生物技術(shù)的方式來制備。
[0025] 可選地，本發(fā)明的蛋白或肽可以源自細(xì)菌，特別是革蘭氏陽性菌，優(yōu)選源自擬無枝 酸菌屬的細(xì)菌，特別優(yōu)選源自日本擬無枝酸菌物種的細(xì)菌，或從這樣的細(xì)菌提取。
[0026] 在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述蛋白或肽包含或由選自以下的氨基酸序列構(gòu)成： SEQ ID No. 39^SEQ ID No. 4USEQ ID No. 43^SEQ ID No. 45^SEQ ID No. 47^SEQ ID No. 49、SEQ ID No. 51和SEQ ID No. 53。
[0027] 優(yōu)選地，包含或由下文給出的氨基酸序列構(gòu)成的本發(fā)明的蛋白或肽具有分別注釋 的活性： -SEQ ID No. 1 2-異丙基蘋果酸-合酶-活性， -SEQ ID No. 3 富馬酰乙酰乙酸-水解酶-活性， -SEQ ID No. 5 tRNA尿苷-5-羧甲基氨甲基-修飾酶-活性， -SEQ ID No. 7 磷酸乙醇酸-磷酸酶-活性， -SEQ ID No. 13 醇-脫氫酶_/L_蘇氨酸-脫氫酶-活性， -SEQ ID No. 17 轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子(PadR-樣)-活性， -SEQ ID No. 21 主要易化子超家族(MFS)-活性， -SEQ ID No. 23 主要易化子超家族(MFS)-活性， -SEQ ID No. 25 轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子(HTH, ArsR)-活性， -SEQ ID No. 27 雙丙氨磷-生物合成途徑-調(diào)節(jié)因子-活性， -SEQ ID No. 29 弗林蛋白酶-活性， -SEQ ID No. 33 DNA-結(jié)合活性(螺旋-翻轉(zhuǎn)-螺旋，HTH)， -SEQ ID No. 37 雙組分_轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子(LuxR)-活性， -SEQ ID No. 39 N_乙酰轉(zhuǎn)移酶活性， -SEQ ID No. 41 半胱氨酸加雙氧酶(EC 1.13.11.20)-活性， -SEQ ID No. 43 HTH型轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子-活性， -SEQ ID No. 45 酰胺酶(EC 3·5· 1 ·4)-活性， -SEQ ID No. 47 鳥氨酸環(huán)化脫氨酶(Cycloamidase)(EC 1.4.1 · 12)-活性， -SEQ ID No. 49 二氨基庚二酸_脫羧酶(EC 4.1 · 1 ·20)-活性， -SEQ ID No. 51 胱硫醚_β_合酶(EC 4.2· 1 ·22)-活性， -SEQ ID No. 53 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-活性， -SEQ ID No. 55 芽胞形成-活性， -SEQ ID No. 57 鐵攝取調(diào)節(jié)因子-活性， -SEQ ID No. 59 過氧化氫酶/過氧化物酶-活性。
[0028]包含或由根據(jù)SEQ ID No. 53的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白或肽特別用于將[S，S]_ EDDS或[S，S ] -EDDS-鋅-絡(luò)合物從細(xì)胞運(yùn)出和/或運(yùn)入細(xì)胞，或至少參與該運(yùn)輸。
[0029] 可選地，本發(fā)明的蛋白或肽可以是同源蛋白或肽，其與上述氨基酸序列之一具有 至少65%，特別是至少75%，優(yōu)選至少85%，特別優(yōu)選至少95%，最優(yōu)選至少98%的序列同一性， 即在氨基酸次序中的同一性。
[0030] 此外，本發(fā)明涉及分離的核酸，其優(yōu)選地編碼對(duì)于生物合成[S，S]-EDDS的部分合 成步驟具有功能性的，即使得能夠進(jìn)行這樣的部分合成步驟的蛋白或肽。
[0031] 所述核酸包含或由選自以下的核酸序列構(gòu)成： a) 編碼包含或由選自以下的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白或肽的核酸序列：SEQ ID No. 1、 SEQ ID No. 3、SEQ ID No. 5、SEQ ID No. 7、SEQ ID No. 9、SEQ ID No. 11、SEQ ID No. 13、SEQ ID No. 15、SEQ ID No. 17、SEQ ID No. 19、SEQ ID No. 21、SEQ ID No. 23、SEQ ID No. 25、SEQ ID No. 27、SEQ ID No. 29、SEQ ID No. 31、SEQ ID No. 33、SEQ ID No. 35、SEQ ID No. 37、SEQ ID No. 39、SEQ ID No. 41、SEQ ID No. 43、SEQ ID No. 45、SEQ ID No. 47、SEQ ID No. 49、SEQ ID No. 51、SEQ ID No. 53、SEQ ID No. 55、SEQ ID No. 57和SEQ ID No. 59; b) 通過用同義密碼子交換至少一個(gè)密碼子而不同于根據(jù)a)的核酸序列的核酸序列； c) 相當(dāng)于根據(jù)a)的核酸序列的互補(bǔ)鏈的核酸序列;和 d) 編碼與上述氨基酸序列之一具有至少65%，特別是至少75%，優(yōu)選至少85%，特別優(yōu)選 至少95%，最優(yōu)選至少98%的序列同一性的同源蛋白或肽的核酸序列。
[0032] 在本發(fā)明的范圍中，術(shù)語"核酸"可以不僅是指單個(gè)本發(fā)明的核酸，還可以是指多 種不同的本發(fā)明核酸的組合。
[0033]此外，在本發(fā)明的范圍中，術(shù)語"核酸"可以是指DNA或RNA。本發(fā)明的核酸可以特別 地選自基因或開放閱讀框(〇RF)、cDNA和mRNA。
[0034] 本發(fā)明的核酸可以通過化學(xué)或重組，即基因技術(shù)的方式來制備。
[0035] 可選地，本發(fā)明的核酸可以源自細(xì)菌，特別是革蘭氏陽性菌，優(yōu)選源自擬無枝酸菌 屬的細(xì)菌，特別優(yōu)選源自日本擬無枝酸菌物種的細(xì)菌，或從這樣的細(xì)菌提取。
[0036] 在另一個(gè)方面中，本發(fā)明涉及分離的核酸，其優(yōu)選地編碼對(duì)于生物合成[S，S]_ EDDS的部分合成步驟具有功能性的，即使得能夠進(jìn)行這樣的部分合成步驟的蛋白或肽，其 中所述核酸包含或由選自以下的序列構(gòu)成：SEQ ID No. 2、SEQ ID No. 4、SEQ ID No. 6、 SEQ ID No. 8、SEQ ID No. 10、SEQ ID No. 12、SEQ ID No. 14、SEQ ID No. 16、SEQ ID No. 18、SEQ ID No. 20、SEQ ID No. 22、SEQ ID No. 24、SEQ ID No. 26、SEQ ID No. 28、 SEQ ID No. 30、SEQ ID No. 32、SEQ ID No. 34、SEQ ID No. 36、SEQ ID No. 38、SEQ ID No. 40、SEQ ID No. 42、SEQ ID No. 44、SEQ ID No. 46、SEQ ID No. 48、SEQ ID No. 50、 SEQ ID No. 52、SEQ ID No. 54、SEQ ID No. 56、SEQ ID No. 58和SEQ ID No. 60。
[0037] 任選地，所述核酸可以是同源核酸序列，其與先前段落中提及的核酸序列之一具 有至少65%，特別是至少75%，優(yōu)選至少85%，特別優(yōu)選至少95%，最優(yōu)選至少98%的序列同一 性，即在核苷酸次序中的同一性。
[0038] 上述核酸序列優(yōu)選如下進(jìn)行編碼： -SEQ ID No. 2編碼根據(jù)SEQ ID No. 1的氨基酸序列； -SEQ ID No. 4編碼根據(jù)SEQ ID No. 3的氨基酸序列； -SEQ ID No. 6編碼根據(jù)SEQ ID No. 5的氨基酸序列； -SEQ ID No. 8編碼根據(jù)SEQ ID No. 7的氨基酸序列； -SEQ ID No. 10編碼根據(jù)SEQ ID No. 9的氨基酸序列； -SEQ ID No. 12編碼根據(jù)SEQ ID No. 11的氨基酸序列； -SEQ ID No. 14編碼根據(jù)SEQ ID No. 13的氨基酸序列； -SEQ ID No. 16編碼根據(jù)SEQ ID No. 15的氨基酸序列； -SEQ ID No. 18編碼根據(jù)SEQ ID No. 17的氨基酸序列； -SEQ ID No. 20編碼根據(jù)SEQ ID No. 19的氨基酸序列； -SEQ ID No. 22編碼根據(jù)SEQ ID No. 21的氨基酸序列； -SEQ ID No. 24編碼根據(jù)SEQ ID No. 23的氨基酸序列； -SEQ ID No. 26編碼根據(jù)SEQ ID No. 25的氨基酸序列； -SEQ ID No. 28編碼根據(jù)SEQ ID No. 27的氨基酸序列； -SEQ ID No. 30編碼根據(jù)SEQ ID No. 29的氨基酸序列； -SEQ ID No. 32編碼根據(jù)SEQ ID No. 31的氨基酸序列； -SEQ ID No. 34編碼根據(jù)SEQ ID No. 33的氨基酸序列； -SEQ ID No. 36編碼根據(jù)SEQ ID No. 35的氨基酸序列； -SEQ ID No. 38編碼根據(jù)SEQ ID No. 37的氨基酸序列； -SEQ ID No. 40編碼根據(jù)SEQ ID No. 39的氨基酸序列； -SEQ ID No. 42編碼根據(jù)SEQ ID No. 41的氨基酸序列； -SEQ ID No. 44編碼根據(jù)SEQ ID No. 43的氨基酸序列； -SEQ ID No. 46編碼根據(jù)SEQ ID No. 45的氨基酸序列； -SEQ ID No. 48編碼根據(jù)SEQ ID No. 47的氨基酸序列； -SEQ ID No. 50編碼根據(jù)SEQ ID No. 49的氨基酸序列； -SEQ ID No. 52編碼根據(jù)SEQ ID No. 51的氨基酸序列； -SEQ ID No. 54編碼根據(jù)SEQ ID No. 53的氨基酸序列； -SEQ ID No. 56編碼根據(jù)SEQ ID No. 55的氨基酸序列； -SEQ ID No. 58編碼根據(jù)SEQ ID No. 57的氨基酸序列； -SEQ ID No. 60編碼根據(jù)SEQ ID No. 59的氨基酸序列。
[0039] 在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述核酸包含或由選自以下的核酸序列構(gòu)成：SEQ ID No. 40、SEQ ID No. 42、SEQ ID No. 44、SEQ ID No. 46、SEQ ID No. 48、SEQ ID No. 50、 SEQ ID No. 52和SEQ ID No. 54。
[0040] 在另一個(gè)方面中，本發(fā)明涉及分離的蛋白或肽，其優(yōu)選對(duì)于生物合成[S，S]-EDDS 的部分合成步驟具有功能性，即使得能夠進(jìn)行這樣的部分合成步驟，其中所述蛋白或肽通 過基因或開放閱讀框的表達(dá)來制備，且所述基因或開放閱讀框包含或由選自以下的核酸序 列構(gòu)成：SEQ ID No. 2、SEQ ID No. 4、SEQ ID No. 6、SEQ ID No. 8、SEQ ID No. 10、SEQ ID No. 12、SEQ ID No. 14、SEQ ID No. 16、SEQ ID No. 18、SEQ ID No. 20、SEQ ID No. 22、SEQ ID No. 24、SEQ ID No. 26、SEQ ID No. 28、SEQ ID No. 30、SEQ ID No. 32、SEQ ID No. 34、SEQ ID No. 36、SEQ ID No. 38、SEQ ID No. 40、SEQ ID No. 42、SEQ ID No. 44、SEQ ID No. 46、SEQ ID No. 48、SEQ ID No. 50、SEQ ID No. 52、SEQ ID No. 54、SEQ ID No. 56、SEQ ID No. 58和SEQ ID No. 60。
[0041] 可選地，所述蛋白或肽可通過同源基因或開放閱讀框的表達(dá)來制備，所述同源基 因或開放閱讀框與先前段落中提及的核酸序列之一具有至少65%，特別是至少75%，優(yōu)選至 少85%，特別優(yōu)選至少95%，最優(yōu)選至少98%的序列同一性，即在核苷酸次序中的同一性。
[0042 ]優(yōu)選的是，所述蛋白或肽通過包含或由選自以下的核酸序列構(gòu)成的基因或開放閱 讀框的表達(dá)來制備：SEQ ID No. 40、SEQ ID No. 42、SEQ ID No. 44、SEQ ID No. 46、SEQ ID No. 48、SEQ ID No. 50、SEQ ID No. 52和SEQ ID No. 54。
[0043] 此外，本發(fā)明包括分離的基因簇或操縱子，其優(yōu)選對(duì)于[S，S]_EDDS的生物合成具 有功能性，即使得能夠進(jìn)行這樣的生物合成。
[0044] 上文提及的操縱子通常進(jìn)一步包含啟動(dòng)子，特別是一個(gè)或任選多個(gè)操縱基因。
[0045] 所述基因簇或操縱子包含或由至少兩個(gè)選自以下的核酸序列構(gòu)成：SEQ ID No. 2、SEQ ID No. 4、SEQ ID No. 6、SEQ ID No. 8、SEQ ID No. 10、SEQ ID No. 12、SEQ ID No. 14、SEQ ID No. 16、SEQ ID No. 18、SEQ ID No. 20、SEQ ID No. 22、SEQ ID No. 24、 SEQ ID No. 26、SEQ ID No. 28、SEQ ID No. 30、SEQ ID No. 32、SEQ ID No. 34、SEQ ID No. 36、SEQ ID No. 38、SEQ ID No. 40、SEQ ID No. 42、SEQ ID No. 44、SEQ ID No. 46、 SEQ ID No. 48、SEQ ID No. 50、SEQ ID No. 52、SEQ ID No. 54、SEQ ID No. 56、SEQ ID No. 58、SEQ ID No. 60及其組合。
[0046] 所述基因簇或操縱子可特別地包含先前段落提及的全部氨酸序列或由其構(gòu)成。
[0047] 代替上文提及的核酸序列，所述基因簇或操縱子還可以包含或由同源核酸序列構(gòu) 成，所述同源核酸序列與先前段落中提及的核酸序列之一具有至少65%，特別是至少75%，優(yōu) 選至少85%，特別優(yōu)選至少95%，最優(yōu)選至少98%的序列同一性，即在核苷酸次序中的同一性。 [0048]優(yōu)選地，所述基因簇或操縱子包含或由至少兩個(gè)選自以下的核酸序列構(gòu)成：SEQ ID No. 40^SEQ ID No. 42^SEQ ID No. 44^SEQ ID No. 46^SEQ ID No. 48^SEQ ID No. 50、SEQ ID No. 52、SEQ ID No. 54及其組合。
[0049] 名稱基因簇來源于如下發(fā)現(xiàn)，即細(xì)菌和多種真核生物通常使用協(xié)調(diào)機(jī)制來調(diào)節(jié)其 產(chǎn)物(蛋白或肽)參與相關(guān)聯(lián)的過程例如生物合成的基因。這種基因共同存在于被稱為基因 簇的結(jié)構(gòu)中的單個(gè)染色體上，并可以在單個(gè)調(diào)節(jié)序列或多個(gè)調(diào)節(jié)序列的控制下經(jīng)歷共轉(zhuǎn) 錄?；虼卦瓌t上還可以包含多個(gè)啟動(dòng)子且也可受多個(gè)調(diào)節(jié)因子控制?；虼?、啟動(dòng)子和在 調(diào)節(jié)時(shí)協(xié)同作用的任選另外的序列也可以被稱為操縱子。
[0050] 在另一個(gè)方面中，本發(fā)明涉及分離的蛋白或肽，其優(yōu)選對(duì)于抑制或壓制[s，s]- m)DS的生物合成具有功能性，即實(shí)現(xiàn)這樣的抑制或壓制。優(yōu)選地，所述蛋白或肽是用于生物 合成[S，S]-EDDS的轉(zhuǎn)錄抑制因子或阻抑物。
[0051 ]所述蛋白或肽包含或由根據(jù)SEQ ID No. 61的氨基酸序列構(gòu)成。
[0052]可選地，所述蛋白或肽可以包含或由同源氨基酸序列構(gòu)成，所述同源氨基酸序列 與先前段落中提及的氨基酸序列具有至少65%，特別是至少75%，優(yōu)選至少85%，特別優(yōu)選至 少95%，最優(yōu)選至少98%的序列同一性。
[0053]所述蛋白優(yōu)選是鋅攝取調(diào)節(jié)因子蛋白，所謂的ZuK鋅攝取調(diào)節(jié)因子)_蛋白，即是 對(duì)鋅的細(xì)胞攝取具有調(diào)節(jié)活性的蛋白。通常，Zur蛋白能夠結(jié)合特定濃度以上的鋅離子，且 通過鋅依賴性基因抑制或基因表達(dá)調(diào)節(jié)細(xì)菌細(xì)胞中的鋅平衡(Zinkhaushalt)。在很多細(xì)菌 中介導(dǎo)基因的這種鋅依賴性調(diào)節(jié)，其中鋅飽和的Zur蛋白，所謂的holoZur蛋白結(jié)合到相應(yīng) 靶基因上游的特定核酸序列，以使得對(duì)靶基因的轉(zhuǎn)錄必要的酶RNA聚合酶被阻止接近靶基 因。由此，防止靶基因的轉(zhuǎn)錄。用作Zur結(jié)合位點(diǎn)的特定核酸序列通常為啟動(dòng)子/啟動(dòng)子區(qū)域 或操縱基因。
[0054]因?yàn)榛蛞种苹蚧虮磉_(dá)的鋅依賴性調(diào)節(jié)取決于細(xì)胞內(nèi)部和細(xì)胞外部的鋅離子 濃度，這種系統(tǒng)還特別適合作為確定鋅離子濃度的報(bào)告系統(tǒng)。
[0055] 如將在下文實(shí)施例部分更詳細(xì)解釋那樣以日本擬無枝酸菌為例，本發(fā)明人令人驚 訝地已發(fā)現(xiàn)，在鋅存在下由于包含或由根據(jù)SEQ ID No. 61的氨基酸序列構(gòu)成的本發(fā)明的 蛋白或肽被抑制的靶基因，特別是用于制備[S，S]-EDDS的生物合成基因。關(guān)于所述生物合 成基因的核酸序列，參考上文說明書中所述的序列。
[0056] 在另一個(gè)方面中，本發(fā)明涉及分離的核酸，其優(yōu)選地編碼對(duì)于抑制或壓制[S，S]_ H)DS的生物合成具有功能性的，即實(shí)現(xiàn)這樣的抑制或壓制的蛋白或肽。
[0057] 所述核酸包含或由選自以下的核酸序列構(gòu)成： a) 編碼包含或由根據(jù)SEQ ID No. 61的氨基酸序列構(gòu)成的本發(fā)明的蛋白或肽的核酸序 列； b) 通過用同義密碼子交換至少一個(gè)密碼子而不同于根據(jù)a)的核酸序列的核酸序列； c) 相當(dāng)于根據(jù)a)的核酸序列的互補(bǔ)鏈的核酸序列;和 d) 編碼與根據(jù)SEQ ID No. 61的氨基酸序列具有至少55%，特別是至少75%，優(yōu)選至少 85%，特別優(yōu)選至少95%，最優(yōu)選至少98%的序列同一性的同源蛋白或肽的核酸序列。
[0058]此外，本發(fā)明涉及分離的核酸，其優(yōu)選地編碼對(duì)于抑制或壓制[S，S]_EDDS的生物 合成具有功能性的，即實(shí)現(xiàn)這樣的抑制或壓制的蛋白或肽，且包含或由根據(jù)SEQ ID No. 62 的核酸序列構(gòu)成。
[0059] 可選地，所述核酸可以是同源核酸，其與先前段落提及的核酸序列具有至少65%， 特別是至少75%，優(yōu)選至少85%，特別優(yōu)選至少95%，最優(yōu)選至少98%的序列同一性。
[0060] 此外，本發(fā)明包括分離的蛋白或肽，其優(yōu)選對(duì)于抑制或壓制[S，S]-EDDS的生物合 成具有功能性，即實(shí)現(xiàn)這樣的抑制或壓制，且通過包含或由根據(jù)SEQ ID No. 62的核酸序列 的基因或開放閱讀框的表達(dá)來制備。
[0061] 可選地，所述蛋白或肽可通過與先前段落提及的核酸序列具有至少65%，特別是至 少75%，優(yōu)選至少85%，特別優(yōu)選至少95%，最優(yōu)選至少98%的序列同一性，即在核苷酸次序中 的同一性的同源基因或開放閱讀框的表達(dá)來制備。
[0062] 在另一個(gè)方面中，本發(fā)明涉及人工或重組的，即通過基因技術(shù)制備的表達(dá)載體，即 用于將至少一種核酸轉(zhuǎn)移到受體或宿主細(xì)胞中的媒介物，其在基因表達(dá)的范圍內(nèi)表達(dá)由所 述至少一種核酸編碼的至少一種蛋白或肽。
[0063] 所述表達(dá)載體包含至少一種本發(fā)明的核酸。然而，可優(yōu)選的是，該表達(dá)載體不含有 包含或由根據(jù)SEQ ID No. 62的序列構(gòu)成或包含其同源序列的本發(fā)明核酸。
[0064] 可選地，所述表達(dá)載體可以包含本發(fā)明的基因簇或操縱子或整合元件。
[0065] 所述表達(dá)載體基本上可以是質(zhì)?；蛘沉?。優(yōu)選的是如下質(zhì)?；蛘沉?，其可被整合 到放線菌的染色體中或以可復(fù)制的質(zhì)粒或粘粒的形式存在于細(xì)胞中并包含相應(yīng)的組成型 或誘導(dǎo)型(可調(diào)節(jié)）啟動(dòng)子。
[0066]在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述表達(dá)載體是pRM家族的質(zhì)粒，特別是pRM4型質(zhì)粒， 其中插入了至少一種本發(fā)明的核酸或本發(fā)明的基因簇。
[0067] 根據(jù)一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案，所述表達(dá)載體包含不具有鋅抑制的啟動(dòng)子(無鋅 抑制的啟動(dòng)子），即不經(jīng)歷鋅調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子。
[0068] 所述啟動(dòng)子基本上可以是組成型或誘導(dǎo)型（可調(diào)節(jié)）啟動(dòng)子。優(yōu)選地，所述啟動(dòng)子 是強(qiáng)大組成型表達(dá)或誘導(dǎo)型的啟動(dòng)子，其替代存在于細(xì)胞內(nèi)的Zur靶向啟動(dòng)子。在該情況 中，本發(fā)明的核酸或基因簇的表達(dá)在非鋅依賴性啟動(dòng)子的控制下是特別有利的。所述啟動(dòng) 子特別不具有對(duì)于根據(jù)SEQ ID No. 61的本發(fā)明蛋白的結(jié)合位點(diǎn)。不具有鋅抑制的優(yōu)選啟 動(dòng)子是例如啟動(dòng)子ermE(紅霉素抗性基因啟動(dòng)子，PermE)。
[0069] 在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，表達(dá)載體包含本發(fā)明的核酸，其中該核酸包括或由選 自以下的核酸序列構(gòu)成：SEQ ID No. 40、SEQ ID No. 42、SEQ ID No. 44、SEQ ID No. 46、 SEQ ID No. 48、SEQ ID No. 50、SEQ ID No. 52、SEQ ID No. 54及其組合。
[0070] 特別優(yōu)選的核酸序列可選自SEQ ID No. 48、SEQ ID No. 50、SEQ ID No. 52、SEQ ID No. 54及其組合。
[0071] 本發(fā)明的表達(dá)載體適合于進(jìn)行同源表達(dá)且也適合于進(jìn)行異源表達(dá)。
[0072] 關(guān)于所述表達(dá)載體，特別是本發(fā)明的核酸以及本發(fā)明的基因簇和操縱子的其它特 征和優(yōu)點(diǎn)，完全引用上文說明書。
[0073] 在另一個(gè)方面中，本發(fā)明涉及人工或重組的，即通過生物技術(shù)制備的宿主細(xì)胞。 [0074]所述宿主細(xì)胞優(yōu)選是產(chǎn)生[S，S]_EDDS的宿主細(xì)胞。
[0075] 所述宿主細(xì)胞的特征在于其包含至少一種本發(fā)明的核酸。可選或組合地，所述宿 主細(xì)胞的特征還在于其包含至少一種本發(fā)明的蛋白或肽。
[0076] 可選或組合地，所述宿主細(xì)胞特征還在于其包含本發(fā)明的基因簇或操縱子。
[0077] 可選或組合地，所述宿主細(xì)胞的特征還在于其包含根據(jù)本發(fā)明的表達(dá)載體。可選 或組合地，所述宿主細(xì)胞可包含由于所述載體(或載體基因組）的至少部分，特別是完全插 入而以修飾形式存在的基因組。
[0078] 就[S，S]_EDDS的生物合成而言優(yōu)選的是，在宿主細(xì)胞中不允許鋅抑制。
[0079] 特別優(yōu)選地，所述宿主細(xì)胞不包含編碼Zur蛋白的核酸，特別是不包含根據(jù)核酸序 列SEQ ID No. 62的核酸或其同源核酸，和/或不包含Zur蛋白，特別是不包含根據(jù)氨基酸序 列SEQ ID No. 61的蛋白或肽或其同源蛋白或肽。
[0080] 所述宿主細(xì)胞基本上是真核細(xì)胞或原核細(xì)胞。
[0081] 此外，所述宿主細(xì)胞可以是同源或異源宿主細(xì)胞。
[0082] 所述宿主細(xì)胞可特別選自：細(xì)菌細(xì)胞、酵母細(xì)胞和真菌細(xì)胞。
[0083] 在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述宿主細(xì)胞是格蘭仕陽性菌，優(yōu)選是擬無枝酸菌 屬或鏈霉菌屬的細(xì)菌，特別優(yōu)選是日本擬無枝酸菌或天藍(lán)色鏈霉菌物種的細(xì)菌。
[0084] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述宿主細(xì)胞可以借助轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)染或接合特別通過使 用本發(fā)明的表達(dá)載體來制備或可制備。
[0085] 如先前段落提及的用于將特別是DNA和RNA的（外源)核酸引入真核和原核細(xì)胞的 技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員基本熟知的。它們是分子遺傳學(xué)的基本程序。關(guān)于詳細(xì)描述，因此參 考相關(guān)技術(shù)文獻(xiàn)（例如，Miilhardt C·，Der Experimentator: Molekularbiologie/ Genomics (2008); Spektrum Verlag，第6版；或Kieser T.等人，Practical Streptomyces Genetics (2000);John Innes Foundation ;或Green和Sambrook， Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2012)；Cold Spring Harbor Laboratory, 第4版)。
[0086] 關(guān)于所述宿主細(xì)胞，特別是本發(fā)明的核酸，本發(fā)明的基因簇和操縱子，本發(fā)明的蛋 白或肽和本發(fā)明的表達(dá)載體的其它特征和優(yōu)點(diǎn)，完全引用上文說明書。
[0087] 本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及人工或重組的，即通過生物技術(shù)制備和優(yōu)選產(chǎn)生[S，S]_ m)DS的細(xì)菌細(xì)胞，優(yōu)選是擬無枝酸菌屬，特別是日本擬無枝酸菌物種的細(xì)菌細(xì)胞。
[0088] 所述細(xì)菌細(xì)胞的特征在于，其不表達(dá)包含或由根據(jù)氨基酸序列SEQ ID No. 61構(gòu) 成的蛋白或肽和/或不含有包含由根據(jù)核酸序列SEQ ID No. 62構(gòu)成的核酸。
[0089]本發(fā)明的細(xì)菌細(xì)胞可特別地通過將包含或由根據(jù)核酸序列SEQ ID No. 62構(gòu)成的 核酸從該細(xì)菌細(xì)胞的基因組，特別是野生型基因組中至少部分，優(yōu)選完全地缺失來制備或 可制備。在此，所述缺失可由轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)染或接合產(chǎn)生。也就是說，本發(fā)明的細(xì)菌細(xì)胞可 優(yōu)選是缺失突變體。替代本段落中提及的缺失，還可考慮堿基對(duì)的交換、點(diǎn)突變和/或通過 插入的失活。
[0090] 此外，本發(fā)明的細(xì)菌細(xì)胞還可通過將包含或由根據(jù)核酸序列SEQ ID No. 62構(gòu)成 的核酸以例如質(zhì)粒或基因盒的形式插入細(xì)菌細(xì)胞的基因組，特別是野生型基因組來制備或 可制備。
[0091] 關(guān)于所述細(xì)菌細(xì)胞，特別是先前段落中提及的核酸和先前段落中提及的蛋白或肽 的其它特征和優(yōu)點(diǎn)，全部引用上文說明書。
[0092] 本發(fā)明的另一個(gè)方面設(shè)計(jì)人工或重組的，即通過基因技術(shù)制備的載體，其用于從 擬無枝酸菌屬，優(yōu)選日本擬無枝酸菌的細(xì)菌細(xì)胞的基因組，特別是野生型基因組中產(chǎn)生核 酸的缺失(缺失載體），其中被缺失的核酸包含或由根據(jù)核酸序列SEQ ID No. 62構(gòu)成。
[0093] 所述載體的特征在于，其包含至少一種在細(xì)菌細(xì)胞基因組中相對(duì)于根據(jù)SEQ ID No. 62的核酸序列而言設(shè)置在上游的核酸序列，和/或至少一種在細(xì)菌細(xì)胞基因組中相對(duì) 于根據(jù)SEQ ID No. 62的核酸序列而言設(shè)置在下游的核酸序列，但不包含根據(jù)SEQ ID No. 62的核酸序列。
[0094] 根據(jù)一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，所述至少一種設(shè)置在上游的核酸序列和/或至少一種 設(shè)置在下游的核酸序列(分別)是與要被缺失的根據(jù)SEQ ID No. 62的核酸序列直接相鄰的 序列。優(yōu)選地，所述至少一種設(shè)置在下游的核酸序列是根據(jù)SEQ ID No. 63的序列，而至少 一種設(shè)置在上游的序列是根據(jù)SEQ ID No. 64的序列。
[0095] 關(guān)于所述至少一種設(shè)置在上游的核酸序列和/或至少一種設(shè)置在下游的核酸序 列，進(jìn)一步優(yōu)選的是它們(分別）包含至少300個(gè)，優(yōu)選至少500個(gè)，特別是至少1000個(gè)，最優(yōu) 選至少1500個(gè)核苷酸。
[0096]根據(jù)SEQ ID No. 62的核酸序列的缺失特別有利地導(dǎo)致[S，S]-EDDS的生物合成不 依賴于鋅，因?yàn)槟芙Y(jié)合鋅的抑制蛋白Zur不再能被表達(dá)。
[0097]缺失載體的進(jìn)一步的特征和優(yōu)點(diǎn)全部引用上文說明書。
[0098]在另一個(gè)方面中，本發(fā)明涉及生物合成[S，S]_EDDS的方法，其包括以下步驟： a)培養(yǎng)本發(fā)明的產(chǎn)生[S，S]-EDDS的宿主細(xì)胞和/或細(xì)菌細(xì)胞，和 b )從該細(xì)胞和/或用于該細(xì)胞的培養(yǎng)基中提純[S，S ] -EDDS。
[0099] 在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過將本發(fā)明的缺失載體引入細(xì)菌細(xì)胞，特別是野生 型細(xì)菌細(xì)胞來制備所述細(xì)菌細(xì)胞。所述載體的引入可通過轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)染或接合進(jìn)行。
[0100] 根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，所述宿主細(xì)胞通過將本發(fā)明的表達(dá)載體引入該細(xì)胞來制 備。
[0101 ]優(yōu)選地，通過將本發(fā)明的表達(dá)載體引入擬無枝酸菌屬，特別地日本擬無枝酸菌物 種的細(xì)菌細(xì)胞，制備所述宿主細(xì)胞。
[0102] 在一個(gè)可選實(shí)施方案中，通過將本發(fā)明的表達(dá)載體引入鏈霉菌屬，特別是天藍(lán)色 鏈霉菌物種的細(xì)菌細(xì)胞，制備所述宿主細(xì)胞。
[0103] 在本發(fā)明方法的范圍內(nèi)所用細(xì)胞的培養(yǎng)可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員本身熟知的標(biāo) 準(zhǔn)方案進(jìn)行。
[0104] 取決于所用宿主細(xì)胞或細(xì)菌細(xì)胞，可有利的是，在無鋅，特別是無鋅鹽的條件下培 養(yǎng)所述宿主細(xì)胞或細(xì)菌細(xì)胞。
[0105] 根據(jù)本發(fā)明可設(shè)定，向用于培養(yǎng)的培養(yǎng)基添加至少一種用于生物合成[S，S]-EDDS 的前體化合物。合適的前體化合物的實(shí)例基本上可為蛋白原和/或非蛋白原氨基酸。合適的 前體化合物可特別選自L-鳥氨酸、L-絲氨酸、L-脯氨酸、2,3_二氨基丙酸、L-天冬氨酸、L-賴 氨酸及其組合。
[0106] 根據(jù)本發(fā)明還可設(shè)定，在提純[S，S]-EDDS前首先對(duì)產(chǎn)生的[S，S]-EDDS進(jìn)行濃度確 定。這例如可通過HPLC(高效液相層析）、UV/VIS光譜或兩種技術(shù)的組合進(jìn)行。
[0107] 對(duì)于[S，S]-EDDS的進(jìn)一步提純，可進(jìn)行分離固體(細(xì)胞)成分的分離步驟。在此之 后，可借助離子交換劑吸附與隨后的沉淀結(jié)晶進(jìn)行[S，S]-EDDS的分離。
[0108] 這種方法是現(xiàn)有技術(shù)熟知的。是否[S，S]-EDDS存在于胞內(nèi)并例如還必須通過細(xì)胞 裂解才可得或是否其從輸出系統(tǒng)分泌到上清液，這對(duì)于提純基本不重要。
[0109] 關(guān)于本方法，特別是本發(fā)明的核酸，本發(fā)明的基因簇和操縱子，本發(fā)明的蛋白或肽 以及本發(fā)明的載體，特別是本發(fā)明的缺失載體和表達(dá)載體的其它特征和優(yōu)點(diǎn)全部引用上文 說明書。
[0110]在另一個(gè)方面中，本發(fā)明涉及用于生物合成[S，S]-EDDS的試劑盒，其包含至少一 種選自以下的組分:至少一種本發(fā)明的蛋白或肽、至少一種本發(fā)明的核酸、本發(fā)明的基因簇 或操縱子、本發(fā)明的載體(表達(dá)載體和/或缺失載體）、本發(fā)明的宿主細(xì)胞、本發(fā)明的細(xì)菌細(xì) 胞及其組合。
[0111] 任選地，所述試劑盒可包含選自以下的附加組分:培養(yǎng)基、緩沖液及其組合。
[0112] 關(guān)于所述試劑盒，特別是本發(fā)明的核酸，本發(fā)明的基因簇和操縱子，本發(fā)明的蛋白 或肽以及本發(fā)明的載體，特別是本發(fā)明的缺失載體和表達(dá)載體的其它特征和優(yōu)點(diǎn)，同樣全 部引用上文說明書。
[0113] 本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點(diǎn)通過下文給出的實(shí)例連同附圖和從屬權(quán)利要求變得顯 而易見。特別地，通過對(duì)[S，S]_EDDS生物合成基因簇的鑒定和注釋的描述更詳細(xì)地描述本 發(fā)明。在實(shí)施方案中，本發(fā)明的單個(gè)特征可單獨(dú)或與多個(gè)其它特征組合著實(shí)現(xiàn)。
[0114] 附圖描述 圖1顯示了推定的[S，S]-EDDS生物合成途徑的示意圖。(A) [S，S]-EDDS生物合成途徑。 (I)提供Dap前體;將L-絲氨酸與作為氨基供體的L-鳥氨酸和作為輔因子的PLP進(jìn)行轉(zhuǎn)化， 并釋放L-脯氨酸。Dap與草酰乙酸反應(yīng)生成頂1。（11)使L-天冬氨酸和L-絲氨酸在作為輔因 子的PLP的存在下反應(yīng)生成IMljB)雙效菌素(Zwittermycin) A的化學(xué)結(jié)構(gòu)（左）。虛線框 表示Dap基本單元。Dap的生物合成途徑(右)通過雙效菌素 A5A(ZWA5A，半胱氨酸合成酶的同 系物)和雙效菌素 A5B( ZWA5B，鳥氨酸環(huán)化脫氨酶的同系物)的一致協(xié)同作用來催化。
[0115]圖2顯示了具有相應(yīng)生物合成基因和所屬基因簇的[S，S]_EDDS生物合成途徑。 (A) [S，S]-EDDS生物合成基因簇的基因組成。N-乙酰轉(zhuǎn)移酶(SEQ ID No. 40 (orfl658))、 半胱氨酸加雙氧酶（SEQ ID No. 42 (orfl659))、HTH-型轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子（SEQ ID No. 44 (orfl660))、酰胺酶（SEQ ID No. 46 (orfl661))、鳥氨酸環(huán)化脫氨酶（SEQ ID No. 48 (orf!662))、二氨基庚二酸脫羧酶（SEQ ID No. 50 (orfl663))、Dap合酶（SEQ ID No. 52 (orfl664))和多藥運(yùn)出轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（SEQ ID No. 54 (〇"1665))。（8)通過將L-絲氨酸與作 為氨基供體的L-鳥氨酸和作為輔因子的PLP進(jìn)行轉(zhuǎn)化，通過鳥氨酸環(huán)化脫氨酶和Dap合酶的 協(xié)同作用催化，提供Dap的前體。（C)將Dap前體化合物和兩個(gè)草酰乙酸裝配成為[S，S]_ EDDS。箭頭標(biāo)記了基因簇(A)的相應(yīng)基因。
[0116] 圖3顯示了使用RT-PCR獲得的日本擬無枝酸菌中[S，S]-EDDS生物合成基因簇的 痕量金屬依賴型轉(zhuǎn)錄模式。使用sigB作為管家基因以將RNA規(guī)范化。由在不存在任何痕量元 素(_)或添加有25 μΜ ?62+、2112+、附2+、0)2+或血 2+溶液的特定培養(yǎng)基中培養(yǎng)的培養(yǎng)物獲得 RNA。在10 h和70 h溫育后提取樣品。
[0117] 圖4顯示了日本擬無枝酸菌WT(野生型）和日本擬無枝酸菌突變體ΔΟΓΠ 662-64 在M7培養(yǎng)基中培養(yǎng)72 h后的上清液的HPLC-UV/VIS分析。（上）[S，S ] -EDDS標(biāo)準(zhǔn)品[350 mg/ L]。（中）日本擬無枝酸菌WT。（下）日本擬無枝酸菌Δ orf 1662-64。（右）[S，S]-EDDS的特異性 UV/VIS 光譜。
[0118] 圖5顯示了天藍(lán)色鏈霉菌WT和天藍(lán)色鏈霉菌pTWPLl-EDDS在M7培養(yǎng)基中培養(yǎng)72 h 后的上清液的HPLC-UV/VIS分析。（上）[S，S]-EDDS標(biāo)準(zhǔn)品[350 mg/L]。（中）天藍(lán)色鏈霉菌 WT。（下)天藍(lán)色鏈霉菌pTWPLl-EDDS。（右）[S，S]-EDDS的特異性UV/VIS光譜。
[0119] 圖6顯示了天藍(lán)色鏈霉菌Zur(ZurSG)和日本擬無枝酸菌0RF5768(SEQ ID No. 62) 的氨基酸序列比對(duì)。（上）Zursc單體:DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域n(殘基1-77)無下劃線；鉸鏈環(huán)（殘基 78-85)實(shí)線下劃線；二聚結(jié)構(gòu)域c(殘基86-139)虛線下劃線。通過星號(hào)（*)標(biāo)記相同的氨基 酸；通過圓圈（°)標(biāo)記相似的殘基。鋅結(jié)合位點(diǎn)：箭頭：211咖:065工79、!185、!187和01^5768:D70、C84、H89和H9UM位點(diǎn)中的相對(duì)aa距離的偏差(標(biāo)記為MXD-位點(diǎn)（標(biāo)記為D):Zursc:H84、 H86、E105、H122 和 0RF5768:H88、H90、E109、H126<X4t€(#ESC):Zursc :C90、C93、C130、 C133和0RF5768:C94、C97、C134、H137。
[0120] 圖7顯示了天藍(lán)色鏈霉菌和枯草芽孢桿菌(B. subtilis)MntABC與日本擬無枝酸 菌同系物的BLAST比對(duì)。（A)天藍(lán)色鏈霉菌znuABC，日本擬無枝酸菌的操縱子樣結(jié)構(gòu) 〇"3699、〇"3700、〇"3702和〇"6504、〇"6505、〇"6506的基因組織。（8)氨基酸序列比 對(duì)，（上）0RF3699、0RF3700和0RF3702;(下）0RF6504、0RF6505和0RF6506;對(duì)比天藍(lán)色鏈霉菌 ZnuABC(左）;對(duì)比枯草芽孢桿菌MntABC(右hX/X = %同一性/相似性。
[0121]圖8顯示了使用RT-PCR獲得的日本擬無枝酸菌的金屬攝取系統(tǒng)的痕量金屬依賴 型轉(zhuǎn)錄模式。使用sigB作為管家基因以將RNA規(guī)范化。由在不存在任何痕量元素(-)或添加 有25 μΜ ?62+、2112+、附2+、0)2+或此 2+溶液的特定17培養(yǎng)基中培養(yǎng)的培養(yǎng)物獲得1?嫩。在溫育 10 h和70 h后提取樣品。選擇orf3700和orf6504作為探針以代表整個(gè)操縱子樣結(jié)構(gòu)。
[0122] 圖9顯示了所用EMSA-DNA探針的示意圖。（上）日本擬無枝酸菌（orf3699 - orf3702)的znuABC基因座。（下）[S，S]-EDDS生物合成基因簇orfl658 - orfl665(對(duì)應(yīng)于 SEQ ID No. 40、42、44、46、48、50、52、54)。使用開放圓圈標(biāo)記具有21^〗結(jié)合位點(diǎn)的啟動(dòng)子 區(qū)域，且用于測(cè)試His-0RF5768結(jié)合的EMSA探針通過黑線說明。
[0123] 圖10顯示了EMS測(cè)定的結(jié)果（根據(jù)溴化乙錠染色的聚丙烯酰胺凝膠）：提純的 Hi S6-0RF5768與啟動(dòng)子區(qū)域的鋅依賴性結(jié)合。具有不同移動(dòng)性的兩個(gè)明確的結(jié)合情況被稱 為CF(快速移動(dòng)復(fù)合體)和CS(緩慢移動(dòng)復(fù)合體）。將sigB-RT片段添加到結(jié)合混合物以確認(rèn) 結(jié)合復(fù)合體的特異性。將不同濃度的提純的His6-0RF5768與大約35 nM DNA探針在存在或 不存在鋅(ZnS04)下溫育。(A)使用znuCB探針的結(jié)合測(cè)定(參見圖9)。由CF帶表示的結(jié)合情 況。（B)使用基因間orfl661/62探針的結(jié)合測(cè)定(參見圖9)。由CF和CS帶表示的兩個(gè)結(jié)合情 況。（C)使用orfl658啟動(dòng)子探針和提升的His-0RF5768濃度的結(jié)合測(cè)定(cf圖9MD)使用 基因間orfl659/60啟動(dòng)子探針的結(jié)合測(cè)定(參見圖9)。由CS帶表示的結(jié)合情況。
[0124] 圖11顯示了缺失載體pGusA21 A〇rf5768的示意圖。（上）orf5768(對(duì)應(yīng)于SEQ ID No. 62)和周圍基因。（下）pGusA21 Δ orf5768。左側(cè)條：orf5768的5'側(cè)區(qū)域；右側(cè)條： orf5768的3'側(cè)區(qū)域。
[0125] 圖12顯示了在直接轉(zhuǎn)化后將pGusA21A〇rf5768整合到日本擬無枝酸菌基因組中 的證實(shí)。（A) pGusA21 A〇rf5768整合的基于PCR的證實(shí)。期望的WT概況：1677 bp(orf5768- SC〇-wt-Frag);期望的整合的pGusA21 Δ 0rf5768概況：1263 bp(orf5768-SC0-單-Frag)。 wt:野生型gDNA模板;P:分離的pGusA21 Δ orf5768模板。（B)借助Gus報(bào)告系統(tǒng)搜索具有丟 失的pGusA21 Δ orf5768的日本擬無枝酸菌克隆。藍(lán)色菌落的基因組具有整合的pGusA21 Δ orf5768質(zhì)粒，而未染色的菌落丟失了它。
[0126] 圖13顯示了在M7培養(yǎng)基中培養(yǎng)72 h后添加和不添加6 μΜ ZnS〇4的日本擬無枝酸 菌WT和日本擬無枝酸菌AZUr(對(duì)應(yīng)于ASEQ ID No. 62)的上清液的HPLC-UV/VIS分析。 (上）[S，S]-EDDS標(biāo)準(zhǔn)品[350 mg/L]。（自上而下第2和第3)日本擬無枝酸菌WT -/+ 6 μΜ ZnS〇4。（下）日本擬無枝酸菌Azur -/+ 6 μΜ ZnS04。（右）[S，S]-EDDS的特異性UV/VIS光 譜。
[0127] 圖14顯示了載體pRM4-PermE*orfl662-65的結(jié)構(gòu)示意圖。（上）[S，S]-EDDS基因簇 orf!658-1665(對(duì)應(yīng)于SEQ ID No. 40、42、44、46、48、50、52和54)。（下）在質(zhì)粒圖中的同系 物表達(dá)載體pRM4_PermE*orf 1662-65的說明（在PermE*控制下的orf 1662至orf 1665)。灰色 條:操縱子〇rfl662至orfl665。
[0128] 圖15顯示了在添加有6 μΜ ZnS〇4的M7培養(yǎng)基中培養(yǎng)72 h后日本擬無枝酸菌WT和 日本擬無枝酸菌+ pRM4-PermE*orfl662-65的上清液的HPLC-UV/VIS分析。（上）[S，S]_ EDDS標(biāo)準(zhǔn)品[350 mg/L]。（中）日本擬無枝酸菌WT + 6 μΜ ZnS〇4。（下）日本擬無枝酸菌 pRM4-PermE*orfl662-65+ 6 μΜ ZnS〇4。（右）[S，S]-EDDS的特異性UV/VIS光譜。
[0129] 圖16顯示了在添加有6 μΜ ZnS〇4的M7培養(yǎng)基中培養(yǎng)72 h后天藍(lán)色鏈霉菌+ pTWPLl-EDDS的上清液的HPLC-UV/VIS分析。（上）[S，S]-EDDS標(biāo)準(zhǔn)品[350 mg/L]。（中）天藍(lán) 色鏈霉菌 + pTWPLl-EDDS - 6 μΜ ZnS〇4。（下)天藍(lán)色鏈霉菌 + pTWPLl-EDDS + 6 μΜ ZnS〇4。 (右）[S，S ] -EDDS的特異性UV/VIS光譜。
[0130] 實(shí)施例部分 1. [S，S]-EDDS生物合成的說明 產(chǎn)生[S，S]-EDDS的細(xì)菌物種日本擬無枝酸菌的基因組在本發(fā)明的范圍中被測(cè)序。日本 擬無枝酸菌的基因組包含大約9.18 MB且包含8674個(gè)預(yù)測(cè)的開放閱讀框(orf)。根據(jù)用于快 速鑒定、注釋和分析用于次生代謝物的生物合成基因簇的Webtool Antibiotics and Secondary Metabolite Analysis Shell(antiSMASH)( (Medema 等人，2011, Nucleic Acids Res (2011); 39:14;和Blin 等人，Nucleic Acids Res (2013); 1-9)，日本擬無 枝酸菌的基因組包含26個(gè)用于次生代謝物的單獨(dú)基因簇。所述簇含有用于產(chǎn)生源自6個(gè) NRPS(非核糖肽合成酶）、6個(gè)I型PKS(聚酮合酶）、2個(gè)I型PKS/NRPS雜交體和1個(gè)III型PKS/ NRPS雜交體(用于產(chǎn)生糖肽)連同4個(gè)萜烯、依克多因、氨基糖苷類和L-抗生素的次生代謝產(chǎn) 物的生物合成潛力。
[0131]首先假設(shè)[S，S]-EDDS的假設(shè)的生物合成途徑（圖1)，其中非蛋白質(zhì)氨基酸2,3-L- 二氨基丙酸（Dap)可以是假設(shè)的[S，S]-EDDS前體化合物。Dap尤其是在通過酒紅鏈霉菌 (Strep tomyces vinaceus)生物合成紫霉素和在通過蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis)生物合成雙效菌素 A時(shí)的次生代謝物。兩種合成途徑均被說明（Thomas等 人，Antimicrobial Agents and Chemotherapy (2003); 47(9): 2823-2830 和Zhao 等 人，F(xiàn)EBS Lett (2008); 528(20): 3125-3131)。
[0132] 對(duì)于蘇云金芽孢桿菌和酒紅鏈霉菌表明，特異性地提供Dap用于雙效菌素 A和紫霉 素的生物合成。Dap在雙效菌素和紫霉素的生物合成期間通過L-絲氨酸與作為氨基供體的 L-鳥氨酸的轉(zhuǎn)化來形成（圖1)。該反應(yīng)通過Dap合酶（Vi〇B/ZWA5A)和鳥氨酸環(huán)化脫氨酶 (Vi〇K/ZWA5B)的協(xié)同作用來催化，其中需要磷酸吡哆醛(PLP)作為輔因子(Thomas等人， Antimicrobial Agents and Chemotherapy (2003); 47(9): 2823-2830;和Zhao 等人， FEBS Lett (2008); 528(20): 3125-3131)。
[0133] 使用BLAST(局部序列排比檢索基本工具，申請(qǐng)?zhí)峤蝗掌跁r(shí)可用的版本）和VioB/ ZWA5A和Vi〇K/ZWA5B的氨基酸序列進(jìn)行日本擬無枝酸菌基因組的掃描，表明了相互直接鄰 近的基因所編碼的同系物蛋白的存在。因此，根據(jù)SEQ ID No. 52的核酸編碼352個(gè)aa大小 的蛋白且與VioK和ZWA5B展示出32/45 %、26/44 %的aa同一性/相似性。SEQ ID No. 48編碼 327個(gè)aa大小的蛋白且與VioK和ZWA5B展示出25/39 %、21/40 %的aa同一性/相似性。位于中 間的SEQ ID No. 50被稱為二氨基庚二酸脫羧酶且SEQ ID No. 54被稱為多藥運(yùn)出轉(zhuǎn)運(yùn)蛋 白。SEQ ID No. 48、SEQ ID No. 50、SEQ ID No. 52和SEQ ID No. 54展示了重疊的基因排 列且推測(cè)被編碼為轉(zhuǎn)錄單元(圖2)。
[0134] 根據(jù)SEQ ID No. 39、SEQ ID No. 41、SEQ ID No. 43和SEQ ID No. 45的蛋白或 肽在上文提及的操縱子樣組織的基因的5'-端上游被編碼且稱為N-乙酰轉(zhuǎn)移酶、半胱氨酸 加雙氧酶、HTH型轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子和酰胺酶（圖2)。
[0135] 基于上文確定的同系物做出以下假設(shè)： -作為[S，S]-EDDS生物合成的第一個(gè)步驟，根據(jù)SEQ ID No. 47和SEQ ID No. 51的蛋 白或肽協(xié)同地催化Dap前體的合成（圖2)。
[0136] - Dap與草酰乙酸縮合成為中間體化合物IM 1是由根據(jù)SEQ ID No. 39的蛋白或 肽(根據(jù)SEQ ID No. 40的核酸:被稱為N-乙酰轉(zhuǎn)移酶)催化的。
[0137] -隨后的脫羧化是由根據(jù)SEQ ID No. 49的蛋白或肽（SEQ ID No. 48:被稱為二 氨基庚二酸脫羧酶)催化的。
[0138] -使用草酰乙酸的重新乙?；质怯筛鶕?jù)SEQ ID No. 39的蛋白或肽進(jìn)行。
[0139] -最終還原是由根據(jù)SEQ ID No. 41的蛋白或肽（SEQ ID No. 42:被稱為半胱氨 酸雙加氧酶)催化的。
[0140] -為了分泌的目的，[S，S]_EDDS必須進(jìn)一步通過細(xì)胞膜被轉(zhuǎn)位。該輸出是由假設(shè) 的根據(jù)SEQ ID No. 53的多藥運(yùn)出轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白介導(dǎo)的（圖2)。
[0141] 為了證實(shí)所鑒定的區(qū)域確實(shí)負(fù)責(zé)[S，S]-EDDS的生物合成，利用[S，S]-EDDS生物合 成的鋅抑制。因?yàn)閇S，S]-EDDS僅在基本無鋅條件下形成（2 μΜ的鋅濃度就已導(dǎo)致[S，S]_ EDDS合成的完全中斷(Cebulla I.，論文（1995)，Tubingen大學(xué)），假設(shè)的生物合成基因的 轉(zhuǎn)錄模式在存在鋅和不存在鋅的情況下通過RT-PCR(實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))確定(圖3)。
[0142] 包含根據(jù)SEQ ID No. 48和SEQ ID No. 52的核酸序列的假設(shè)的Dap合成基因、根 據(jù)SEQ ID No. 50的中間序列和根據(jù)SEQ ID No. 54的序列僅在不存在鋅的培養(yǎng)期間被表 達(dá)（[S，S]-EDDS形成），然而在存在鋅的情況下不被表達(dá)。沒有發(fā)現(xiàn)通過其它二價(jià)金屬離子 對(duì)這些基因的抑制。根據(jù)SEQ ID No. 40、SEQ ID No. 42、SEQ ID No. 44和SEQ ID No. 46 的核酸顯示了相同的轉(zhuǎn)錄模式，其不受鋅影響（圖3)。
[0143] 如此鑒定的假設(shè)的[S，S]-EDDS生物合成的操縱子(SEQ ID No. 48、50、52和54)展 示了鋅依賴性轉(zhuǎn)錄。
[0144] 為了證明受鋅嚴(yán)重影響的根據(jù)SEQ ID No. 48、50和52的基因在合成[S，S]-EDDS 中的參與，進(jìn)一步產(chǎn)生具有SEQ ID No. 48、50和52編碼區(qū)的框架內(nèi)缺失的突變體。
[0145] 產(chǎn)生了總共12個(gè)具有SEQ ID No. 48、50和52編碼區(qū)的框架內(nèi)缺失的日本擬無枝 酸菌突變體（日本擬無枝酸菌A SEQ ID No. 48、50和52)。日本擬無枝酸菌野生型（日本擬 無枝酸菌WT)和產(chǎn)生的全部突變體在EDDS生產(chǎn)培養(yǎng)基中培養(yǎng)(表1)。
表1:培養(yǎng)基，緩沖液。
[0146] 在日本擬無枝酸菌WT菌株在所選條件下形成[S，S]_EDDS時(shí)，12個(gè)突變體中沒有一 個(gè)還能合成[S，S]-EDDS(圖4)。
[0147] 還能證明的是，包含或由根據(jù)SEQ ID No. 48、50和52的核酸序列構(gòu)成的操縱子結(jié) 構(gòu)對(duì)于在日本擬無枝酸菌中生物合成[S，S ] -EDDS是必需的。
[0148] 為了證明所鑒定的基因簇含有生物合成[S，S]_EDDS的全部所需遺傳信息，將包含 全部基因簇的粘粒在天藍(lán)色鏈霉菌中異源表達(dá)。該粘粒(PTWPL1-EDDS)包含根據(jù)SEQ ID No. 4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、 54、56和58的基因和根據(jù)SEQ ID No. 2和SEQ ID No. 60的部分(表2)。
表2:先前未描述的日本擬無枝酸菌的30個(gè)基因。
[0149] 天藍(lán)色鏈霉菌野生型菌株(天藍(lán)色鏈霉菌WT)和具有整合到基因組的粘粒pTWPLl- EDDS的天藍(lán)色鏈霉菌菌株(天藍(lán)色鏈霉菌-pTWPLl-EDDS)在EDDS生產(chǎn)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。天藍(lán) 色鏈霉菌WT菌株不能在所選條件下產(chǎn)生[S，S] -EDDS，而天藍(lán)色鏈霉菌-pTWPLl-EDDS在無鋅 的EDDS生產(chǎn)培養(yǎng)基中產(chǎn)生了可檢測(cè)量的[S，S]-EDDS(圖5)。
[0150] 通過天藍(lán)色鏈霉菌-pTWPLl-EDDS形成[S，S]-EDDS，表明了對(duì)于[S，S]-EDDS生物合 成所需的全部酶在基因區(qū)域〇rf!640-1667或SEQ ID No. 4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、 24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56和58中被編碼。
[0151] k[S，S] -EDDS生物合成的鋅抑制的說明 總(global)金屬調(diào)節(jié)蛋白家族的Fur(鐵攝取調(diào)節(jié)因子)家族是以大腸桿菌(E. coli ) 的鐵攝取調(diào)節(jié)因子命名的（Hantke K·，Mol Gen Genet (1981); 182(2): 288-292和Bagg &Neilands, Biochemistry (1987); 26: 5471-5477)。除鐵選擇性的Fur外，在Fur家族具 有多種多樣的金屬選擇性和生物學(xué)功能。其中例如包括鋅(Zur)、鎂(Mur)和鎳(Nur)傳感因 子。
[0152] Fur蛋白通常是轉(zhuǎn)錄抑制因子，當(dāng)與其同源金屬離子效應(yīng)物(例如，鐵結(jié)合的Fur被 稱為holoFur)結(jié)合時(shí)，它們結(jié)合相應(yīng)的操縱基因-DNA-序列，從而阻止RNA聚合酶的接近，這 導(dǎo)致抑制下游基因的表達(dá)（Lee & Helmann, Nature (2006); 440(7082):363-367)。無金 屬的蛋白（例如，apoFur)基本上對(duì)相關(guān)的操縱基因序列具有低或可忽略的親和性，這導(dǎo)致 革巴基因的脫抑制。
[0153] Fur家族成員在生理上用作Zn (II)離子的傳感因子的能力在低GC含量的革蘭氏陽 性枯草芽孢桿菌（ZurBs)中和在γ -變形菌門大腸桿菌（ZurEc)中同時(shí)被發(fā)現(xiàn)(Gaballa & Helmann, J. Bacteriol. (1998); 180:5815-21和Patzer & Hantke, Mol Microbiol (1998); 28:1199-1210)。隨后，基因組分析實(shí)現(xiàn)了在多種其它細(xì)菌中可能的Zur調(diào)節(jié)子的 暫時(shí)性分配(Zuordnung)，這展示出由Zur介導(dǎo)的鋅攝取調(diào)節(jié)在細(xì)菌界的擴(kuò)展(Panina等 人，Proc Natl Acad Sci USA (2003 Aug 19); 100(17):9912-7)。與此同時(shí)，除211打5和 ZurEc外，Zur蛋白的多重性已在被生化表征，諸如從革蘭氏陰性鼠疫耶爾森氏菌(Yersinia pestis) (Ζιιγυρ)、腸道沙門氏菌（Salmonel la enterica) (ZursE)和野油菜黃單胞菌 (Xanthomonas campestris)(Zurxc)、低GC含量的革蘭氏陽性厚壁菌金黃色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus)(ZursA)、豬鏈球菌（Streptococcus suis)(Zurss)和李斯特單核 細(xì)胞增生菌(Listeria monocytogenes)(ZurLM)和高GC含量的革蘭氏陽性放線菌結(jié)核分支 桿菌（Mycobacterium tuberculosis) (Ζιιγμτ)、白喉棒狀桿菌（Corynebacterium diphtheriae)(Zur〇))、谷氨酸棒狀桿菌（Corynebacterium glutamicum)(Zur(x)和天藍(lán)色 鏈霉菌（Zursc)(Li 等人，BMC Microbiol. (2009 Jun 25); 9:128;Feng 等人，J Bacteriol. (2008); 190(22): 7567-78；Lindsay & Foster, Microbiology (2001), 147, 1259_66;Campoy 等人，Infect. Immun. (2002) ; 70: 4721-5; Garrido 等人， FEMSMicrobiol. Lett. (2003); 221:31-37;Tang 等人，Mol. Plant-Microbe Interact. (2005); 18: 652-8;Maciag 等人，J Bacteriol. (2007): 189(3): 730-40; Shin 等人，Journal of Bacteriology (2007); June: 4070_7;Dalet 等人·，F(xiàn)EMS Microbiol. Lett (1999); 174: lll-6;Schr6der 等人，BMC Genomics (2010); 11: 12 和Smith 等人，J Bacteriol. (2009); 191(5): 1595-603)。
[0154] 其活性由相同調(diào)節(jié)因子控制的一組基因被稱為調(diào)節(jié)子。在受Zur蛋白控制下的調(diào) 節(jié)子包含編碼鋅獲取功能的基因，例如具有高親和性的鋅攝取系統(tǒng)(znuABC)、核糖體蛋白 的假設(shè)的Zinkophor和無鋅的旁系同源。這些基因通過鋅結(jié)合的holoZur蛋白在富鋅條件下 的結(jié)合被抑制，且通過DNA的無鋅的apoZur蛋白的分解而脫抑制。
[0155] 天藍(lán)色鏈霉菌，高GC含量放線菌的模式生物體，尤其使用Fur家族的四種生化表征 的蛋白（FurASC、CatRSC、NurSC和ZurSC)調(diào)節(jié)金屬體內(nèi)平衡和過氧化物壓力應(yīng)答(Hahn等 人，J Bacteriol. (2000); 182(13): 3767-74;Ahn 等人，Mol. Microbiol. (2006); 59:1848-58和Shin 等人，Journal of Bacteriology (2007); June: 4070-7)。
[0156] 具有天藍(lán)色鏈霉菌的四種不同F(xiàn)ur家族蛋白的aa序列的日本擬無枝酸菌的BLAST 分析展示了日本擬無枝酸菌基因組編碼三種Fur家族蛋白同系物，其根據(jù)核酸序列orf!667 (對(duì)應(yīng)于SEQ ID No. 58)、orf3462和orf5768(對(duì)應(yīng)于SEQ ID No. 62)被編碼。
[0157] Fur家族同系物0RF1667(對(duì)應(yīng)于SEQ ID No. 57)和0RF3462與天藍(lán)色鏈霉菌FurAsc 非常相似(62/75%和67/79%的aa同一性/相似性）。天藍(lán)色鏈霉菌Fur ASC參與對(duì)過氧化物壓力 的適應(yīng)性應(yīng)答和進(jìn)行對(duì)具有furASC基因自身和catC的操縱子的負(fù)調(diào)節(jié)，其編碼過氧化氫酶- 過氧化物酶(Hahn 等人，J Biol Chem. (2000); 275(49): 38254-60)。
[0158] 具有根據(jù)SEQ ID No. 61的氨基酸序列的第三個(gè)Fur家族同系物蛋白與天藍(lán)色鏈 霉菌Zursc非常相似，且與其展示出67/85%的aa同一性/相似性（圖6)。
[0159] 生化表征的天藍(lán)色鏈霉菌的Zursc和由根據(jù)SEQ ID No. 62(或orf5768)的核酸序 列編碼的日本擬無枝酸菌同系物(ZurAj)的高度相似性暗示了根據(jù)SEQ ID No. 61的蛋白或 肽是日本擬無枝酸菌的鋅敏感性(zinksensitiv)Fur家族蛋白，其介導(dǎo)相應(yīng)革E1基因的鋅依 賴性抑制。
[0160] Zursc是天藍(lán)色鏈霉菌中具有高度親和性的鋅攝取系統(tǒng)（ZnuABC)的負(fù)調(diào)節(jié)因子 (Shin 等人，Journal of Bacteriology (2007); June: 4070-7)。具有天藍(lán)色鏈霉菌 ZnuABC的氨基酸序列的日本擬無枝酸菌基因組的BLAST分析展示了由〇rf3699、〇rf3700和 orf3701與orf6504、orf6505和orf6506編碼的兩個(gè)同系物系統(tǒng)（圖7)。
[0161] 熟知的是天藍(lán)色鏈霉菌的znuABC操縱子的表達(dá)被Zursc嚴(yán)重抑制，其中鋅是輔因子 (Shin 等人，Journal of Bacteriology (2007); June: 4070-7)。因此，為了確認(rèn)這兩個(gè) 假設(shè)的鋅攝取系統(tǒng)中哪一個(gè)在日本擬無枝酸菌中介導(dǎo)了高親和性的鋅攝取，根據(jù)鋅以及各 種其它金屬的存在來檢驗(yàn)作為整個(gè)系統(tǒng)的代表的〇rf3700和orf6504的轉(zhuǎn)錄(圖8)。
[0162] 在金屬不足以及在鐵、鎳、鈷的存在下(但無鋅的存在下)表達(dá)DNA區(qū)域orf3700(圖 8)。該轉(zhuǎn)錄模式清楚地顯示在日本擬無枝酸菌中orf3700被嚴(yán)重且僅由鋅介導(dǎo)的抑制。由此 可得出結(jié)論，即由rf3699、orf3700和orf3702編碼的攝取系統(tǒng)是日本擬無枝酸菌的具有高 親和性的鋅攝取系統(tǒng)(ZnuABC)。
[0163] 為了證明根據(jù)SEQ ID No. 61的Zursc同系物蛋白（由SEQ ID No. 62編碼）是日本 擬無枝酸菌的對(duì)鋅反應(yīng)性Fur家族蛋白，且介導(dǎo)鋅攝取系統(tǒng)(znuABC)和假設(shè)的[S，S]-EDD生 物合成基因的鋅依賴性抑制，進(jìn)行親和電泳法研究(EMS測(cè)定，電泳迀移率變動(dòng)分析）。
[0164] 使用鋅抑制基因〇rf3700和orfl662(對(duì)應(yīng)于SEQ ID No. 46)位于5'-端上游的啟 動(dòng)子區(qū)域和還使用在假設(shè)的[S，S]-EDDS生物合成基因簇（orfl658上游區(qū)域，orfl659和 orf!660基因間區(qū)、orfl661和orfl662基因間區(qū)）中所預(yù)測(cè)的全部其它啟動(dòng)子區(qū)域(依賴于 作為輔因子的鋅），分析根據(jù)SEQ ID No. 61的蛋白或肽的結(jié)合。
[0165] 為了研究同系物鋅攝取調(diào)節(jié)因子0RF5768(ZurAj，對(duì)應(yīng)于SEQ ID No. 61)通過結(jié)合 相應(yīng)啟動(dòng)子區(qū)域(開放圓圈，圖9)是否介導(dǎo)〇rf3700、〇rfl662和[S，S]-EDDS生物合成基因簇 內(nèi)其它基因的鋅依賴性抑制，進(jìn)行EMS測(cè)定（電泳迀移率變動(dòng)分析)或還有條帶移位分析。對(duì) 此，為同系物鋅攝取調(diào)節(jié)因子0RF5768標(biāo)記組氨酸6-標(biāo)簽，將其提純并分離。同樣提供應(yīng)被 作為假定的受鋅調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子而研究(開放圓圈，圖9)的相應(yīng)DNA序列（啟動(dòng)子序列）。
[0166] 通過將啟動(dòng)子序列（約35 nM)使用不同量的His6-0RF5768在10 μL結(jié)合緩沖劑 (表1)中在添加或不添加鋅的情況下在29 °C下溫育20分鐘，進(jìn)行所述結(jié)合反應(yīng)。為了排除 His6-0RF5768的非特異性結(jié)合，添加的sigB-RT片段(258 bp)作為陰性對(duì)照（圖10)。
[0167] 因此，可使用EMSA確認(rèn)His6-0RF5768與代表znuABC-啟動(dòng)子區(qū)域以及orf 1659-60 和orfl661-62啟動(dòng)子區(qū)域的EMSA探針的鋅依賴性結(jié)合（即在鋅的存在下）。沒有檢測(cè)到與 orfl658啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合(圖10)。
[0168] 3.鋅脫抑制的[S，S]_EDDS生產(chǎn)菌株的產(chǎn)生 為了產(chǎn)生日本擬無枝酸菌的鋅脫抑制的[S，S]-EDDS生產(chǎn)菌株，遵循三個(gè)不同的策略： (1) 將鋅攝取調(diào)節(jié)因子基因（并因此是抑制蛋白Zur)SEQ ID No. 62缺失。 (2) 在無鋅抑制的啟動(dòng)子的控制下表達(dá)[S，S]-EDDS生物合成基因。交換Zur靶向啟動(dòng) 子。 (3) [S，S]-EDDS生物合成基因在不再存在鋅抑制的宿主細(xì)胞中的異源表達(dá)。
[0169] 3.1鋅攝取調(diào)節(jié)因子基因 SEQ ID No. 62的缺失 在假定[S，S]-EDDS生物合成基因受使用鋅作為輔因子的ZurAj(0RF5768和根據(jù)SEQ ID No. 61的蛋白或肽)抑制的情況下，進(jìn)行根據(jù)SEQ ID No. 62的編碼區(qū)的缺失，以產(chǎn)生鋅脫 抑制的[S，S]-EDDS生產(chǎn)菌株。
[0170] 為了通過同源重組實(shí)現(xiàn)根據(jù)SEQ ID No. 62(對(duì)應(yīng)于orf5768)的編碼區(qū)的框架內(nèi) 缺失，構(gòu)建了含有orf5768的上游和下游區(qū)域的缺失載體pGusA21 Δ orf5768，其與pGusA21- usl662+dsl664(AG Stegmann)相似。從大腸桿菌ET12567中獲得非甲基化的陰性pGusA21 Δ orf5768，且用于日本擬無枝酸菌的直接轉(zhuǎn)化(圖11)。
[0171] 將在使用非甲基化的pGusA21A〇rf5768轉(zhuǎn)化后獲得的日本擬無枝酸菌的阿泊拉 霉素抗性菌落轉(zhuǎn)移至HA平板。使用X-Gluc(5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖苷酸)溶液覆蓋 生長(zhǎng)菌落，且選擇藍(lán)色菌落（圖12,對(duì)報(bào)告基因 gusA:克隆1、6、7、8和12為陽性）以通過PCR進(jìn) 一步檢驗(yàn)單交換的情況。
[0172] 分離所述克隆的基因組DNA，并且通過PCR檢驗(yàn)質(zhì)粒單交換至日本擬無枝酸菌基因 組的情況中的阿泊拉霉素抗性盒的存在并使用引物特異性地導(dǎo)出，以證明pGusA21A orf5768整合至基因組。使用orf5768-SC0-FP和orf5768-SC0-RP的引物對(duì)將具有1677 bp 的片段(〇rf5768-SC0-wt-Frag)和/或具有1293 bp的片段(orf5768-S⑶-單Frag)擴(kuò)增，這 些片段代表野生型基因組和具有整合的pGusA21 Δ orf5768的基因組（圖12)。
[0173] 將具有整合至基因組的pGusA21A〇rf5768的日本擬無枝酸菌的克?。寺?、6、7 和8)聯(lián)合，并用于誘導(dǎo)雙交換（同源重組），其中這些細(xì)胞在溫度負(fù)荷下培養(yǎng)。
[0174] 在編碼區(qū)SEQ ID No. 62的框架內(nèi)缺失下總共產(chǎn)生日本擬無枝酸菌（日本擬無枝 酸菌Δ zur)的三種突變體。日本擬無枝酸菌WT和產(chǎn)生的全部突變體在EDDS生產(chǎn)培養(yǎng)基中培 養(yǎng)(參見表1)。在富鋅條件下日本擬無枝酸菌WT菌株不形成[S，S]-EDDS，而三種突變體不再 表現(xiàn)出鋅抑制（圖13)。
[0175] 還可證實(shí)，日本擬無枝酸菌的對(duì)鋅應(yīng)答性抑制因子(Zirnj或根據(jù)SEQ ID No. 62的 核酸)的缺失導(dǎo)致不依賴于鋅的[s，S ] -EDDS生產(chǎn)。
[0176] 3.2 [S，S]_EDDS生物合成基因在無鋅抑制的啟動(dòng)子控制下的表達(dá) 用于產(chǎn)生鋅脫抑制的[S，S]-EDDS生產(chǎn)菌株的第二個(gè)策略設(shè)定，通過用相對(duì)強(qiáng)大組成型 表達(dá)或誘導(dǎo)型的啟動(dòng)子交換Zur靶向啟動(dòng)子，避免由Zur(根據(jù)SEQ ID No. 61的蛋白或肽） 介導(dǎo)的鋅抑制。為此選擇已知的組成型表達(dá)的啟動(dòng)子PermE*，以在其控制下表達(dá)[S，S]- EDDS-操縱子（SEQ ID No. 48、50、52和54,對(duì)應(yīng)于orfl662-65)。將產(chǎn)生的質(zhì)粒pRM4-PermE* orfl662-65轉(zhuǎn)移至日本擬無枝酸菌WT，且由此獲得日本擬無枝酸菌+ pRM4-PermE* orfl662-65(圖14)。
[0177] 日本擬無枝酸菌WT和日本擬無枝酸菌+ pRM4-PermE*orn662-65隨后在添加有6 μΜ ZnS〇4溶液的EDDS生產(chǎn)培養(yǎng)基(參見表1)中培養(yǎng)。根據(jù)圖15的數(shù)據(jù)顯示，在所選條件下在 日本擬無枝酸菌WT中未產(chǎn)生[S，S]-EDDS。相反，通過在非Zur革E1向啟動(dòng)子ermE*的控制下表 達(dá)[S，S]-EDDS操縱子orfl662-65的日本擬無枝酸菌菌株，在鋅存在下就已檢測(cè)到[S，S]_ EDDS產(chǎn)生（圖15)。
[0178] 這些數(shù)據(jù)證實(shí)，顯著不依賴于鋅的[S，S]_EDDS生產(chǎn)可通過交換控制[S，S]_EDDS生 物合成基因的ZurAj(SEQ ID No. 61)靶向啟動(dòng)子來實(shí)現(xiàn)。
[0179] 3.3 [S，S]_EDDS生物合成基因在異源宿主細(xì)胞中的異源表達(dá) 所述[S，S]-EDDS生物合成簇應(yīng)在已用于生物技術(shù)的細(xì)菌菌株，例如天藍(lán)色鏈霉菌中表 達(dá)。
[0180] 因此，具有整合至基因組的粘粒pTWPLl-EDDS的天藍(lán)色鏈霉菌在EDDS-生產(chǎn)培養(yǎng)基 中培養(yǎng)并研究[S，S]-EDDS生產(chǎn)（圖16)。
[0181] 這些數(shù)據(jù)證實(shí)，[S，S]-EDDS可在無鋅的EDDS生產(chǎn)培養(yǎng)基中在宿主天藍(lán)色鏈霉菌中 通過異源表達(dá)來合成（圖16,中）。這些數(shù)據(jù)還證實(shí)，在本發(fā)明范圍中鑒定的基因是[S，S]_ EDDS生物合成基因。
[0182] 4.日本擬無枝酸菌的培養(yǎng)和儲(chǔ)存 為了制備日本擬無枝酸菌的培養(yǎng)物，將凍干物在HA平板上鋪板并在27°C下溫育4-5天。 隨后，使用菌絲體接種100 ml M3培養(yǎng)基(參見表1)且在27 °C下溫育48 h。使用鹽溶液(0.9 % NaCl)洗滌培養(yǎng)物兩次。將沉淀物懸浮在50 ml M2培養(yǎng)基(參見表1)中，分為2ml的試樣并 在-20 °C下儲(chǔ)存高達(dá)6個(gè)月。
[0183] 5.用于DNA分離的日本擬無枝酸菌培養(yǎng) 將20 mlTSB培養(yǎng)基（參見表1)用菌絲體接種并在27°C下溫育2天。在具有擋板 (Schikane)和金屬線圈的100 ml錐形瓶中實(shí)現(xiàn)分散生長(zhǎng)和優(yōu)化的氧氣供應(yīng)。
[0184] 6.在[S，S]-EDDS生物合成條件下的日本擬無枝酸菌培養(yǎng) 將日本擬無枝酸菌在HA平板上鋪板且在27 °C下溫育3-5天。隨后，將約1 cm2的日本擬 無枝酸菌絲從板上刮去，并用于接種100 ml M3培養(yǎng)基(參見表1)。在振動(dòng)機(jī)中在27 °C和 180 rpm下溫育48 h后，將5 ml用于接種100 ml M7培養(yǎng)基(參見表1)17是合成的貧鋅培 養(yǎng)基，其中日本擬無枝酸菌產(chǎn)生[S，S]-EDDS。為了避免[S，S]-EDDS的生物合成，添加 ZnS〇4 直至6 μΜ的最終濃度。對(duì)于RT-PCR，添加 ZnS04、FeS04、MnS04、NiS04和CoCl2分別至25μM的最 終濃度(例如參見圖3)。
[0185]本說明書中提及的核酸序列和氨基酸序列對(duì)應(yīng)于所附序列表中所列的序列。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 分離的蛋白或肽，其對(duì)于生物合成[s，s]-乙二胺二琥珀酸的部分合成步驟具有功能 性，并包含或由選自以下的氨基酸序列構(gòu)成：SEQ ID No. 39、SEQ ID No. 41、SEQ ID No. 43、SEQ ID No. 45、SEQ ID No. 47、SEQ ID No. 49、SEQ ID No. 51、SEQ ID No. 53及其 組合。2. 分離的核酸，其包含或由選自以下的核酸序列構(gòu)成： a) 編碼根據(jù)權(quán)利要求1的蛋白或肽的核酸序列； b) 通過用同義密碼子交換至少一個(gè)密碼子而不同于根據(jù)a)的核酸序列的核酸序列； c) 相當(dāng)于根據(jù)a)的核酸序列的互補(bǔ)鏈的核酸序列，及其組合。3. 分離的核酸，其包含或由選自以下的核酸序列構(gòu)成：SEQ ID No. 40、SEQ ID No. 42、SEQ ID No. 44、SEQ ID No. 46、SEQ ID No. 48、SEQ ID No. 50、SEQ ID No. 52、SEQ ID No. 54及其組合。4. 分離的蛋白或肽，其通過包含或由選自以下的核酸序列構(gòu)成的基因的表達(dá)來制備： SEQ ID No. 40^SEQ ID No. 42^SEQ ID No. 44^SEQ ID No. 46^SEQ ID No. 48^SEQ ID No. 50、SEQ ID No. 52、SEQ ID No. 54及其組合。5. 分離的基因簇或操縱子，其包含或由至少兩個(gè)選自以下的核酸序列構(gòu)成：SEQ ID No. 40、SEQ ID No. 42、SEQ ID No. 44、SEQ ID No. 46、SEQ ID No. 48、SEQ ID No. 50、 SEQ ID No. 52、SEQ ID No. 54及其組合。6. 分離的蛋白或肽，其對(duì)于抑制[S，S]_乙二胺二琥珀酸的生物合成具有功能性，其包 含或由根據(jù)SEQ ID No. 61的氨基酸序列構(gòu)成。7. 分離的核酸，其包含或由選自以下的核酸序列構(gòu)成： a) 編碼根據(jù)權(quán)利要求6的蛋白或肽的核酸序列； b) 通過用同義密碼子交換至少一個(gè)密碼子而不同于根據(jù)a)的核酸序列的核酸序列； c) 相當(dāng)于根據(jù)a)的核酸序列的互補(bǔ)鏈的核酸序列，及其組合。8. 分離的核酸，其包含或由根據(jù)SEQ ID No. 62的核酸序列構(gòu)成。9. 分離的蛋白或肽，其通過包含或由根據(jù)SEQ ID No. 62的核酸序列構(gòu)成的基因的表 達(dá)來制備。10. 表達(dá)載體，其包含至少一種根據(jù)權(quán)利要求2或3的核酸或根據(jù)權(quán)利要求5的基因簇或 操縱子。11. 宿主細(xì)胞，其包含至少一種根據(jù)權(quán)利要求1或4的蛋白或肽、至少一種根據(jù)權(quán)利要求 2或3的核酸、根據(jù)權(quán)利要求5的基因簇或操縱子和/或根據(jù)權(quán)利要求10的表達(dá)載體。12. 擬無枝酸菌屬的細(xì)菌細(xì)胞，特別是日本擬無枝酸菌的細(xì)菌細(xì)胞，其不表達(dá)包含或由 根據(jù)SEQ ID No. 61的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白或肽和/或不含有包含或由根據(jù)SEQ ID No. 62的核酸序列構(gòu)成的核酸。13. 用于引起核酸序列從擬無枝酸菌屬的細(xì)菌細(xì)胞，特別是日本擬無枝酸菌的細(xì)菌細(xì) 胞的基因組，特別是野生型基因組缺失的載體，其特征在于所述核酸序列是根據(jù)SEQ ID No. 62的序列，且所述載體包含至少一種在所述細(xì)菌細(xì)胞基因組中設(shè)置在根據(jù)SEQ ID No. 62的核酸序列上游的核酸序列和/或至少一種在所述細(xì)菌細(xì)胞的基因組中設(shè)置在根據(jù)SEQ ID No. 62的序列核酸下游的核酸序列，但不包含根據(jù)SEQ ID No. 62的核酸序列。14. 根據(jù)權(quán)利要求13所述的載體，其特征在于所述至少一種設(shè)置在下游的核酸序列包 含根據(jù)SEQ ID No. 63的序列，且所述至少一種位于上游的核酸序列包含根據(jù)SEQ ID No. 64的酸序列。15. 用于生物合成[S，S]_乙二胺二琥珀酸的方法，其包括以下步驟： a) 培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求11的產(chǎn)生[S，S]_乙二胺二琥珀酸的宿主細(xì)胞或根據(jù)權(quán)利要求12 的產(chǎn)生[S，S]_乙二胺二琥珀酸的細(xì)菌細(xì)胞，和 b) 從所述細(xì)胞和/或從用于所述細(xì)胞的培養(yǎng)基中提純[S，S]_乙二胺二琥珀酸。16. 用于生物合成[S，S]_乙二胺二琥珀酸的試劑盒，其包含選自以下的組分:至少一種 根據(jù)權(quán)利要求1、4、6或9任一項(xiàng)的蛋白或肽、至少一種根據(jù)權(quán)利要求2、3、7或8任一項(xiàng)的核 酸、根據(jù)權(quán)利要求5的基因簇或操縱子、根據(jù)權(quán)利要求10、13或14任一項(xiàng)的載體、根據(jù)權(quán)利要 求11的宿主細(xì)胞、根據(jù)權(quán)利要求12的細(xì)菌細(xì)胞及其組合。
【文檔編號(hào)】C07K14/195GK105849083SQ201480060818
【公開日】2016年8月10日
【申請(qǐng)日】2014年9月2日
【發(fā)明人】E·施特格曼, W·沃來本, M·施波恩, T·韋伯
【申請(qǐng)人】E·施特格曼, W·沃來本, M·施波恩, T·韋伯