改進的重組多肽生產(chǎn)方法
【專利摘要】本文報道了用于產(chǎn)生融合多肽的方法，包括以下步驟：a)培養(yǎng)包含編碼變體融合多肽的核酸的哺乳動物細胞，其中融合多肽的氨基酸序列已通過在原?融合多肽中將原?肽和融合多肽之間的內(nèi)源性蛋白酶切割位點替換為外源性(相對于融合多肽的部分的來源)或人工蛋白酶切割位點而被修飾，和b)從細胞或培養(yǎng)基中回收融合多肽或融合原?多肽，并由此產(chǎn)生(重組的)融合多肽。
【專利說明】改進的重組多肽生產(chǎn)方法
[0001]除其他事項外，本文報道了用于增加具有生物活性的重組生產(chǎn)的多肽的產(chǎn)量的方 法。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 現(xiàn)今，大多數(shù)生物藥物在動物(哺乳動物)細胞中生產(chǎn)，這類細胞通常以高效率、高 品質(zhì)且具有適當?shù)姆g后(二次)修飾(如，舉例來說，糖基化)地將感興趣的重組多肽分泌 到培養(yǎng)基中。然而，一些融合多肽，特別是復雜的融合多肽，具有低溶解性或折疊困難的多 肽，以及與表達它的細胞相互作用的多肽往往以非常低的產(chǎn)量獲得。
[0004] 例如，抗體通常以生物活性形式在哺乳動物細胞中高效表達。然而，包含抗體的融 合多肽(例如，綠色熒光蛋白（GFP)抗體綴合物)根本不表達和/或分泌，盡管這類蛋白質(zhì)對 于實驗和診斷方法來說是高度感興趣的（參見，例如，WO 2011/135040)。
[0005] 在某些難以表達的情況下，多肽可以生產(chǎn)為可溶性的、分泌的、無活性前體蛋白 (例如所謂的酶原，在蛋白酶的情況下），隨后可以在體外使其成熟，例如通過蛋白水解活 化。在其它情況下，對特定的宿主細胞有害的多肽可以表達為細胞內(nèi)的無活性不溶的蛋白 質(zhì)聚集體(包涵體（IB))，并隨后在體外重折疊。然而，原-多肽(pro-polypeptides)的加工 可能是困難的或者根本不可能。此外，所獲得的成熟多肽不包含所有的翻譯后修飾。
[0006] 低表達多肽的例子是神經(jīng)營養(yǎng)因子，如NGF、BDNF、GDNF和NT-3 (參見，例如，Xia， Ch.-F.,J.Gene Med.10(2008)306-315；Boado,R.J.,Pharm.Res .24(2007)1772-1787； Negro,A.等人，J.Neurochem.62( 1994)471-478) 〇
[0007] 在WO 2008/005847中報道了一種通過重組方法生產(chǎn)因子Viii蛋白的方法。在WO 02/02597中報道了肽延伸糖基化多肽。在WO 2007/044323中報道了用于血腦屏障遞送的融 合蛋白。在WO 00/64482中報道了神經(jīng)細胞生長調(diào)節(jié)劑（amphibodies)。在WO 2012/087835 中報道了用于增強蛋白質(zhì)折疊的組合物和方法。在WO 2006/131013中報道了抑制TNF-α的 穩(wěn)定和可溶的抗體。在WO 00/23473中報道了干擾素-β融合蛋白及用途。
[0008] 發(fā)明概述
[0009] 本文報道了用于改進重組生產(chǎn)多肽的生產(chǎn)過程的方法。
[0010]改進可以是例如增加的產(chǎn)量，更強健的生產(chǎn)過程，更簡單的方法，和/或下游處理 過程中降低的復雜性。
[0011] 必須指出的是，實現(xiàn)該改進而不損害多肽的生物物理和/或生物化學特性和/或生 物學功能。在某些情況下，這些特性中的一種或多種甚至得到改善。
[0012] 在本文所報道的第一個方面中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，通過引入一個或多個糖基化位點，哺乳 動物細胞中的多肽重組生產(chǎn)可以得到改進。
[0013] 如本文所報道的一個方面是使用變體多肽產(chǎn)生重組多肽的方法，所述方法包括以 下步驟：
[0014] -培養(yǎng)包含編碼變體多肽的核酸的哺乳動物細胞，其中多肽的氨基酸序列已經(jīng)通 過以下而被修飾：i)位于表面的氨基酸殘基的一個或多個突變，其導致變體多肽與多肽相 比具有較低的等電點，和/或ii)將融合多肽的兩個多肽連接起來的接頭肽，和/或iii)包含 導致多肽具有較低的等電點的氨基酸的N-末端或C-末端融合的標簽，
[0015] -從細胞或培養(yǎng)基中回收重組變體多肽，并由此產(chǎn)生重組多肽。
[0016] 因此，本文報道了使用變體多肽產(chǎn)生重組多肽的方法，所述方法包括以下步驟：
[0017] -培養(yǎng)包含編碼變體多肽的核酸的真核細胞（在一個實施方案中是哺乳動物細 胞），其中多肽的氨基酸序列已被修飾以包含一個或多個人工糖基化位點，
[0018] -從細胞或培養(yǎng)基中回收變體重組多肽，并由此產(chǎn)生重組多肽。
[0019]如本文所報道的一個方面是使用變體多肽產(chǎn)生重組多肽的方法，所述方法包括以 下步驟：
[0020] -提供編碼多肽的核酸，
[0021] -修飾核酸以編碼變體多肽，其中多肽的氨基酸序列已被修飾以包含一個或多個 人工糖基化位點，
[0022]-將核酸引入真核細胞(在一個實施方案中是哺乳動物細胞）中，
[0023]-培養(yǎng)真核細胞，以及
[0024] -從細胞或培養(yǎng)基中回收變體重組多肽，并由此產(chǎn)生重組多肽。
[0025] 如本文所報道的方法特別適合例如在哺乳動物細胞中表達/分泌很差或完全不表 達/分泌的多肽。
[0026] 引入的一個或多個糖基化位點可以（彼此獨立地位于)在多肽本身之中，或者位于 將融合多肽的兩個多肽連接起來的接頭肽中，或者它可以是特定的糖基化標簽。
[0027] 在一個實施方案中，多肽包含糖基化標簽。
[0028] 在一個實施方案中，多肽包含人工糖基化位點。在一個實施方案中，人工糖基化位 點通過位于表面的氨基酸的點突變引入。
[0029] 在第二個方面，本文報道了，已發(fā)現(xiàn)通過在原-多肽中將原-區(qū)段和成熟多肽之間 的內(nèi)源性蛋白酶切割位點替換為外源性(相對于多肽的來源)或人工蛋白酶切割位點，成熟 多肽的產(chǎn)量可以得到提高。這種變化改善了將原-多肽加工為成熟形式。
[0030]因此，如本文所報道的一個方面是使用變體原-多肽產(chǎn)生重組多肽的方法，所述方 法包括以下步驟：
[0031] -培養(yǎng)包含編碼多肽為原-多肽（原-區(qū)段和多肽的融合多肽）的核酸的真核細胞 (在一個實施方案中是哺乳動物細胞），其中原-區(qū)段和多肽之間的內(nèi)源性酶促切割位點被 替換為外源性蛋白酶切割位點，
[0032] -從細胞或培養(yǎng)基中回收重組變體多肽或變體原-多肽，并由此產(chǎn)生重組多肽。
[0033] 如本文所報道的一個方面是使用變體原-多肽產(chǎn)生重組多肽的方法，所述方法包 括以下步驟：
[0034]-提供編碼多肽為原-多肽(原-區(qū)段和多肽的融合多肽)的核酸，
[0035] -修飾核酸以編碼變體原-多肽，其中原-區(qū)段和多肽之間的內(nèi)源性酶促切割位點 被替換為外源性蛋白酶切割位點，
[0036] -將核酸引入真核細胞(在一個實施方案中是哺乳動物細胞）中，
[0037]-培養(yǎng)真核細胞，以及
[0038] -從細胞或培養(yǎng)基中回收重組變體多肽或變體原-多肽，并由此產(chǎn)生重組多肽。
[0039] 在一個實施方案中，外源性蛋白酶切割位點選自包括血纖維蛋白溶酶切割位點、 弗林蛋白酶切割位點、IgA蛋白酶切割位點、TEV蛋白酶切割位點（煙草蝕紋病毒）、顆粒酶B 切割位點、凝血酶切割位點、因子10切割位點、腸激酶切割位點、枯草桿菌蛋白酶切割位點、 組織蛋白酶切割位點、金屬蛋白酶切割位點、IDES蛋白酶切割位點PreScission蛋白酶切割 位點或它們的功能性變體的組。在一個實施方案中，外源性蛋白酶切割位點是IgA蛋白酶切 割位點。
[0040] 在一個實施方案中，原-多肽的切割位于培養(yǎng)基中。在一個實施方案中，能夠切割 外源性蛋白酶切割位點的外源性蛋白酶被加入到培養(yǎng)基中。在一個實施方案中，所述加入 是在培養(yǎng)階段期間。在一個實施方案中，所述加入是在培養(yǎng)階段之后。
[0041] 在一個實施方案中，由表達原-多肽的細胞共表達外源性蛋白酶。
[0042] 在一個實施方案中，培養(yǎng)是共培養(yǎng)表達原-多肽的細胞和表達外源性蛋白酶的細 胞。
[0043] 在一個實施方案中，切割是在從培養(yǎng)基分離細胞之后。在一個實施方案中，切割是 在下游處理期間。在一個實施方案中，切割在層析柱上進行。
[0044]在第三個方面，本文報道了，已發(fā)現(xiàn)伴隨著降低多肽的等電點，多肽在哺乳動物細 胞中的重組生產(chǎn)可以得到改善。
[0045] 因此，如本文所報道的一個方面是使用變體多肽產(chǎn)生重組多肽的方法，所述方法 包括以下步驟：
[0046] -培養(yǎng)包含編碼變體多肽的核酸的真核細胞（在一個實施方案中是哺乳動物細 胞），其中多肽的氨基酸序列已通過位于表面的氨基酸殘基的一個或多個突變而被修飾，所 述修飾導致變體多肽與多肽相比具有較低的等電點，
[0047] -從細胞或培養(yǎng)基中回收重組變體多肽，并由此產(chǎn)生重組多肽。
[0048] 如本文所報道的一個方面是使用變體多肽產(chǎn)生重組多肽的方法，所述方法包括以 下步驟：
[0049] -提供編碼多肽的核酸，
[0050] -修飾核酸以編碼變體多肽，其中多肽的氨基酸序列已通過位于表面的氨基酸殘 基的一個或多個突變而被修飾，所述修飾導致變體多肽與多肽相比具有較低的等電點，
[0051] -將核酸引入真核細胞中（在一個實施方案中是哺乳動物細胞），
[0052]-培養(yǎng)真核細胞，以及
[0053] -從細胞或培養(yǎng)基中回收重組變體多肽，并由此產(chǎn)生重組多肽。
[0054] 在一個實施方案中，多肽具有高于9的等電點（高等電點，堿性等電點)并且變體多 肽具有與(親本/野生型)多肽相比低0.5或更多pH單位(更酸性)的等電點。
[0055] 在一個實施方案中，多肽是神經(jīng)營養(yǎng)蛋白/神經(jīng)營養(yǎng)因子。
[0056] 在一個實施方案中，通過引入帶負電荷的部分降低等電點。
[0057] 在一個實施方案中，帶負電荷的部分是接頭肽。
[0058] 在一個實施方案中，帶負電荷的部分是位于表面的氨基酸殘基。在一個實施方案 中，一個或多個堿性氨基酸殘基被替換為一個或多個中性親水性氨基酸殘基和/或一個或 多個酸性氨基酸殘基或它們的組合。
[0059] 在第四個方面，本文報道了，已發(fā)現(xiàn)通過調(diào)節(jié)接頭肽的長度和連接性，可以改進真 核細胞(如，舉例來說，哺乳動物細胞)中的融合多肽的重組生產(chǎn)。
[0060] 因此，如本文所報道的一個方面是用于產(chǎn)生（重組的）融合多肽的方法，包括以下 步驟：
[0061] -培養(yǎng)包含編碼融合多肽的核酸的真核細胞（在一個實施方案中是哺乳動物細 胞)，
[0062] -從細胞或培養(yǎng)基中回收(重組的）融合多肽，并由此產(chǎn)生(重組的）融合多肽。
[0063] 在一個實施方案中，融合多肽的一部分是神經(jīng)營養(yǎng)蛋白，并且，融合多肽的另一部 分是抗體或抗體片段。
[0064]在第五個方面，本文報道了，已發(fā)現(xiàn)
[0065] i)通過引入一個或多個糖基化位點，和/或
[0066] ii)通過在原-多肽中將原-區(qū)段和多肽之間的內(nèi)源性蛋白酶切割位點替換為外源 性(相對于融合多肽的部分的來源)或人工蛋白酶切割位點，和/或
[0067] iii)通過降低多肽的等電點，和/或
[0068] iv)通過調(diào)節(jié)接頭肽的長度、連接性和電荷，
[0069] 多肽在哺乳動物細胞中的重組生產(chǎn)可以得到改善。
[0070] 因此，如本文所報道的一個方面是用于產(chǎn)生（重組的）（融合）多肽的方法，其包括 以下步驟：
[0071] -培養(yǎng)包含編碼變體(融合）多肽的核酸的真核細胞(在一個實施方案中是哺乳動 物細胞），其中（融合)多肽的氨基酸序列已被如下修飾
[0072] i)通過引入一個或多個人工糖基化位點，和/或
[0073] ii)通過在原-(融合)多肽中將原-區(qū)段和(融合)多肽之間的內(nèi)源性蛋白酶切割位 點替換為外源性(相對于融合多肽的部分的來源)或人工蛋白酶切割位點，和/或
[0074] iii)通過降低(融合)多肽的等電點，和/或
[0075] iv)通過調(diào)節(jié)接頭肽長度，調(diào)節(jié)接頭連接性，調(diào)節(jié)接頭電荷，引入導致(融合）多肽 具有較低等電點的位于表面的氨基酸殘基的一個或多個突變中的一項或多項，
[0076] -從細胞或培養(yǎng)基中回收（融合）多肽或（融合)原-多肽，并由此產(chǎn)生（重組的）（融 合)多肽。
[0077] 如本文所報道的一個方面是用于產(chǎn)生（重組的）融合多肽的方法，其包括以下步 驟：
[0078]-提供編碼融合多肽的核酸，
[0079]-修飾核酸以編碼變體融合多肽，其中融合多肽的氨基酸序列已通過如下而被修 飾:調(diào)節(jié)接頭肽長度，調(diào)節(jié)接頭連接性，調(diào)節(jié)接頭電荷，引入導致融合多肽具有較低等電點 的位于表面的氨基酸殘基的一個或多個突變，
[0080] -將核酸引入真核細胞中（在一個實施方案中是哺乳動物細胞），
[0081] -培養(yǎng)真核細胞，以及
[0082] -從細胞或培養(yǎng)基中回收(重組的）變體融合多肽，并由此產(chǎn)生(重組的）融合多肽。
[0083] 在前述方面的一個實施方案中，融合多肽包括生物活性實體、接頭肽和與血腦屏 障(BBB)受體結(jié)合的單價結(jié)合實體。
[0084] 在一個實施方案中，血腦屏障受體選自由轉(zhuǎn)鐵蛋白受體、胰島素受體、胰島素樣生 長因子受體、低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白（LRP)/a2_巨球蛋白受體，低密度脂蛋白受體相關(guān) 蛋白8(也稱為載脂蛋白E受體2(Ap〇ER2))、低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白1(也稱為α-2-巨球 蛋白受體(A2MR))和結(jié)合肝素的表皮生長因子樣生長因子組成的組。
[0085] 在一個實施方案中，接頭肽包含一個或多個帶負電荷的氨基酸殘基。在一個實施 方案中，接頭肽包含兩個或更多個帶負電荷的氨基酸殘基。在一個實施方案中，接頭肽包含 兩個，或三個，或四個，或五個帶負電荷的氨基酸殘基。
[0086] 在一個實施方案中，生物活性實體是神經(jīng)營養(yǎng)因子。在一個實施方案中，神經(jīng)營養(yǎng) 因子是腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)。
[0087] 在一個實施方案中，單價結(jié)合實體與血腦屏障受體結(jié)合，并且是單價抗體片段，優(yōu) 選地選自 scFv、Fv、scFab、Fab、VHH。
[0088] 在一個實施方案中，融合多肽是單鏈融合多肽，其包含作為第一部分的人腦源性 神經(jīng)營養(yǎng)因子和作為第二部分的單一的抗轉(zhuǎn)鐵蛋白受體抗體Fab或scFv，它們直接或經(jīng)由 接頭肽彼此綴合。
[0089] 如本文所報道的一個方面是融合多肽，其包括：
[0090] -恰好一個野生型神經(jīng)營養(yǎng)因子多肽，或神經(jīng)營養(yǎng)因子變體多肽，或具有神經(jīng)營養(yǎng) 因子活性的其片段，
[0091] -結(jié)合結(jié)構(gòu)域，和
[0092] -神經(jīng)營養(yǎng)因子多肽和抗體片段之間的接頭肽。
[0093] 如本文所報道的一個方面是具有神經(jīng)營養(yǎng)因子活性的融合多肽(例如，二聚復合 物），其包括
[0094] -以下恰好一種:野生型神經(jīng)營養(yǎng)因子多肽，或神經(jīng)營養(yǎng)因子變體多肽或具有神經(jīng) 營養(yǎng)因子活性的其片段，
[0095]-結(jié)合結(jié)構(gòu)域，和
[0096]-神經(jīng)營養(yǎng)因子多肽和抗體片段之間的接頭肽。
[0097]在一個實施方案中，結(jié)合結(jié)構(gòu)域是抗體片段結(jié)合位點。在一個實施方案中，結(jié)合結(jié) 構(gòu)域是包含抗體結(jié)合位點的抗體片段。在一個實施方案中，抗體片段與血腦屏障受體特異 性結(jié)合。在一個實施方案中，抗體片段是選自包括80?￥、？￥、8〇?&13、?313、'\^!1的組的單價抗體 片段。
[0098] 在一個實施方案中，血腦屏障受體選自由轉(zhuǎn)鐵蛋白受體、胰島素受體、胰島素樣生 長因子受體、低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白（LRP)/a2_巨球蛋白受體，低密度脂蛋白受體相關(guān) 蛋白8(也稱為載脂蛋白E受體2(Ap 〇ER2))、低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白1(也稱為α-2-巨球 蛋白受體(A2MR))和結(jié)合肝素的表皮生長因子樣生長因子組成的組。
[0099] 在一個實施方案中，融合多肽包括不與BBB受體結(jié)合的第二個單價或二價結(jié)合實 體。
[0100]如本文所報道的一個方面是復合物，其包括 [0101 ]-作為第一組分，如本文所報道的融合多肽，和
[0102]-作為第二組分的野生型神經(jīng)營養(yǎng)因子多肽，或神經(jīng)營養(yǎng)因子變體多肽，或具有神 經(jīng)營養(yǎng)因子活性的其片段。
[0103]如本文所報道的一個方面是具有神經(jīng)營養(yǎng)因子活性的多聚復合物，其包括
[0104]-作為第一組分，如本文所報道的融合多肽，和
[0105] -作為第二組分的野生型神經(jīng)營養(yǎng)因子多肽，或神經(jīng)營養(yǎng)因子變體多肽，或具有神 經(jīng)營養(yǎng)因子活性的其片段。
[0106] 在一個實施方案中，復合物是二聚復合物。
[0107] 在所有方面的一個實施方案中，神經(jīng)營養(yǎng)因子選自神經(jīng)生長因子(NGF)，腦源性神 經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)，膠質(zhì)細胞系源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(⑶NF)，神經(jīng)營養(yǎng)蛋白3(NT-3)，和神經(jīng) 營養(yǎng)蛋白4(NT-4)。在一個優(yōu)選的實施方案中，神經(jīng)營養(yǎng)生長因子是BDNF。
[0108] 如本文所報道的所有氨基酸序列均是本發(fā)明的具體方面。
[0109] 發(fā)明的詳細說明
[0110] 關(guān)于哺乳動物細胞中重組產(chǎn)生的多肽的低表達產(chǎn)量的一個或多個原因往往未知， 并且一般不容易確定。
[0111] 某些多肽在表達時能夠干擾宿主細胞的功能。這可以是例如誤分選到不正確的細 胞位置或在錯誤的空間（例如，細胞類型）和/或時間（例如，依賴于細胞周期)環(huán)境中表達。 此外，多肽的增加的重組表達和分泌能導致不利于蛋白折疊的條件，例如，導致蛋白聚集 和/或細胞應激反應?？傊嚯牡闹亟M表達可以是困難的（例如，導致低表達產(chǎn)量），或在特 定宿主細胞中甚至不可能表達。
[0112] 如本文所報道的方法在下文中以特定的多肽、融合多肽和抗體融合多肽例示。這 些分子僅僅是用作例子，并且不應被解釋為對本發(fā)明的范圍的限制。
[0113] 神經(jīng)營養(yǎng)蛋白被認為是有高度治療興趣的。例如，腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)被 建議用于治療或減輕以下病癥:阿爾茨海默病、帕金森病，亨廷頓氏病和圍產(chǎn)期腦白質(zhì)病、 唐氏病和孤獨癥/雷特氏綜合征、精神分裂癥、抑郁癥、進食病癥、肌萎縮性側(cè)索硬化癥、多 發(fā)性硬化癥、神經(jīng)元損傷（例如脊髓的神經(jīng)元損傷）以及其它疾病（Apf el，S.C.， Cl in·Chem·Lab Med·39(2001)351-355;Nagahara，A·H·和Tuszynski，M·H·，Nat·Rev·Drug Discov.l0(2011)209_219;Zuccato，C·和Cattaneo，E.,Nature Reviews Neurology 5 (2009)311_322;Thoenen，H·和Sendtner，M.,Nature Neuroscience Supplement 5(2002) 1046-1050;Gharami，K.，等人 J.Neurochem. 105(2008)369-379)。
[0114] 人體內(nèi)的神經(jīng)營養(yǎng)蛋白是非常低豐度的，并且通常由位于非常復雜的微環(huán)境中的 專門的細胞類型表達（參見，例如，Greenberg，M.E ·，等人，J .Neurosci · 29(2009) 12764-12767)。與其天然功能一致，在通常用于這類多肽的重組工業(yè)生產(chǎn)的真核細胞(如CHO細胞、 COS細胞、NSO細胞和HEK細胞）中，神經(jīng)營養(yǎng)蛋白的表達水平非常低（Acklin，C.，等人， Int.J.Pept.Protein Res.41(1993)548-552)〇
[0115] I.通過引入N-糖基化位點提高表達
[0116]如本文所報道的一個方面是將一個或多個(人工)糖基化位點引入多肽中用于其 重組生產(chǎn)。通過引入一個或多個(人工)糖基化位點，真核細胞尤其是哺乳動物細胞中的多 肽重組生產(chǎn)可以得到改善。該方法特別適用于例如在哺乳動物細胞中很難或根本不表達/ 分泌的多肽。引入的糖基化位點可以位于多肽本身之中，或者位于將融合多肽的兩個多肽 連接在一起的接頭肽中，或者它可以是特定的糖基化標簽。特別有利的是通過位于表面的 氨基酸的點突變引入糖基化位點以生成(人工)N-糖基化基序。
[0117] 實例:包含抗體部分和GFP的融合多肽
[0118] 構(gòu)建了包含抗體和GFP部分的示例性融合多肽。
[0119] GlySer接頭(GGGGSGGGGSG;SEQ ID N0:01)被用于融合i)eGFP部分(增強型綠色熒 光蛋白；SEQ ID N0:02)，或ii)emGFP部分（翠綠色熒光蛋白；SEQ ID N0:03)，或iii)tagGFP 部分（SEQ ID N0:04)與IgGl亞類的抗IGF-IR抗體(HC:SEQ ID N0:05;LC:SEQ ID N0:06)的 重鏈(HC)的C-末端。不同的重鏈融合物具有SEQ ID N0:07、08、和09的氨基酸序列。
[0120] 使用蛋白質(zhì)印跡和/或基于蛋白A的高效液相色譜(HPLC)測定法，在瞬時轉(zhuǎn)染的 HEK293細胞的細胞培養(yǎng)上清液中完全不能檢測到抗體融合多肽的分泌。同樣地，生物活性 GFP通過其生物發(fā)光特性(GFP特異性熒光)也無法被監(jiān)測到。但是通過蛋白質(zhì)印跡分析可以 在細胞沉淀級分中檢測到融合多肽。結(jié)果示于下表。
[0121] 藍 L0123J 〈lμg/ml =低于檢測極限
[0124] 不受該理論束縛，GFP是細胞質(zhì)單體蛋白，其具有形成(弱)二聚體的傾向。因此，野 生型GFP"從性質(zhì)來說"（天然維多利亞多管發(fā)光水母(Aequorea Victoria)細胞)并不注定 是要被分泌的，并且，因此，因其與哺乳動物細胞分泌機器不相容而必須使GFP分子適于分 泌。
[0125] 為了提供分泌的含GFP的融合多肽，源自在視網(wǎng)膜感光細胞中發(fā)現(xiàn)的人類光敏膜 結(jié)合G蛋白偶聯(lián)視蛋白受體的多肽已被進一步包含在融合多肽中，即，作為糖基化標簽。通 過該糖基化標簽，額外的(人工)N_糖基化位點被引入融合多肽中。
[0126] 將視蛋白受體來源的多肽與GFP部分的C-末端直接融合，即，沒有間插接頭肽。視 蛋白衍生的多肽(NGTEGPNFYVPFSNATGVV;視蛋白標簽;SEQ ID NO: 10)包括兩個N-糖基化位 點基序:NGT基序和NAT基序(一般的N-糖基化位點基序:NxS/T;Asn后面跟著除Pro以外的任 何氨基酸，后面跟著Ser或Thr)。包含視蛋白糖基化標簽（SEQ ID NO: 11)的融合多肽在 HEK293細胞中的瞬時表達導致融合多肽的分泌。結(jié)果示于下表。
[0127] 塾 L0129J 〈lμg/ml =低于檢測極限
[0130] 從SDS-PAGE分析(條帶變寬)可以看出分泌的融合多肽包含額外的碳水化合物。
[0131] 通過兩步法純化抗體-GFP-視蛋白標簽-融合多肽，特別是，蛋白A親和層析然后是 尺寸排阻層析。使用表面等離子體共振(BIAcore)，通過與IGF-IR受體蛋白結(jié)合，以及，通過 FACS和/或共聚焦顯微鏡，經(jīng)由過表達IGF-IR的細胞上受體介導的胞吞作用內(nèi)化到細胞中， 來證實融合多肽中的抗體部分的功能。GFP部分的功能由于其綠色熒光特性而顯示。
[0132] 實例:神經(jīng)營養(yǎng)蛋白
[0133] 示例性的神經(jīng)營養(yǎng)蛋白是腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)。
[0134] i)糖基化標簽
[0135] 包含經(jīng)由GSG-接頭融合的C-末端T7-His6標簽(MASMTGGQQMG-HHHHHH;用于親和純 化;SEQ ID N0:12)的人野生型前-原-BDNF在HEK239細胞中表達(前-原-BDNF-T7-His6;SEQ ID NO: 13)。成熟BDNF的氨基酸序列不包含N-糖基化位點基序，因此未糖基化。成熟BDNF僅 以幾μg/ml的低產(chǎn)量得到。通過優(yōu)化基因密碼子使用，或者通過去除潛在的蛋白酶切割位點 (前-原-BDNF(-RGR)-T7-His6)，或者通過將天然BDNF信號序列與良好表達的抗體的信號序 列（MGWSCIILFL VATATGVHS;SEQ ID N0:14)交換，或者通過將BDNF前-原-區(qū)段與NGF的前-原-區(qū)段交換，均無法改善低表達產(chǎn)量。結(jié)果示于下表(歸一化至成熟BDNF的濃度）。
[0136] 表3
12 為了提高BDNF的（分泌)產(chǎn)量，使用不同長度的視蛋白糖基化標簽將(人工)糖基化 位點引入BDNF分子，所述不同長度的視蛋白糖基化標簽為：16個氨基酸殘基 (NGTEGPNFYVPFSNAT;SEQ ID N0:15)，19個氨基酸殘基（NGTEGPNFYVPFSNATGVV;SEQ ID NO: 10)，以及20個氨基酸殘基(NGTEGPNFYVPFSNATGVVR;SEQIDN0:16)。使用這種修飾，表達產(chǎn) 量（歸一化為成熟的B D N F的濃度）可以得到提高。結(jié)果示于下表（歸一化至成熟B D N F的濃 度)。 2 ^4
[0141] 超出定量的線性范圍
[0142] 出人意料的是，當與天然的非糖基化BDNF相比時，包含糖基化標簽的BDNF變體也 具有提高的生物活性(CHO-TrkB熒光素酶報告基因測定）。結(jié)果示于下表。
[0143] ^5
[0145] 其它可能的糖基化標簽是AAANGTGGA(-個N糖基化位點基序；SEQ ID NO: 17)， ANITVNITV(兩個N-糖基化位點基序；SEQ ID NO: 18)，和NATGADNGTGAS(兩個N-糖基化位點 基序；SEQ ID NO: 19)。
[0146] ii)引入的一個或多個N-糖基化位點基序
[0147] 為了提高BDNF的（分泌)產(chǎn)量，將人工N-糖基化位點引入BDNF氨基酸序列。人工N-糖基化位點可以例如通過對BDNF氨基酸序列進行點突變而被引入(N-糖基化位點基序： Asn-Xxx-Ser/Thr ;Xxx是除了Pro以外的任何氨基酸）。制備相應的編碼核酸序列并在 HEK293細胞中瞬時表達。突變編號基于成熟BDNF的氨基酸序列（SEQ ID NO: 25)。分析分泌 的BDNF變體的表達/分泌水平，N-糖基化程度(通過免疫印跡分析從條帶的迀移推導，其中， 每引入和使用一個N-糖基化位點，Mff大約增大3-5kDa(當與非糖基化BDNF參考相比時）），以 及經(jīng)由CHO-TrkB熒光素酶報告基因測定的功能/受體結(jié)合。結(jié)果示于下表(表達產(chǎn)量和生物 活性歸一化至成熟BDNF的濃度)和圖3。
[0148] 塾
[0150] n.d.:未確定
[0151] 沒有糖基化
[0152] +:部分糖基化
[0153] ++:完全糖基化
[0154] 表7
和儲存或者胞外運輸(例如，分泌到培養(yǎng)基中）期間的失活。前-和原-區(qū)段對于成熟多肽的 生物活性來說不是必需的。如果原-區(qū)段未能正確地處理，即，（前-)原-區(qū)段未從成熟蛋白 切掉(例如，在生產(chǎn)/分泌細胞中），它可改變成熟多肽的生物物理、生物化學和/或生物學活 性。
[0165] 下文報道的方法適合于在體內(nèi)通過酶促切割從原-多肽產(chǎn)生的多肽。
[0166] 如本文所報道的一個方面是使用變體原-多肽從原-多肽產(chǎn)生重組多肽的方法，包 括以下步驟：
[0167] -培養(yǎng)包含編碼原-多肽(原-區(qū)段和多肽的融合多肽）的核酸的哺乳動物細胞，其 中原-區(qū)段和多肽之間的內(nèi)源性酶促切割位點已被替換為外源性蛋白酶切割位點，
[0168] -從細胞或培養(yǎng)基中回收重組變體原-多肽，切割所述原-多肽，并由此產(chǎn)生重組多 肽。
[0169] 如本文所報道的一個方面是用于從原-融合多肽產(chǎn)生融合多肽的方法，包括以下 步驟：
[0170] -培養(yǎng)包含編碼變體原-融合多肽的核酸的哺乳動物細胞，其中原-融合多肽的氨 基酸序列已通過以下而被修飾，即，將天然原-融合多肽中的原-區(qū)段和融合多肽之間的內(nèi) 源性蛋白酶切割位點替換為外源性(相對于所述融合多肽的部分的一個或多個來源)或人 工蛋白酶切割位點，
[0171]-從細胞或培養(yǎng)基中回收原-融合多肽，切割所述原-融合多肽，并由此產(chǎn)生所述 (重組的)融合多肽。
[0172] 在如本文所報道的一個方面中，原-多肽中的原-區(qū)段和成熟多肽之間的蛋白酶切 割位點被替換為外源性(相對于多肽或融合多肽的部分的來源)或人工蛋白酶切割位點。
[0173] 如在此上下文中使用的術(shù)語"內(nèi)源性蛋白酶切割位點"表示在原-區(qū)段和成熟多肽 之間的天然發(fā)現(xiàn)的蛋白酶切割位點。
[0174] 如在此上下文中使用的術(shù)語"外源性蛋白酶切割位點"表示在原-區(qū)段和成熟多肽 之間的非天然發(fā)現(xiàn)的蛋白酶切割位點。
[0175] 通過從內(nèi)源性蛋白酶切割位點改變成外源性蛋白酶切割位點，將分泌的原-多肽 加工和切割成其成熟形式可以得到改善。
[0176] 外源性蛋白酶切割位點可以來自任何蛋白酶，只要蛋白酶不存在/表達于原-多肽 所源自的細胞(即，原-多肽天然存在(部分或完全地)的細胞)中。
[0177] 外源性蛋白酶切割位點（相對于多肽的來源)可以是任何蛋白酶切割位點，如，舉 例來說，IgA蛋白酶切割位點，TEV蛋白酶切割位點(煙草蝕紋病毒），顆粒酶B切割位點，凝血 酶切割位點，因子10切割位點，腸激酶切割位點，枯草桿菌蛋白酶切割位點，組織蛋白酶切 割位點，金屬蛋白酶切割位點，IDES蛋白酶切割位點，PreScission蛋白酶切割位點，或者它 們的功能性變體。
[0178] 原-多肽的切割可以在多肽的重組生產(chǎn)期間的不同時間點發(fā)生。
[0179] 原-多肽的切割可以是在培養(yǎng)基中。在本文中，外源性蛋白酶(實現(xiàn)原-多肽的切 害J)被加入到培養(yǎng)基中，或者，外源性蛋白酶(實現(xiàn)原-多肽的切割)共表達于培養(yǎng)基中。
[0180] 也可以在原-多肽從細胞分離后切割原-多肽，例如，在下游加工之前、期間和之后 (但是在培養(yǎng)之后）。
[0181] 在一個優(yōu)選的實施方案中，外源性蛋白酶切割位點與原-多肽和表達原-多肽的重 組細胞來自不同的生物體。這樣具有可以限定原-多肽的加工點的優(yōu)點。如果表達變體原-多肽的細胞不共表達外源性蛋白酶，并且，外源性蛋白酶不被加入到培養(yǎng)基中，那么分別來 說，切割可以不再由表達變體原-多肽的細胞或者在培養(yǎng)期間實現(xiàn)。
[0182] 在一個實施方案中，在純化期間進行原-多肽的切割。
[0183] 在一個實施方案中，在純化過程期間在柱上進行原-多肽的切割。在一個具體的實 施方案中，所述柱是親和柱。
[0184] 在一個優(yōu)選的實施方案中，在原-多肽已從培養(yǎng)基中分離之后通過將原-多肽和蛋 白酶孵育進行原-多肽的切割。在一個實施方案中，在第一(層析)純化步驟之后進行所述孵 育。在一個實施方案中，在柱上完成所述孵育。
[0185] 該技術(shù)也允許例如將人工純化標簽(如，舉例來說，Hi s6標簽，myc標簽，HA標簽，或 者生物素/親和素標簽)包含在原-區(qū)段中用于改善/簡化純化。
[0186] 在一個實施方案中，原-多肽包含原-區(qū)段和成熟多肽，其中所述原-區(qū)段包含純化 標簽。在一個實施方案中，所述純化標簽選自包括His6標簽、myc標簽、HA標簽、以及生物素/ 親和素標簽的純化標簽的組。
[0187] 在一個實施方案中，包含純化標簽的原-多肽的切割在使用所述純化標簽的純化 步驟之后進行。
[0188] 在任何情況下，在將成熟多肽施用給患者之前進行原-區(qū)段從成熟多肽的切割。在 一個實施方案中，所述切割在體外進行。
[0189] 在一個優(yōu)選的實施方案中，內(nèi)源性蛋白酶切割位點是IgA蛋白酶切割位點并且所 述純化標簽是6-組氨酸(His6)標簽。在一個實施方案中，所述6-組氨酸標簽經(jīng)由GSG肽與所 述蛋白酶切割位點綴合。
[0190] 實例:在BDNF原-多肽中具有外源性蛋白酶切割位點的前-原-BDNF變體
[0191] 被表達為(前_)原-多肽并被切割成成熟形式的示例性多肽是BDNF。
[0192] 野生型的人BDNF在HEK293細胞中表達。在多肽加工期間（即，在表達/重組生產(chǎn)期 間），原-區(qū)段僅被宿主細胞的蛋白酶部分去除，由此得到成熟BDNF和未加工的原-BDNF的混 合物。人原-BDNF主要由分泌性原-蛋白轉(zhuǎn)化酶弗林蛋白酶在宿主細胞內(nèi)在分泌期間加工。
[0193] 原-BDNF變體這樣工程化，其中天然存在的弗林蛋白酶切割位點被替換為外源性 IgA蛋白酶切割位點。IgA蛋白酶識別并切割包含氨基酸序列N-X-Z-Pr〇-Pr〇/-Y-Pr〇-C(X = 優(yōu)選Pro或Ser; Y = Thr、Ser或Ala; Z =優(yōu)選Arg或Thr)的蛋白質(zhì)。原-BDNF多肽的氨基酸序列 包含弗林蛋白酶切割位點(RVRR; SEQ ID NO: 21)。該弗林蛋白酶切割位點被替換為IgA蛋白 酶切割位點(GSVVAPPAP; SEQ ID NO: 22)。另外，His6標簽經(jīng)由GSG接頭肽與BDNF的C-末端融 合(HHHHHH;用于親和純化;SEQ ID NO: 23)。此外，去除了潛在的蛋白酶切割位點（缺失C-末 端氨基酸序列RGR;SEQ ID NO: 24)。在比較性變體中，R54A突變被引入BDNF的原-多肽中 (前-原-BDNF多肽在氨基酸位置54具有氨基酸殘基Ala而不是Arg)，和/或用T7-His6標簽代 替His6標簽。結(jié)果示于下表(生物活性歸一化至成熟BDNF的濃度）。
[0194] 塾
[0196] R54A突變的編號是基于野生型前-原-BDNF的氨基酸序列（SEQ ID N0:20)。
[0197] 工程化的前-原-BDNF多肽在HEK293細胞以高產(chǎn)量表達。分泌的工程化的原-BDNF 多肽通過用IgA蛋白酶切割在體外高效地轉(zhuǎn)化成成熟天然BDNF。
[0198] 因此，與包含天然弗林蛋白酶/PC轉(zhuǎn)化酶切割位點的天然前-原-BDNF多肽的表達 形成對照，包含外源性IgA蛋白酶切割位點的工程化的原-BDNF多肽作為單一表達產(chǎn)物而獲 得。另外，獲得了提高的表達產(chǎn)量。此外，在TrkB熒光素酶報道子細胞測定中，與從野生型 前-原-BDNF獲得的成熟BDNF多肽對比，從工程化的原-BDNF多肽獲得的成熟BDNF多肽具有 提尚的生物活性。
[0199] 實例：具有外源性蛋白酶切割位點和位于BDNF原-多肽內(nèi)的工程化純化標簽的前-原-BDNF變體
[0200] 親和標簽對于重組產(chǎn)生的多肽的簡單和高效的純化是非常有用的。然而，殘留在 最終的治療性蛋白質(zhì)中的人工純化標簽在臨床用途上是不可接受的，這歸因于多種原因， 包括:潛在的免疫原性，生物物理和生物化學性質(zhì)以及生物活性的變化。為了克服這些局限 性，可去除的純化標簽是有利的。
[0201 ]在一個實施方案中，（BDNF)原-多肽包含純化標簽。
[0202]原-BDNF變體這樣工程化，其中，將His6標簽引入原-多肽中。此外，將天然存在的 弗林蛋白酶切割位點替換為外源性IgA蛋白酶切割位點和/或?qū)54A突變引入原-多肽中。 [0203] 在比較性變體中，His6標簽經(jīng)由GSG接頭肽與BDNF的C-末端融合。另外，用T7-His6 標簽代替His6標簽。結(jié)果示于下表(生物活性歸一化至成熟BDNF的濃度)和圖2。
[0204] ^9
[0206] 用體外和體內(nèi)測定確認從不同的原-BDNF變體多肽得到的BDNF多肽的生物活性/ 功能。包含IgA蛋白酶切割位點的構(gòu)建體顯不出提尚的活性。
[0207] 插入原-多肽的N-末端區(qū)域內(nèi)的可去除的純化標簽(例如，6-組氨酸標簽)可用于 高效純化，并且在體外蛋白質(zhì)成熟過程中將被切掉。由此，在將用于體內(nèi)施用的成熟多肽中 將不會保留潛在免疫原性的肽序列。
[0208] III.通過降低等電點提高表達
[0209] -些具有堿性等電點（IEP)(即，等電點高于9)的多肽，例如神經(jīng)營養(yǎng)蛋白，傾向于 形成聚集體。
[0210] 在如本文所報道的一個方面中，降低多肽的等電點被用于增加用哺乳動物細胞重 組產(chǎn)生的多肽的產(chǎn)量。此方法特別適用于具有高于9的等電點（高等電點，堿性等電點）的多 肽，如，舉例來說，神經(jīng)營養(yǎng)蛋白。等電點的降低(減?。┛梢酝ㄟ^增加多肽中的負電荷的數(shù) 量來實現(xiàn)，例如，通過引入帶負電荷的氨基酸殘基和/或與帶負電荷的部分(如，接頭肽)融 合?；蛘撸琁EP的降低可以通過從多肽表面移除正電荷來實現(xiàn)，例如，通過在多肽表面引入帶 負電荷的氨基酸殘基。這可以例如通過將一個或多個堿性氨基酸殘基替換為一個或多個中 性親水性氨基酸殘基和/或一個或多個酸性氨基酸殘基或它們的組合來完成。
[0211] 實例:具有降低的等電點的BDNF變體
[0212] BDNF具有大約為10的等電點，并且是一種粘性的堿性(basic)/堿性(alkaline)分 子（參見，例如LeibrockJ.等人，Nature 341(1989) ,149-152)。
[0213] 為了提高(分泌)產(chǎn)量，BDNF變體這樣工程化，其中，氨基酸殘基被改變以降低分子 的等電點。此外，T7-His6標簽經(jīng)由GSG接頭肽與BDNF的C-末端融合。另外，在一個比較性變 體中，去除了潛在的蛋白酶切割位點（缺失C-末端氨基酸序列RGR;SEQ ID N0:23)。在第一 變體中，引入了以下氨基酸突變:P60E、K65D、K73D和K95A。在第二變體中，引入了以下氨基 酸突變：K65D、K73D、K95A和R97A。已經(jīng)用EMBOSS IEP方法（Alan Bleasby (a jb? ebi · ac ·uk);歐洲生物信息研究所（European Bioinformatics Institute)，Wellcome Trust Genome Campus，Hinxton，Cambridge CBlO 1SD，UK)計算了IEP值。結(jié)果不于下表（生 物活性歸一化至成熟BDNF的濃度）。
[0214] ^lO
[0216] 超出定量的線性范圍
[0217] 與野生型BDNF形成對照，具有降低的IEP的工程化BDNF變體在瞬時轉(zhuǎn)染的HEK293 細胞的細胞培養(yǎng)基/上清液中穩(wěn)定積累超過3至6天。這也通過細胞培養(yǎng)研究得到顯示，其中 純化的成熟BDNF(在大腸桿菌中產(chǎn)生)和純化的降低IEP的myc標記的BDNF變體被加入生長 的HEK293宿主細胞培養(yǎng)物(BDNF濃度為10μg/ml)中。4天的細胞培養(yǎng)之后，通過還原的SDS PAGE和蛋白質(zhì)印跡分析確定了細胞培養(yǎng)上清液中剩余的BDNF濃度:4天后，成熟BDNF從細胞 培養(yǎng)上清液中被完全清除，而myc標記的BDNF變體幾乎完全穩(wěn)定(參見圖1)。
[0218] IV.通過不同修飾的組合提高表達
[0219] 在如本文中所報道的一個方面中，已進行/引入以下修飾中的一種或多種，以改進 多肽的重組生產(chǎn)：
[0220] i)引入一個或多個糖基化位點，和/或
[0221] ii)將原-區(qū)段和成熟多肽之間的內(nèi)源性蛋白酶切割位點替換為外源性(相對于多 肽的來源)或人工蛋白酶切割位點，和/或
[0222] iii)降低多肽的等電點，和/或
[0223] iv)通過調(diào)節(jié)接頭肽長度、連接性和電荷。
[0224] 為了進一步改進多肽的重組生產(chǎn)，在某些實施方案中，組合使用任何兩種、任何三 種或所有四種上述修飾。
[0225] 實例:神經(jīng)營養(yǎng)蛋白
[0226] 示例性的神經(jīng)營養(yǎng)蛋白是腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)。
[0227] 在BDNF的氨基酸序列中，已進行以下修飾中的兩種或更多種：
[0228] -引入一個或多個人工N-糖基化位點，
[0229] -引入視蛋白標簽作為N-糖基化標簽，和
[0230]-將內(nèi)源性弗林蛋白酶切割位點替換為外源性IgA蛋白酶切割位點。
[0231 ]結(jié)果示于下表(生物活性歸一化至成熟BDNF的濃度）。
[0232]
[0234] 從圖4可以看出，與不具有額外的N-糖基化位點的BDNF變體（圖4中的C、D和E道)相 比，包含一個或多個額外的N-糖基化位點的BDNF變體多肽的表達/分泌產(chǎn)量得到提高（圖4 中的A、B和F道）。
[0235] ^12
[0238] V.血腦屏障轉(zhuǎn)運的融合多肽的提高的表達
[0239] 大的生物治療藥物的腦滲透受到廣泛的和不能滲透的血腦屏障(BBB)以及神經(jīng)血 管單元(NVU)中的其它細胞組分的嚴格限制。已經(jīng)試驗了用于克服這一障礙的許多策略，并 且其中一個是利用轉(zhuǎn)胞吞作用（transcytosis)途徑，該途徑由在大腦毛細血管內(nèi)皮上表達 的內(nèi)源性受體所介導。已經(jīng)針對這些受體設(shè)計重組蛋白如單克隆抗體或多肽，以允許將生 物治療藥物由受體介導遞送至大腦。
[0240]生物治療藥物對中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)中的病理的治療具有巨大治療潛力。然而，它 們進入大腦的路線被BBB所阻止。先前的研究已闡明，注入血流的IgG中的非常小的百分比 (大約0.1%)能夠滲透到CNS區(qū)室中（Felgenhauer,Klin.Wschr.52( 1974) 1158-1164)。這必 定會限制任何藥理作用，因為該生物治療藥物在CNS中處于低濃度。因此，介導生物治療藥 物(如神經(jīng)營養(yǎng)因子)運輸進入大腦的、包括抗體片段的載體具有很高的醫(yī)療需求。
[0241]因此，已經(jīng)開發(fā)了包含效應子實體和與BBB受體結(jié)合的單價或二價結(jié)合實體的融 合多肽(參見，例如，EP 12182181.3)。
[0242] 在一個實施方案中，所述單價結(jié)合實體特異性結(jié)合血腦屏障受體，或者與血腦屏 障受體特異性結(jié)合的單價抗體片段，優(yōu)選地，選自scFv、Fv、scFab、Fab和VHH。
[0243] 在一個實施方案中，所述效應子實體是神經(jīng)營養(yǎng)多肽，如BDNF。
[0244] 在一個實施方案中，所述血腦受體選自由轉(zhuǎn)鐵蛋白受體、胰島素受體、胰島素樣生 長因子受體、低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白8、低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白1，和結(jié)合肝素的表 皮生長因子樣生長因子組成的組。
[0245] 實例:包含抗體部分和BDNF的融合多肽
[0246] Boado等人（Biotechnol .Bioeng.97(2007) 1376-1386)報道了一種抗體-BDNF-融 合多肽，其中人BDNF的氨基末端與識別人胰島素受體的嵌合抗體的重鏈的羧基末端融合。 然而，該融合多肽的表達是不可能的，因為該融合多肽在細胞內(nèi)聚集。
[0247] 通常，野生型BDNF或BDNF變體可以經(jīng)由其C-末端或其N-末端與抗體多肽鏈融合。 由于BDNF僅作為同源二聚體而有活性，生物活性的抗體-BDNF融合多肽的工程化需要i) BDNF部分的折疊、成熟和裝配以及ii)抗體多肽鏈/結(jié)構(gòu)域的折疊和裝配均正確。因此，不同 的融合多肽形式(復合物)是可能的，如，舉例來說，由兩條重鏈和輕鏈組成的完整抗體，由 輕鏈和重鏈片段組成的抗體Fab片段，單鏈Fab(scFab)或單鏈Fv(scFv)，與BDNF多肽的N-末 端或C-末端融合的組合。另外，融合多肽復合物可以包含兩條或更多條不同的多肽鏈，如， 下列組合，例如，BDNF-scFv融合多肽和成熟（非融合)BDNF多肽，BDNF-Fab (重鏈)融合多肽 和BDNF-Fab (輕鏈)融合多肽，或者BDNF-Fab (重鏈)融合多肽和Fab (輕鏈)融合多肽和成熟 (非融合)BDNF多肽。此外，BDNF多肽可以直接或經(jīng)由接頭肽與相應的抗體鏈多肽融合。接頭 肽可以在以下方面不同：i)氨基酸數(shù)量，ii)氨基酸種類(例如，帶負電荷的氨基酸和/或疏 水性氨基酸），和ii i)工程化的推定翻譯后修飾基序(例如，N-連接的糖基化位點基序）。例 如，BDNF多肽可以與經(jīng)由不同的接頭肽連接的不同抗體片段（例如，F(xiàn)ab、scFab和scFv)綴 合，導致不同的生物活性融合多肽。
[0248] 如本文所報道的一個方面是一種融合多肽，其包括
[0249] -恰好一個野生型BDNF多肽，或者具有BDNF活性的BDNF變體多肽或其片段，
[0250]-抗體片段，和
[0251 ] -BDNF多肽和抗體片段之間的接頭肽。
[0252]如本文所報道的一個方面是一種具有BDNF活性的融合多肽（例如，二聚復合物）， 其包括
[0253] -恰好一種野生型BDNF多肽，或者具有BDNF活性的BDNF變體多肽或其片段，
[0254] -抗體片段，和
[0255] -BDNF多肽和抗體片段之間的接頭肽。
[0256] 如本文所報道的另一個方面是一種二聚復合物，其由以下組成
[0257] -作為第一組分，如本文所報道的融合多肽，和
[0258] -作為第二組分的野生型BDNF多肽，或具有BDNF活性的BDNF變體多肽或其片段。 [0259]已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，BDNF-抗體-融合形式僅在與第二非融合BDNF多肽的復合物中以生物活 性形式表達和正確裝配，如果該形式包括恰好一個經(jīng)由接頭肽與抗體片段共價融合的BDNF 多肽和恰好一個非融合BDNF多肽。
[0260]另外，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，使用包含一個或多個帶負電荷的氨基酸殘基的接頭肽，可以進一 步提高這類構(gòu)建體的表達。
[0261] 不同的融合多肽形式在HEK293細胞中瞬時表達。使用蛋白質(zhì)印跡和/或基于蛋白A 的高效液相色譜（HPLC)測定進行分析。結(jié)果示于下表（生物活性歸一化至成熟BDNF的濃 度)。
[0262] 表13
[0266] pp-BDNF =前-原-BDNF
[0267] n.a·=不適用
[0268] n.d.=未測定
[0269] VL(I)=與抗IGF-IR抗體的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的N-末端融合的BDNF
[0270] VH(I)=與抗IGF-IR Fab抗體片段的重鏈可變結(jié)構(gòu)域的N-末端融合的BDNF
[0271 ] VL (II )=與抗TfR抗體(抗轉(zhuǎn)鐵蛋白受體抗體)的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的N-末端融合的 BDNF
[0272] VH(II)=與抗TfR Fab抗體片段的重鏈可變結(jié)構(gòu)域的N-末端融合的BDNF
[0273] 無 -LC =與所用重鏈同源的無融合BDNF的輕鏈抗體多肽鏈
[0274] scFv =與抗IGF-1R抗體的scFv的N-末端融合的BDNF
[0275] * :來自Peprotech的商業(yè)材料
[0276] * * :在大腸桿菌中重組產(chǎn)生
【附圖說明】
[0277] 圖1在細胞培養(yǎng)期間BDNF變體的穩(wěn)定性。在大腸桿菌中產(chǎn)生的野生型BDNF(A)和通 過在HEK293細胞中瞬時表達產(chǎn)生的myc標記的BDNF(B)被加入到HEK293細胞的生長培養(yǎng)物 (10μg/ml)中，并且，在第0天和第4天通過還原性SDS PAGE和蛋白質(zhì)印跡分析確定樣品中的 BDNF濃度，所述蛋白質(zhì)印跡分析使用抗BDNF抗體用于染色/可視化；1道:來自Peprotech (大 腸桿菌)的參考物質(zhì);2道:分子量標記;為簡單起見，該蛋白質(zhì)印跡已被切割和重新組裝。
[0278] 圖2含有表達/分泌的BDNF變體多肽的細胞培養(yǎng)上清的SDS-PAGE/蛋白質(zhì)印跡分 析;1道:分子量標記;2道:表9第1行;3道:表9第5行;4道:表9第2行;5道:表9第4行;6道:表9 第3行;7道=HiBDNF參考;為簡單起見，該蛋白質(zhì)印跡已被切割和重新組裝。
[0279] 圖3含有表達/分泌的BDNF變體多肽的細胞培養(yǎng)上清的SDS-PAGE/蛋白質(zhì)印跡分 析；1道:分子量標記;2道:表6第1行(糖基化的原-BDNF); 3道:表6第2行(原-BDNF);4道:表6 第3行(糖基化的成熟BDNF) ;5道:表6第4行(成熟BDNF)。
[0280] 圖4含有如表11中的表達/分泌的BDNF變體多肽的細胞培養(yǎng)上清的SDS-PAGE/蛋白 質(zhì)印跡分析;A道:表11第1行;B道:表11第2行;C道:表11第3行;D道:表11第4行;E道:表11第 5行;F道:表11第6行;星號表不使用不同的表達條件。
[0281]提供下列實施例、序列和附圖以幫助理解本發(fā)明，本發(fā)明的真正范圍在所附權(quán)利 要求中闡述。應當理解，可以在所闡述的方法中做出修改，而不脫離本發(fā)明的精神。 實施例
[0282] 重組DNA技術(shù)
[0283] 使用如 Sambrook, J.等人，Molecular cloning:A laboratory manual;Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor ,New York, 1989 中記載的標準方 法操作DNA。按照制造商的說明使用分子生物學試劑。
[0284] 基因合成
[0285] 在Geneart GmbH(Regensburg,Germany)通過化學合成制備期望的基因和基因片 段。將合成的基因和基因片段克隆到大腸桿菌質(zhì)粒中用于增殖/擴增。通過DNA測序驗證亞 克隆的基因和基因片段的DNA序列。
[0286] 蛋白質(zhì)測定
[0287] 使用基于多肽的氨基酸序列計算的摩爾消光系數(shù)，通過在280nm處測定光密度 (OD)來確定純化的多肽的蛋白質(zhì)濃度。
[0288] 基本/標準哺乳動物表達質(zhì)粒的描述
[0289] 通過人胚腎細胞(HEK293)的瞬時轉(zhuǎn)染表達期望的基因/多肽。關(guān)于期望的基因/多 肽(例如，抗體-GFP-融合多肽，野生型BDNF，K)NF變體多肽，BDNF-Fab-和BDNF-scFv-融合多 肽)的表達，使用了包含以下功能元件的轉(zhuǎn)錄單元：
[0290] -包括內(nèi)含子A的、來自人巨細胞病毒(HCMV)的立即早期增強子和啟動子，
[0291] -人重鏈免疫球蛋白5'-非翻譯區(qū)（5'UTR)，
[0292] -待表達基因，和
[0293]-牛生長激素多腺苷酸化序列(BGH pA)。
[0294] 除包括待表達的期望基因的表達單元/盒之外，基本/標準的哺乳動物表達質(zhì)粒包 含
[0295] -來自載體pUC18的復制起點，其允許該質(zhì)粒在大腸桿菌中的復制，和
[0296] -β-內(nèi)酰胺酶基因，其賦予大腸桿菌氨芐青霉素抗性。
[0297] 實施例1
[0298] 生成抗體表達質(zhì)粒
[0299] a)生成親本人抗人IGF-IR抗體的抗體表達質(zhì)粒
[0300] 將編碼人κ輕鏈(Vk)和重鏈可變區(qū)（VH)的基因區(qū)段分別連接到編碼人κ輕鏈恒定 區(qū)（Ck)或人γ-l重鏈恒定區(qū)（CHl-鉸鏈-CH2-CH3)的基因區(qū)段。兩個抗體鏈基因由兩個獨立 的表達質(zhì)粒表達，所述表達質(zhì)粒包括抗體基因的基因組外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)?？谷薎GF-IR抗 體的成熟(不含信號序列）重鏈和輕鏈的氨基酸序列示于SEQ ID Ν0:05和SEQ ID Ν0:06。
[0301] 抗體鏈的表達受控于:縮短的、刪除內(nèi)含子A的、來自人巨細胞病毒(HCMV)的立刻 早期增強子和啟動子(包括人重鏈免疫球蛋白5'-非翻譯區(qū)（5'UTR))，鼠免疫球蛋白重鏈信 號序列，以及來自牛生長激素的多腺苷酸化信號（BGH pA)。該表達質(zhì)粒還包含來自載體 pUC18的復制起點和β-內(nèi)酰胺酶基因，用于在大腸桿菌中質(zhì)粒擴增(參見Kopetzki，E.等人， Virol .J. 5(2008)56; Ji，C.等人 J.Biol.Chem. 284(2009)5175-5185)。
[0302] b)生成抗轉(zhuǎn)鐵蛋白受體抗體輕鏈表達質(zhì)粒
[0303] 為了獲得抗轉(zhuǎn)鐵蛋白受體抗體的輕鏈，化學合成了這樣的輕鏈基因，該輕鏈基因 編碼鼠免疫球蛋白重鏈信號序列MGWSCIILFLVATATGVHS(SEQ ID NO: 14)，大鼠抗鼠轉(zhuǎn)鐵蛋 白受體的VL可變結(jié)構(gòu)域，以及人Vk輕鏈恒定區(qū)。大鼠抗體的VL結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列獲自 Boado ,R.J.等人，Biotechnol .Bioeng. 102(2009) 1251-1258。嵌合大鼠/人抗轉(zhuǎn)鐵蛋白受體 抗體輕鏈的氨基酸序列示于SEQ ID NO:80。
[0304] 實施例2
[0305]生成抗體-GFP-融合多肽表達質(zhì)粒
[0306] a)生成關(guān)于抗IGF-IR抗體-GFP融合多肽的表達質(zhì)粒
[0307]通過將編碼相應的GFP變體和由2Gly4Ser重復和另外的Gly組成的甘氨酸-絲氨酸 接頭（重鏈…LSPG-gggsggggsg-GFP)的、化學合成的DNA片段融合至編碼稍微截短的人 γ-l重鏈恒定區(qū)（去除最后一個天然氨基酸Lys)的抗-IGF-IR抗體重鏈基因的3'端，裝配整 個抗人IGF-IR抗體重鏈-GFP-融合多肽編碼基因?？笽GF-IR抗體重鏈eGFP、emGPF和tagGFP 融和蛋白的氨基酸序列分別示于SEQ ID NO:07,SEQ ID NO:08和SEQ ID NO:09。
[0308]抗體重鏈和輕鏈基因從兩個獨立的表達質(zhì)粒表達，所述表達質(zhì)粒包括抗體基因的 基因組外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)。
[0309] b)生成抗IGF-IR抗體重鏈-eGFP-視蛋白標簽-融合多肽的表達質(zhì)粒 [0310]用于在HEK293細胞中瞬時表達抗IGF-IR抗體重鏈-GFP-視蛋白標簽-融合多肽的 表達質(zhì)粒衍生自上述表達載體。它們的不同之處僅在于編碼GFP-視蛋白標簽的DNA區(qū)段，其 中19個氨基酸的肽(NGTEGPNFYVPFSNATGVV;視蛋白（M) ;SEQ ID NO: 10)與相應GFP的C-末端 直接融合。作為示例，抗IGF-IR抗體重鏈-eGFP-視蛋白（M)標簽-融合多肽的氨基酸序列示 于SEQ ID NO:33。
[0311] 實施例3
[0312] 生成BDNF表達質(zhì)粒
[0313] a)生成野生型前-原-BDNF的表達質(zhì)粒
[0314]通過化學合成制備編碼人前-原-BDNF基因的DNA區(qū)段，并插入到上述基本表達載 體中。為此目的，前-原-BDNF基因在其5'端與CMV啟動子連接，并且在其3'端與牛生長激素 多腺苷酸化序列連接。野生型前-原-BDNF蛋白的氨基酸序列示于SEQ ID NO:20。
[0315] b)生成BDNF變體的表達質(zhì)粒
[0316]為了獲得最佳產(chǎn)量，構(gòu)建了幾個BDNF變體(見下表）：
[0317]-在一些變體中，野生型BDNF信號序列（前-區(qū)段)被交換為源自高表達的鼠免疫球 蛋白重鏈抗體的信號序列(MGWSCIILFLVATATGVHS);
[0318] -在一些變體中，編碼BDNF基因的密碼子使用被交換為BDNF的原-區(qū)段中和/或成 熟部分中的優(yōu)化的密碼子使用;通過使用來自Geneart的算法回譯相應氨基酸序列獲得具 有優(yōu)化的密碼子使用的BDNF基因（參見，例如，F(xiàn)ath，S.等人，PLOS One 6(2011)el7596);
[0319] -在一些變體中使用了T7-HiS6標簽(SEQIDN0:12)，因為它通常被認為增強蛋白 質(zhì)表達（參見，例如，Luan，C.H.等人，Genome Res.14(2004)2102-2110);
[0320] -在大多數(shù)的BDNF變體中包括了His6標簽，以便簡化樣品制備/純化；
[0321] -在一些變體中，刪除了最后三個C-末端氨基酸(成熟BDNF的RGR基序），因為它可 能起到隱蔽的蛋白酶切割位點（用于蛋白酶，如弗林蛋白酶或其它PC轉(zhuǎn)化酶)的作用；
[0322] -在另一變體中，BDNF的信號序列和原-區(qū)段被交換為人NGF的相應氨基酸序列，因 為據(jù)公布，該變異提高另一種神經(jīng)營養(yǎng)蛋白的表達（Iwane等人， Appl.Microbiol.Biotechnol.41(1994)225-232)〇
[0323] 表14
[0325] 1:缺失了BDNF的C-末端RGR基序（ARGR)
[0326] 2:源自如SEQ ID NO: 14中所示氨基酸序列所定義的高表達的鼠免疫球蛋白重鏈 抗體的信號序列(MGWSCIILFLVATATGVHS)
[0327] 3:將BDNF的信號序列和原-區(qū)段交換為來自人NGF的相應序列
[0328] c)生成前-原（IgA)-BDNF和前-原（IgA;His6)變體的表達質(zhì)粒，部分在原-區(qū)段中 在成熟BDNF N-末端包括His6標簽
[0329]前-原-(IgA)-BDNF基因編碼原-多肽變體，其中天然存在的弗林蛋白酶切割位點 (RVRR)被替換為具有序列GSVVAPPAP的工程化IgA蛋白酶切割位點(參見下表）。
[0330]此外，在一些變體中，R54A點突變被引入到BDNF的原-多肽中，以破壞推定的蛋白 酶切割位點（參見Mowla,S.J.等人，J.Biol .Chem. 276(2001) 12660-12666)。此外，在一些變 體中，在原-片段中在成熟BDNF N-末端還包括可去除的His6標簽。此標簽簡化了原（IgA; His6)-BDNF變體蛋白的蛋白純化。在用IgA蛋白酶進行最終的體外蛋白質(zhì)成熟時，原（IgA; His6片段)被去除，并因此避免了免疫原性的潛在風險。
[0331] 用于在HEK293細胞中瞬時表達前-原（IgA)-BDNF和前-原（IgA;His6)-BDNF變體基 因/蛋白的表達質(zhì)粒衍生自上述編碼前-原-BDNF(-RGR)-T7-His6蛋白的表達載體。它們在 以下特征中不同：
[0332] ^15
[0334] R54A突變的編號基于野生型前-原-BDNF的氨基酸序列（SEQ ID N0:20)
[0335] d)生成等電點工程化的BDNF變體的表達質(zhì)粒
[0336] 先前一些在大腸桿菌中表達和重折疊的BDNF變體已記載具有工程化的降低的 IEP。對前-原-BDNF(-RGR)-T7-His6基因進行相應突變，并在HEK293細胞中瞬時表達所得到 的突變體BDNF基因（參見下表）。此外，構(gòu)建了my c標記的BDNF變體，因為（I)my c-標簽 (EQKLISEEDL;SEQ ID如:90)引入大約-3的凈電荷差，和（2)1^〇-標簽是人來源的，因此推 測具有較低的免疫原性。
[0337] 表16
[0339] -RGD和（Δ RGR);缺失成熟BDNF的最后3個C-末端氨基酸；
[0340]氨基酸突變編號開始于成熟BDNF的第一個氨基酸；
[0341]使用來自歐洲分子生物學開放軟件包(EMBOSS)的蛋白質(zhì)統(tǒng)計程序pepstats計算 成熟BDNF(-RGR)變體的IEP。
[0342] e)生成具有額外的糖基化位點的BDNF變體的表達質(zhì)粒
[0343] 生成BDNF變體，其具有（1)包含糖基化位點的C-末端標簽或(2)成熟化的BDNF部分 中的一個工程化的糖基化位點。
[0344] 從公布的序列（例如，Meder, D.等人，J.Cell Biol · 168(2005)303-313; Bulbarel Ii，Α·等人，J. Cell Sci. 1 15(2002) 1689-1702 ;Perlman，S ·等人， J · Clin .Endocrinol .Metab · 88(2003)3227-3235 ;W0 2002/002597)推斷出糖基化標簽，并 且，用人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（NetNglyc 服務器;http: //www. cbs · dtu · dk/services/NetNGlyc/)預 測推定的N-糖基化位點。
[0345] 為了在成熟化的BDNF部分中引入N-糖基化位點，對序列進行檢查以確定成熟BDNF 序列中天冬酰胺、絲氨酸或蘇氨酸的存在。然后，基于人BDNF的三維蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)（Ibnd ; www.rcsb.org)，排除了所有非位于表面的Asn、Ser或Thr殘基。對于其余的暴露于表面的 Asn、Ser和Thr殘基，鑒定了相鄰氨基酸殘基，以便通過定點誘變工程化推定的N-糖基化位 點(共有基序:N-X-(S/T)，X =除Pro以外的任何氨基酸）。通過序列比對和蛋白質(zhì)3D結(jié)構(gòu)比 較，使用這些推定的工程化N-糖基化位點的氨基酸位置來鑒定結(jié)構(gòu)和功能同源的神經(jīng)營養(yǎng) 蛋白NGF和NT-3中的相應氨基酸。基于同源的受體：：配體晶體結(jié)構(gòu)（例如，3buk，3i j2and 2ifg)，預期是神經(jīng)營養(yǎng)蛋白：：p75NTR或neutrophin: :Trk(A，B)交互界面的一部分的氨基 酸位置被排除。在推定的BDNF-TrkB/p75交互界面之外的暴露于表面的推定的N-糖基化位 點的所選突變列于下表(第二列）。
[0346] 用于在HEK293細胞中瞬時表達N-糖基化的BDNF變體蛋白的表達質(zhì)粒衍生自編碼 BDNF變體前-原-BDNF(-RGR)-T7-His6(-RGR:截短的成熟野生型BDNF，其中最后3個C-末端 氨基酸RGR被缺失;T7標簽和His6標簽經(jīng)由GSG接頭附接至BDNF的截短的C-末端）的表達載 體。被引入用于生成額外的人工N-糖基化位點的BDNF區(qū)段、標簽、糖接頭(glyco I inkers)和 突變示于下表。
[0347] ^17

[0350] 關(guān)于 BDNF 變體前-原-BDNF(-RGR;M61T)-T7-His6 和前-原-BDNF(-RGR;R81N)-T7-His6,示例性地示出通過定點誘變引入成熟BDNF(ARGR)中的氨基酸突變的SEQ ID No。
[0351] f)生成包含用于引入多個(兩個或更多個)N-糖基化位點和IgA切割位點的組合的 突變的BDNF變體的表達質(zhì)粒
[0352] 為了產(chǎn)生具有多個N-糖基化位點的BDNF變體，將先前實驗中鑒定的額外的N-糖基 化位點中的一些進行組合。起始構(gòu)建體前-原（IgA)-BDNF(-RGR)-His6變體多肽的特征在 于：原-區(qū)段中的IgA蛋白酶切割位點而不是天然弗林蛋白酶位點，C-末端截短的成熟BDNF (缺失了最后3個氨基酸RGR)和C-末端His6標簽。如下表所示引入/附接期望突變和標簽。
[0353] ^18

[0356] g)生成包含用于引入多個(兩個或更多個)N-糖基化位點的組合的突變的BDNF變 體的表達質(zhì)粒
[0357] 為了產(chǎn)生具有多個N-糖基化位點的BDNF變體，將先前實驗中鑒定的額外的N-糖基 化位點中的一些進行組合。為此目的，特征在于C-末端截短的成熟BDNF(缺失了最后3個氨 基酸RGR)和C-末端T7-His6標簽的前-原-BDNF(-RGR)-T7-His6變體蛋白被用作起始物料。 如下表所示插入期望的突變。 「mwl 豐?ο

[0361] 實施例4
[0362] 生成BDNF抗體片段融合多肽表達質(zhì)粒
[0363] a)生成BDNF-Fab抗體重鏈融合多肽的表達質(zhì)粒
[0364] 為了獲得BDNF-(Gly4Ser)n-Fab(抗IGF-IR抗體重鏈）融合多肽，構(gòu)建了用于在 HEK293細胞中瞬時表達的質(zhì)粒，其具有CDS (編碼DNS序列）的化學合成的DNA片段，該CDS編 碼具有以下特征的多肽：
[0365] -缺失了C-末端RGR基序的野生型前-原-BDNF部分在C-末端與富含甘氨酸的接頭 融合，后面跟隨著人抗IGF-IR抗體的Fab重鏈部分(VH-CHl)和C-末端His6標簽；
[0366] -富含甘氨酸的接頭由（G4S)2-GG或(G4S)4-GG或(G4S)6-GG基序組成(參見下表）。
[0367] b)生成BDNF-Fab抗體輕鏈融合多肽的表達質(zhì)粒
[0368] 為了獲得KW-(Gly4Ser)n-Fab融合多肽，構(gòu)建了用于在HEK293細胞中瞬時表達的 質(zhì)粒，其具有CDS的化學合成的DNA片段，該CDS編碼具有以下特征的多肽：
[0369]-缺失了C-末端RGR基序的野生型前-原-BDNF部分在C-末端與富含甘氨酸的接頭 融合，后面跟隨著人抗IGF-IR抗體的Fab VL-Ck輕鏈結(jié)構(gòu)域和C-末端His6標簽；
[0370]-富含甘氨酸的接頭由（G4S)2-GG或(G4S)4-GG或(G4S)6-GG基序組成(參見下表）。 [0371] ^20
[0373] c)生成抗IGF-IR抗體輕鏈的表達質(zhì)粒
[0374] 天然抗IGF-IR抗體輕鏈被用于產(chǎn)生基于抗-IGF-IR的BDNF-Fab復合物?？笽GF-IR 抗體輕鏈表達質(zhì)粒的產(chǎn)生記載于實施例1。
[0375] d)生成包含帶負電荷的Gl y-Asp接頭的BDNF-Fab (抗IGF-IR抗體重鏈)融合多肽的 表達質(zhì)粒
[0376] 為了獲得BDNF-(G3D)4-Fab(抗IGF-IR抗體重鏈)融合多肽，構(gòu)建了用于在HEK293 細胞中瞬時表達的質(zhì)粒，其具有CDS的化學合成的DNA片段，該CDS編碼具有以下特征的多 肽：
[0377] -缺失了C-末端RGR基序的野生型前-原-BDNF部分在C-末端與富含甘氨酸的帶負 電荷的接頭融合，后面跟隨著人抗IGF-IR抗體的Fab VH-CHl重鏈結(jié)構(gòu)域和C-末端His6標 簽；
[0378] -富含甘氨酸的帶負電荷的接頭由(G3D)4_GGGS基序組成。
[0379] e)生成具有原-BDNF區(qū)段中的IgA切割位點、帶負電荷的GlyAsp接頭和多個N-糖基 化位點的BDNF-Fab (抗IGF-IR抗體重鏈)融合蛋白的表達質(zhì)粒
[0380] 為了獲得具有多個N-糖基化位點的原（IgA)-BDNF-(G3D)4-Fab(抗IGF-IR抗體重 鏈)融合多肽，構(gòu)建了用于在HEK293細胞中瞬時表達的質(zhì)粒，其具有CDS的化學合成的DNA片 段，該CDS編碼具有以下特征的多肽：
[0381] -缺失了成熟BDNF的C-末端RGR基序的前-原（IgA)-BDNF部分在C-末端與延長的視 蛋白標簽(NGTEGPNFYVPFSNATGVVR ;視蛋白（L);SEQIDN0:16)融合，后面跟隨著帶負電荷 的富含甘氨酸-天冬氨酸的接頭和針對人胰島素樣生長因子I(IGF-IR)的人單克隆抗體Fab 重鏈部分(VH-CH1，用衍生自鉸鏈的肽EPKSC部分延長)和C-末端His6標簽；
[0382] -帶負電荷的富含甘氨酸-天冬氨酸的接頭由（G3D)4-GGGS基序或(G2D)5-G2SG基 序組成。
[0383]構(gòu)建體的詳情概括于下表中。
[0384] ^21
[0386] f)生成具有原-BDNF區(qū)段中的IgA切割位點、帶負電荷的GlyAsp接頭和多個N-糖基 化位點的BDNF-Fab (抗轉(zhuǎn)鐵蛋白受體抗體重鏈)融合多肽的表達質(zhì)粒
[0387] 為了獲得具有帶負電荷的GlyAsp接頭和多個N-糖基化位點的原（IgA) -BDNF-(G3D)4-Fab(抗TfR)抗體重鏈融合多肽，構(gòu)建了用于在HEK293細胞中瞬時表達的質(zhì)粒，其具 有CDS的化學合成的DNA片段，該CDS編碼具有以下特征的多肽：
[0388] -缺失了C-末端RGR基序的前-原（IgA)-BDNF部分在C-末端與視蛋白（L)標簽融合， 后面跟隨著帶負電荷的富含甘氨酸-天冬氨酸的接頭和嵌合大鼠/人Fab重鏈部分，其中VH 可變結(jié)構(gòu)域源自大鼠8D3單克隆抗體(其針對小鼠轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(mTfR))并且其中CHl結(jié)構(gòu) 域源自人IgGl，以及C-末端His6標簽;抗體的VH結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列獲自Boado，R. J.等人， Biotechnol.Bioeng.102(2009)1251-1258)；
[0389]-帶負電荷的富含甘氨酸-天冬氨酸的接頭由(G3D)4_GGGS基序組成；
[0390] -在大多數(shù)變體中，BDNF的原-區(qū)段和成熟部分之間的內(nèi)源性弗林蛋白酶/PC轉(zhuǎn)化 酶切割位點被交換為IgA蛋白酶切割位點(GSVVAPPAP);
[0391] -在一些變體中，截短的野生型成熟BDNF部分（BDNF; ARGR)被交換為具有人工 R209N糖基化位點的截短的成熟BDNF變體(BDNF( Δ RGR;R209N))。
[0392] 構(gòu)建體的詳情概括于下表中。
[0393] 表22
[0395] 實施例6
[0396] 生成BDNF-scFv融合多肽的表達質(zhì)粒
[0397] 為了獲得BDNF(G4S)3-scFV-抗IGF-IR抗體重鏈融合多肽，構(gòu)建了用于在HEK293細 胞中瞬時表達的質(zhì)粒，其具有CDS的化學合成的DNA片段，該CDS編碼具有以下特征的多肽：
[0398] -缺失了C-末端RGR基序的野生型前-原-BDNF部分在C-末端與(G4S)3接頭融合，后 面跟隨著人抗人IGF-IR抗體的scFv部分；
[0399] -抗人IGF-IR抗體的scFv部分這樣構(gòu)造:VL結(jié)構(gòu)域，后面跟隨(G4S)4-GG接頭、VH區(qū) 和His6標簽;前-原-BDNF(-RGR)_(G4S)3_scFv-His6〈IGF-lR>融合蛋白的氨基酸序列示于 SEQ ID NO:78〇
[0400] 實施例7
[0401] 多肽的瞬時表達、純化和分析表征
[0402] 瞬時表達
[0403] 通過對F17培養(yǎng)基（Invitrogen公司）中培養(yǎng)的HEK293細胞(衍生自人胚腎細胞系 293)進行瞬時轉(zhuǎn)染來產(chǎn)生多肽。關(guān)于轉(zhuǎn)染，使用"無293(293-Free)"轉(zhuǎn)染試劑(Novagen)。包 含抗體和抗體片段(Fab和scFv)的融合蛋白從一個、兩個或三個不同質(zhì)粒表達，在轉(zhuǎn)染時使 用等摩爾質(zhì)粒比例。如制造商的說明中所指明的那樣進行轉(zhuǎn)染。在轉(zhuǎn)染后4至7天收獲包含 重組多肽的細胞培養(yǎng)上清。將上清保存在降低的溫度下，直至純化。
[0404] 關(guān)于在例如HEK293細胞中重組表達人免疫球蛋白的一般信息在例如Meissner，P. 等人，Biotechnol .Bioeng. 75(2001 )197-203中給出。
[0405]
[0406] a)使用兩步法純化GFP融合多肽，該兩步法包括蛋白A層析和Superdex200TM柱上的 尺寸排阻層析
[0407] 過濾含有GFP融合多肽的培養(yǎng)上清。然后，使用以roS(lmM KH2P〇4，10mM NaHP〇4， 137mM NaCl，2.7mM KCl，pH 7.4)平衡的HiTrap MabSelectSuRe(GE Healthcare)通過親和 層析捕獲GFP融合多肽。通過用平衡緩沖液洗滌去除未結(jié)合的多肽，并且用pH 2.8的0.1 M檸 檬酸鹽緩沖液回收融合多肽。洗脫后，立即用pH 9.0的IM Tris堿將級分中和至pH 6.0。
[0408] Superdex 200?(GE Healthcare,Uppsala,Sweden)上的尺寸排阻層析用作第二純 化步驟。尺寸排阻層析在50mM組氨酸緩沖液，0.15M NaCl，pH 6.8中進行?；厥盏腉FP融合多 肽保存在-80 °C。
[0409] b)用兩步方案純化組氨酸標記的蛋白，該兩步法開始是固定化金屬離子親和層析 (IMAC)并且接著是SuperdeX75TM柱上的尺寸排阻層析
[0410]用NaCl將包含組氨酸標記多肽的培養(yǎng)上清調(diào)節(jié)為最終NaCl濃度500mM。使用 AKTAexPlorer 100 系統(tǒng)（GE Healthcare ,Uppsala ,Sweden)，以 lml/min 的流速將經(jīng)過濾 的培養(yǎng)上清加樣到Ni-Sepharose?6快速流動柱，該柱用NiA-緩沖液（50mM TRIS，300mM NaCl，5mM咪唑，如制造商的說明中所指明的，含有無 EDTA蛋白酶抑制劑混合物片劑;無 EDTA 完整迷你片劑;Roche Applied Science)預平衡。用NiA-緩沖液沖洗該柱直到UV讀數(shù)回到 緊貼基線。用10倍柱體積的pH 8.0的50mM TRIS和500mM NaCl中的5mM至300mM線性咪唑梯 度洗脫組氨酸標記的多肽。
[0411 ] Superdex 75?(GE Healthcare ,Uppsala,Sweden)上的尺寸排阻層析用作第二純 化步驟。尺寸排阻層析在5〇!1^組氨酸緩沖液，0.151似(：1，？!16.8中進行。洗脫的組氨酸標 記的蛋白保存在-80 °C。
[0412] 分析表征
[0413] 使用基于氨基酸序列計算的摩爾消光系數(shù)，通過測量280nm處的光密度(OD)確定 純化的多肽的蛋白質(zhì)濃度。在存在和不存在還原劑(5mM的1，4-二硫蘇糖醇）的情況下，通過 SDS-PAGE分析多肽的純度和正確二聚體形成，用考馬斯亮藍染色。使用Superdex 200?分析 性尺寸排阻柱(GE Healthcare ,Uppsala,Sweden)，通過高性能SEC確定Fc融合多肽制備物 的聚集物含量。在通過用神經(jīng)氨酸苷酶、〇-聚糖酶和肽-N-糖苷酶F(Roche Applied Science ,Mannheim,Germany)的組合的酶促處理去除N-聚糖后，通過納米電噴霧QTOF質(zhì)譜 儀(Nano Electrospray QTOF mass spectrometry)驗證還原的多肽的氨基酸骨架的完整 性。
[0414] 培養(yǎng)物上清中的BDNF濃度的測定
[0415] 通過半定量蛋白質(zhì)印跡分析來確定培養(yǎng)物上清中的野生型BDNF、BDNF變體和包含 BDNF的融合多肽的濃度，使用來自PeprotecM目錄號：450-02)的重組人BDNF作為參考標 準。使用兔抗BDNF抗體(Santa Cruz;目錄號：sc-20981)(-抗)和綴合辣根過氧化物酶的羊 抗兔抗血清（1:5000稀釋，Roche Diagnostics GmbH，Germany)(二抗)和增強的化學發(fā)光底 物(LUMI-Light plus蛋白質(zhì)印跡底物，Roche Diagnostics GmbH,Germany)進行染色。
[0416] 也根據(jù)供應商的說明使用來自Promega(目錄號:G7610)的BDNF Emax?:免疫測 定試劑盒（ImmunoAssay Kit)用BDNF ELISA確定BDNF融合多肽的濃度。
[0417] 實施例8
[0418] 體外功能表征
[0419] 野生型GFP和包含GFP的融合多肽的生物活性的測定
[0420]純化的野生型GFP和包含GFP的融合多肽的生物活性通過其生物發(fā)光特性(GFP特 異性熒光)來監(jiān)測。
[0421] 經(jīng)由表面等離子共振(SPR，BIAcore)測定BDNF結(jié)合親和力
[0422]根據(jù)制造商的手冊（由GEHealthcare，Uppsala，Sweden提供），使用胺偶聯(lián)試劑盒 在pH 4.5在CM5芯片上進行捕獲系統(tǒng)（對人IgG特異性的捕獲單抗（mAb) ,Jackson Immunoresearch)的約750共振單位(RU)的胺偶聯(lián)。人Fe標記的TrkB(R&D Systems，目錄號： 688-TK-100)以5μg/ml的濃度被捕獲。通過以1.25μΜ的濃度注入人Fc混合物(Biodesign，目 錄號：50175)封閉過量的結(jié)合位點。范圍從0.1 nM至50nM的不同濃度的包含BDNF的融合多肽 以lOyL/min的流速、在298K下通過流動池120至240秒。監(jiān)測解離階段多至600秒，并通過從 樣品溶液切換為運行緩沖液觸發(fā)。通過用I OOmM磷酸溶液以30yL/min的流速沖洗1分鐘使表 面再生。對于所有實驗，均選擇由GE Healthcare提供的HBS-P+緩沖液（IOmM HEPES(4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙磺酸），pH 7.4，150mM NaCl，0.05%(v/v)表面活性劑P20)。
[0423] 通過減去從空白偶聯(lián)的界面獲得的響應校正體積折射率差異。還減去了空白注射 (雙參照）。
[0424] 使用BIAevaluation 4.1軟件包，通過對用若干不同濃度獲得的傳感圖曲線進行 分析，確定平衡解離常數(shù)(Kd)(定義為ka/kd)。按照適當?shù)慕Y(jié)合模型進行數(shù)據(jù)擬合。
[0425] 通過ELISA測定BDNF結(jié)合親和力
[0426] 用TrkB ELISA測定了包含BDNF的融合蛋白的結(jié)合特性。用PBS中的IygM^TrkB-Fc融合物(R&D Systems)包被Maxisorb板，4°C過夜。用PBSTC(含0 · 05%Tween-20和2%雞血 清(Gibco)的I3BS)在室溫下對板封閉1小時并用I3BST洗滌3次后，將包含BDNF的融合蛋白或 單獨的BDNF以PBSTC中的15至500ng/mL的濃度加入到孔中并在室溫下孵育2小時。洗滌6次 后，用小鼠抗BDNF抗體(克隆4F11. IAl，PBSTC中l(wèi)yg/mL)對孔進行孵育，并且，進一步洗滌 后，用抗小鼠-HRP抗體(PBSTC中1:10000)進行孵育，兩者均在室溫下孵育 滌3次后，使用ABTS底物和492nm波長處的光度定量，檢測HRP活性。
[0427] 通過TrkB報告基因測定來測定包含BDNF的融合蛋白的生物活性
[0428] 用包含穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的熒光素酶報告基因（該報告基因受控于含SRE(血清應答元件） 的啟動子）的TrkB轉(zhuǎn)染的CHO細胞系（CHO-KI-hTrkB/pSRE-Luc)測定BDNF變體和包含BDNF的 融合蛋白的生物活性。在實驗前一天，將細胞培養(yǎng)基由生長培養(yǎng)基(含有10%FCS、2mM L-谷 氨酰胺、300yg/mL G418和3yg/mL嘌呤霉素的Ham's F12)改變?yōu)闊o FCS的相同培養(yǎng)基，用于 饑餓化。第二天，IO5細胞接種于96孔板的每個孔中的50yL培養(yǎng)基中，然后，在50yL培養(yǎng)基 中，以0.02nM和115nM之間的濃度加入BDNF融合蛋白。在37°C，7.5%⑶ 2下孵育4小時后，細 胞在室溫下平衡30分鐘，并且，每孔加入IOOyL的BrightGlo熒光素酶測定試劑(Promega)。 孵育5分鐘后，用Tecan酶標儀讀取發(fā)光(積分時間100ms)。
[0429] 在SH-SY5Y神經(jīng)突生長測定中測定包含BDNF的融合蛋白的生物活性
[0430] 使用人SH-SY5Y成神經(jīng)細胞瘤細胞，用神經(jīng)突生長測定確定BDNF變體和包含BDNF 的融合蛋白的生物活性。簡言之，在正常生長培養(yǎng)基(Ham's F12，l X非必需氨基酸(PAN)， 10 %FCS，2mM L-谷氨酰胺，I X丙酮酸鈉(PAN))中，以4000細胞每孔，將SH-SY5Y細胞接種于 96孔板中，通過加入ΙΟμΜ視黃酸(Sigma)來誘導神經(jīng)元分化。三天后，將培養(yǎng)基更換為含有 不同濃度BDNF融合蛋白的生長培養(yǎng)基。另外三天后，用PBS中的4%多聚甲醛在室溫下對細 胞固定10分鐘，洗滌，簡單通透處理(〇.1%!^切114-100)，用1^3中的1%834進行封閉，并 且使用在PBS/1 %BSA中以1:1000稀釋的TuJl抗體(Covance)針對抗β-微管蛋白免疫反應性 染色，然后洗滌3次，并且用Alexa-488標記的抗山羊抗體(Invitrogen)孵育。通過焚光顯微 鏡確定神經(jīng)突的數(shù)目，每孔評估一個視場。
[0431] 通過FACS測定包含抗體/抗體片段的融合蛋白的結(jié)合活性 [0432]通過FACS測定BDNF融合蛋白與相應目標受體(轉(zhuǎn)鐵蛋白受體，IGF-1R)的結(jié)合活 性。表達相應受體的細胞（小鼠轉(zhuǎn)鐵蛋白受體:MEF-I小鼠胚胎成纖維細胞；IGF-IR:用人 IGF-IR穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的3T3成纖維細胞)從它們的生長培養(yǎng)基中收獲，用PBS洗滌，并重懸于FACS 緩沖液(？83+5^^5;96孔圓底平板的每孔為10(^，包含3\105細胞）中。以1-1(^/1^加入 一抗（取決于所使用的BDNF融合蛋白，例如，抗人Fab( Jackson ImmunoResearch)或抗His6 抗體(Roche))，并且在冰上孵育細胞2小時。用FACS緩沖液洗滌三次后，結(jié)合的抗體使用PE 標記的二抗(Jackson ImmunoResearch，1: 5000-1:10000)來檢測，冰上1小時。再次洗滌細 胞，并在FACS Canto細胞計數(shù)器(Becton-Dickinson)上測量平均焚光。
【主權(quán)項】
1. 使用變體原-多肽產(chǎn)生重組多肽的方法，所述方法包括以下步驟： -培養(yǎng)包含編碼多肽為原-多肽(原-區(qū)段和多肽的融合多肽）的核酸的哺乳動物細胞， 其中將原-區(qū)段和多肽之間的內(nèi)源性酶促切割位點替換為外源性蛋白酶切割位點， -從細胞或培養(yǎng)基中回收重組變體多肽或變體原-多肽，并由此產(chǎn)生重組多肽。2. 根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中外源性蛋白酶切割位點選自包括血纖維蛋白溶酶切割 位點、弗林蛋白酶切割位點、IgA蛋白酶切割位點、TEV蛋白酶切割位點（煙草蝕紋病毒）、顆 粒酶B切割位點、凝血酶切割位點、因子10切割位點、腸激酶切割位點、枯草桿菌蛋白酶切割 位點、組織蛋白酶切割位點、金屬蛋白酶切割位點、IDES蛋白酶切割位點、PreScission蛋白 酶切割位點或它們的功能性變體的組。3. 根據(jù)權(quán)利要求1至2中任一項的方法，其中原-多肽的切割在多肽的純化期間進行。4. 根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項的方法，其中外源性蛋白酶是IgA蛋白酶。5. 用于產(chǎn)生融合多肽的方法，所述方法包括以下步驟： -培養(yǎng)包含編碼變體融合多肽的核酸的哺乳動物細胞，其中融合多肽的氨基酸序列已 通過在原-融合多肽中將原-區(qū)段和融合多肽之間的內(nèi)源性蛋白酶切割位點替換為外源性 (相對于融合多肽的部分的(一個或多個)來源)或人工蛋白酶切割位點而被修飾， -從細胞或培養(yǎng)基中回收融合多肽或原-融合多肽，并由此產(chǎn)生(重組的)融合多肽。6. 根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項的方法，其特征在于融合多肽包括生物活性實體、接頭 肽和與血腦屏障(BBB)受體結(jié)合的單價結(jié)合實體。7. 根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其特征在于接頭肽包含一個或多個帶負電荷的氨基酸殘基。8. 根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項的方法，其特征在于多肽是神經(jīng)營養(yǎng)因子。
【文檔編號】C12P21/02GK105829542SQ201480069054
【公開日】2016年8月3日
【申請日】2014年12月10日
【發(fā)明人】E·科佩特茨基, J·尼韋納, P·邁爾
【申請人】豪夫邁·羅氏有限公司