血漿游離DNA雙分子標(biāo)記、標(biāo)記和檢測血漿cfNDA的方法及其用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[00011本發(fā)明涉及一種血漿游離DNA雙分子標(biāo)記、對血漿cfNDA進(jìn)行標(biāo)記的方法及其用 途，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 血漿中有不含細(xì)胞結(jié)構(gòu)的游離脫氧核糖核酸，被稱為無細(xì)胞脫氧核糖核酸(cell free DNA,cfDNA)[Chan KC,Yeung Sff,Lui WB,RainerTH,L0 YM.Effects of preanalytical factors on the molecular size of cell-free DNA in blood.Clin Chem.2005 Apn51(4):781-4：LcfDNA是一個復(fù)雜的混合體，大部分來自于血液中破裂的血 細(xì)胞或者血管內(nèi)皮細(xì)胞，也有少部分來自于凋亡的胎盤細(xì)胞或者壞死的腫瘤細(xì)胞。通過檢 測cfDNA中少量的胎盤DNA或者腫瘤DNA，就可以不侵入胚胎和不獲取腫瘤活檢組織的情況 下檢測胚胎和腫瘤的遺傳特征【Lo，Y.M.，Corbetta，N.，Chamberlain，P.F.，et al · (1997) Presence offetal DNA inmaternal plasma and serum.Lancet 350，485-487·AND Ignatiadis M，Lee M,Jeffrey SS.Circulating Tumor Cells and Circulating Tumor DNA:Challenges and Opportunities on the Path to Clinical Utility.Clin Cancer Res.2015 Nov 1;21(21):4786-800】，即俗稱的非侵入性胎兒或腫瘤基因檢測。
[0003] 基因檢測的手段很多，高通量測序(next generation sequencing，NGS)就是有效 的手段之一。NGS能夠在單次反應(yīng)中，檢測上億條cfDNA的堿基排列順序，功能十分強(qiáng)大，從 而使其成為非侵入性胎兒或腫瘤基因檢測的重要技術(shù)手段之一。
[0004] 然而，NGS技術(shù)并不是完美的，它在檢測的過程中會出現(xiàn)一定比例的測序錯誤。此 外，它在檢測的起始樣本量較低的DNA時，會導(dǎo)致一定的偏差，影響檢測的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。 這兩個缺陷對非侵入性胎兒或腫瘤基因檢測中的影響非常大。因為血液中cfDNA的含量很 低，并且來自胎盤或者腫瘤只占小部分。當(dāng)胎兒或者腫瘤基因變異的比例和NGS測序錯誤的 比例類似時，就無法準(zhǔn)確判斷檢測結(jié)果是真實的基因變異還是測序錯誤。
[0005] 分子標(biāo)記技術(shù)被開發(fā)和應(yīng)用于NGS項目上，在檢測基因組DNA和轉(zhuǎn)錄組RNA上，均能 有效降低NGS檢測中引入的偏差和錯誤【Schmitt MW，Kennedy SR，Salk JJ，F(xiàn)ox EJ，Hiatt JB，Loeb LA Detection of ultra-rare mutations by next-generation sequencing Proc Natl Acad Sci U S A.2012 Sep 4 ； 109(36): 14508-13 AND Shiroguchi KIJia TZ,Sims PA,Xie XS Digital RNA sequencing minimizes sequence-dependent bias and amplification noise with optimized single-molecule barcodes Proc Natl Acad Sci U S A.2012 Jan 24;109(4):1347-52.】〇

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，提供一種血漿游離DNA雙分子標(biāo)記、對 血漿cfNDA進(jìn)行標(biāo)記的方法及其用途。
[0007] 本發(fā)明的血漿游離DNA雙分子標(biāo)記，為寡核苷酸，序列如下：
[0008] a)5 ' P-GACGTC-GATCGGAAGAGCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG
[0009] b)5 ' ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-GACGTCT
[0010] 寡核苷酸排列從左到右為5'端到3'端，N代表隨機(jī)堿基，P代表磷酸基團(tuán)；寡核苷酸 序列通過人工合成。
[0011]采用血漿游離DNA雙分子標(biāo)記標(biāo)記和檢測血漿cfNDA的方法，包括如下步驟：用雙 分子標(biāo)記寡核苷酸對血漿rfNDA進(jìn)行標(biāo)記，將雙分子標(biāo)記寡核苷酸插入血漿rfNDA中，然后 對標(biāo)記后的血漿cfNDA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再使用寡核苷酸E進(jìn)行測序；
[0012] 所述的雙分子標(biāo)記寡核苷酸的PCR擴(kuò)增引物為寡核苷酸D1和D2，D1和D2的核苷酸 序列如下：
[0013] D1 5 ' AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT
[0014] D2 5'CAAGCAGAAGACGGCATACGAGCTCTTCCGATCT
[0015] 寡核苷酸E的核苷酸序列如下：
[0016] 5 ' ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT
[0017]上述寡核苷酸D1、D2和E的排列從左到右為5 '端到3 '端;寡核苷酸序列通過人工合 成。
[0018] 所述的血衆(zhòng)cfNDA通過如下步驟進(jìn)行制備：1)血衆(zhòng)制備;2)血衆(zhòng)cfDNA提取。
[0019] 所述的血漿cfNDA經(jīng)過預(yù)處理再進(jìn)行標(biāo)記。
[0020] 所述的血漿制備的具體步驟如下：
[0021 ] 1)使用5-10ml經(jīng)過抗凝和防溶血處理的血液，在4攝氏度下，1600g的轉(zhuǎn)速，離心5 分鐘，離心后血液會分層，取最上層液體于新的離心管中；
[0022] 2)在4攝氏度下，15000g的轉(zhuǎn)速，離心15分鐘，取上部液體于新的離心管中，血漿制 備完成。
[0023]所述的血漿cfDNA提取的具體步驟如下：
[0024] 1)按1:10的比例加入裂解液，在60攝氏度下，溫浴20分鐘；
[0025] 2)冷卻到室溫后，加入DNA捕獲磁珠，在磁力架上靜置5分鐘，棄上清；
[0026] 3)用80%的酒精，清洗磁珠2次；
[0027] 4)用洗脫液將cfDNA從磁珠上洗脫。
[0028]所述的預(yù)處理的具體步驟如下：
[0029] 1)以50ul體系計，取提取好的cfDNA 40ul，加入5ul的緩沖液A1和5ul的酶A2,在 PCR儀器上按照如下程序進(jìn)行溫?。?br>[0030]
[0031]^2)使用磁珠或硅基質(zhì)純化柱純化前步的產(chǎn)物;
[0032] 3)以50ul體系計，取32ul純化好的cfDNA產(chǎn)物，加入5ul緩沖液Bl、10ul 10mM dATP 和3ul酶B2，在PCR儀器上按照如下程序進(jìn)行溫浴：
[0033]

[0034] 4)使用磁珠或硅基質(zhì)純化柱純化前步的產(chǎn)物；
[0035] 其中，
[0036] 所述的緩沖液A1 成分為：400mM 25°C、pH 7.8的Tris-HCl，100mM MgCl2，100mM DTT,10mM ATP,4mM dNTP；
[0037] 所述的酶A2為:T4DNA聚合酶、Klenow酶或T4多聚核苷酸激酶；
[0038] 所述的緩沖液B1 成分為：500mM NaCl，100mM MgCl2，10mM DTT，100mM 25°C、pH 7.^9Tris-HCl;
[0039] 所述的酶B2為:Klenow片段。
[0040] 所述的標(biāo)記和檢測的具體步驟如下：
[0041 ] 1)取22ul純化好的cfDNA預(yù)處理產(chǎn)物，加入25ul緩沖液Cl、2ul標(biāo)記分子寡核苷酸 和lul酶C2，在PCR儀器上按照如下程序進(jìn)行溫浴： 「00421
[0043] 2)在上述反應(yīng)產(chǎn)物中加入50ul緩沖液D、lul寡核苷酸Dl、lul寡核苷酸D2和lul酶 D3，在PCR儀器上按照如下程序進(jìn)行溫浴：
[0044]
[0045] 3)使用磁珠或硅基質(zhì)純化柱純化前步的產(chǎn)物；
[0046] 4)按照NGS測序平臺要求，進(jìn)行上機(jī)前處理，使用寡核苷酸E進(jìn)行測序，
[0047] 其中，
[0048] 所述的緩沖液C1成分為：100mM 25°C、pH 7.5的Tris-HCl，20mM MgCl2,2mM ATP， 20mM DTT；
[0049] 所述的酶C2為:T4DNA鏈接酶；
[0050] 所述的緩沖液D成分為：200mM 25°C、pH 8.5的Tris-HCl，luM KCl，3mM MgCl2;
[00511所述的酶D3為:高保真DNA聚合酶。
[0052] 本發(fā)明的血漿游離DNA雙分子標(biāo)記通過給每一個血漿游離DNA分子加上一個唯一 的分子標(biāo)記，區(qū)分各個血漿游離DNA分子，可應(yīng)用于血漿游離DNA檢測。
[0053]本發(fā)明的血漿游離DNA雙分子標(biāo)記，避免了現(xiàn)有NGS技術(shù)檢測cfDNA的缺陷，具體來 說，包括如下技術(shù)效果：
[0054] 1)增加了建庫過程cfDNA有效數(shù)據(jù)量；
[0055] 2)降低了檢測中間步驟產(chǎn)生的噪音信號(例如偏差和檢測錯誤）；
[0056] 2)能有效檢測出目標(biāo)變異，同時具有很低的假陽性率，提高了基因檢測的準(zhǔn)確性 和穩(wěn)定性。
【附圖說明】
[0057]圖1為傳統(tǒng)方法和本發(fā)明方法構(gòu)建的NGS測序文庫膠圖。
[0058]圖2為傳統(tǒng)方法和本發(fā)明方法檢測樣品中變異cfDNA的比例。
【具體實施方式】
[0059]本發(fā)明中，所涉及的成分如下：
[0060] 1)緩沖液A1 成分為：400mM 25°C、pH 7.8的Tris-HCl，100mM MgCl2，100mM DTT， 10mM ATP,4mM dNTP；
[0061 ] 2)酶A2為:T4DNA聚合酶、Klenow酶或T4多聚核苷酸激酶；
[0062] 3)緩沖液B1 成分為：500mM NaCl，100mM MgCl2，10mM DTT，100mM 25°C、pH 7.9的 Tris-HCl；
[0063] 4)酶 B2 為：Klenow 片段。
[0064] 5)雙分子標(biāo)記寡核苷酸序列:寡核苷酸排列從左到右為5'端到3'端，N代表隨機(jī)堿 基，P代表磷酸基團(tuán);寡核苷酸序列通過人工合成。
[0065] 5 ' P-GACGTC-GATCGGAAGAGCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG
[0066] 5 ' ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-GACGTCT
[0067] 6)緩沖液C1 成分為：100mM 25°C、pH 7.5的Tris-HCl，20mM MgCh，2mM ATP，20mM DTT；
[0068] 7)酶C2 為：T4DNA 鏈接酶；
[0069] 8)緩沖液D成分為：200mM 25°C、pH 8.5的Tris-HCl，luM KCl，3mM MgCl2;
[0070] 9)酶D3為:高保真DNA聚合酶。
[0071] 10)寡核苷酸引物D1和D2:寡核苷酸排列從左到右為5 '端到3 '端;寡核苷酸序列通 過人工合成。
[0072] D1 5 ' AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT
[0073] D2 5'CAAGCAGAAGACGGCATACGAGCTCTTCCGATCT
[0074] 11)寡核苷酸E:寡核苷酸排列從左到右為5'端到3'端;寡核苷酸序列通過人工合 成。