一種工業(yè)化高產(chǎn)快速生產(chǎn)黃桿菌的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵領(lǐng)域，具體涉及一種工業(yè)化高產(chǎn)快速生產(chǎn)黃桿菌的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]微生物能以有機污染物為唯一碳源和能源或者與其他有機物質(zhì)進行共代謝而降解有機污染物。利用微生物降解作用發(fā)展的微生物修復(fù)技術(shù)是農(nóng)田土壤污染修復(fù)中常見的一種修復(fù)技術(shù)，這種生物修復(fù)技術(shù)已在農(nóng)藥或石油污染土壤中得到應(yīng)用。在中國，已構(gòu)建了農(nóng)藥高效降解菌篩選技術(shù)、微生物修復(fù)劑制備技術(shù)和農(nóng)藥殘留微生物降解田間應(yīng)用技術(shù)；并且已經(jīng)分離到能將多環(huán)芳烴(PAHs)作為唯一碳源的微生物，如假單胞菌屬、黃桿菌等。特別是黃桿菌(Flavobacterium mizutaii)是一種優(yōu)良的改善農(nóng)田土壤及環(huán)境修復(fù)微生物制劑，但是常規(guī)的發(fā)酵方法僅限于實驗室階段，在工業(yè)生產(chǎn)中無法獲得細胞數(shù)量多，活性好的黃桿菌。
[0003]因此，急需一種工業(yè)化高產(chǎn)快速生產(chǎn)黃桿菌的方法，該方法簡單，發(fā)酵周期短，能在較短時間內(nèi)獲得細胞總數(shù)達100-200億/ml的黃桿菌。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種工業(yè)化高產(chǎn)快速生產(chǎn)黃桿菌的方法，工藝方法簡單，能夠在較短時間內(nèi)獲得出罐液細胞總數(shù)大，活細胞率高的菌液。
[0005]為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案:
[0006]—種工業(yè)化高產(chǎn)快速生產(chǎn)黃桿菌的方法，包括如下步驟:
[0007](1)菌種培養(yǎng):將黃桿菌(Flavobacterium mizutaii)菌株接種至含糖量2?6%的培養(yǎng)液中，然后在溫度為28?37°C條件下培養(yǎng)至細胞數(shù)為20?60億/ml，得種子培養(yǎng)液；
[0008](2)發(fā)酵罐種子培養(yǎng):將步驟(1)所得種子培養(yǎng)液接種至培養(yǎng)液含糖量為2?6%的發(fā)酵罐中，按通氣量為6?14m3/h通入無菌空氣，在溫度為28?37°C條件下培養(yǎng)至細胞數(shù)為40?80億/ml，得發(fā)酵罐種子培養(yǎng)液；
[0009](3)將步驟(2)所得發(fā)酵罐種子培養(yǎng)液接種至培養(yǎng)液含糖量為4?10%的發(fā)酵罐中，先按通氣量為16?28m3/h通入無菌空氣，在溫度為28?37°C條件下發(fā)酵6?8小時后，按通氣量為28?50m3/h通入無菌空氣，繼續(xù)發(fā)酵至細胞數(shù)為100-200億/ml，得黃桿菌菌液。
[0010]優(yōu)選的，所述步驟(1)為將黃桿菌按8?12%接種量接種至含糖量3?6%的培養(yǎng)液中，然后在溫度為30?35°C、pH為7-7.5條件下培養(yǎng)至細胞數(shù)為20?80億/ml，得種子培養(yǎng)液;更優(yōu)選的，所述pH為7.0。
[0011 ]優(yōu)選的，步驟(2)中，所述種子培養(yǎng)液按體積比為1:40接種至種子發(fā)酵罐中。
[0012]本發(fā)明中，所述培養(yǎng)液含有氮源、磷源、硫酸鎂和碳酸鈣，各組分質(zhì)量百分比如下:氮源5-8 %，磷源 0.1-0.2%,硫酸鎂 0.1-0.2%,碳酸鈣 0.1-0.5%。
[0013]優(yōu)選的，所述氮源為牛肉湯，蛋白胨，玉米汁，硫酸銨，碳酸氫銨，氨水，尿素，硝酸鉀，硝酸鈉，硝酸銨，磷酸銨，磷酸氫銨或磷酸氫二銨中的一種或幾種;所述磷源為磷酸，磷酸銨，磷酸氫銨，磷酸氫二銨，磷酸二氫鉀，磷酸氫二鉀中的一種或幾種。
[0014]更優(yōu)選的，所述牛肉湯的制備方法如下:將牛肉用蒸汽水煮沸30min，然后過濾得牛肉湯;所述玉米液由以下方法制備:將玉米漿干粉用蒸汽水煮沸，過濾得玉米漿液。
[0015]最優(yōu)選的，所述培養(yǎng)液的加入方式為氮源，碳源，磷源，硫酸鎂，碳酸鈣隨種子發(fā)酵罐培養(yǎng)液加入。
[0016]本發(fā)明的有益效果在于:本發(fā)明公開的一種工業(yè)化快速發(fā)酵生產(chǎn)黃桿菌的方法，發(fā)酵周期短，成本低，并且出灌的黃桿菌細胞總數(shù)達100-200億/ml，明顯優(yōu)于現(xiàn)有發(fā)酵方法。
【具體實施方式】
[0017]下面將對本發(fā)明的優(yōu)選實施例進行詳細的描述。實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件或按照制造廠商所建議的條件。
[0018]本發(fā)明中黃桿菌(Flavobacterium mizutaii)來源于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所，公開網(wǎng)址為:http: //www.accc.0rg.cn/search/accc/show, asp? jzbc =03071;保藏編號為 ACCC03071。
[0019]實施例1
[0020]—種工業(yè)化高產(chǎn)快速生產(chǎn)黃桿菌的方法，包括如下步驟:
[0021 ] (1)菌種培養(yǎng):將黃桿菌(Flavobacterium mizutaii)按8%接種量接種至含糖量6%的培養(yǎng)液中，然后在溫度為35°C、初始pH為7.0條件下培養(yǎng)至細胞數(shù)為40億/ml，得種子培養(yǎng)液；
[0022](2)發(fā)酵罐種子培養(yǎng):將步驟(1)所得種子培養(yǎng)液按體積比為1:40接種至含糖量為2%的培養(yǎng)液中，按通氣量為8m3/h通入無菌空氣，在溫度為35°C條件下培養(yǎng)至細胞數(shù)為50億/ml，得發(fā)酵罐種子培養(yǎng)液；
[0023](3)將步驟(2)所得發(fā)酵罐種子培養(yǎng)液接種含糖量為5%培養(yǎng)液的發(fā)酵罐中，先按通氣量為24m3/h通入無菌空氣，在溫度為35°C條件下發(fā)酵7小時后，按通氣量為32m3/h通入無菌空氣，繼續(xù)發(fā)酵至細胞數(shù)在100?200億/ml則發(fā)酵完畢，出罐。
[0024]出灌后檢測出罐液，涂平板確定活細胞數(shù);結(jié)果顯示，使用本發(fā)明的方法發(fā)酵黃桿菌出罐數(shù)為120億/ml。
[0025]本實施例中，黃桿菌(Flavobacterium mizutaii)由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所提供，并由本公司保存。上述培養(yǎng)液還包括有氮源5%，磷源0.1%，硫酸鎂0.1%，碳酸鈣0.1%。氮源選自牛肉湯，蛋白胨，玉米汁，硫酸銨，碳酸氫銨，尿素，硝酸鉀，硝酸鈉，硝酸銨中的至少一種;磷源選自磷酸，磷酸銨，磷酸氫銨，磷酸氫二銨，磷酸二氫鉀，磷酸氫二鉀中的一種或幾種。其中牛肉湯的制備方法如下將牛肉切碎用蒸汽水煮沸30min，然后過濾得牛肉湯;所述玉米液由以下方法制備:將玉米漿干粉用蒸汽水煮沸，過濾得玉米漿液。
[0026]實施例2
[0027]—種工業(yè)化高產(chǎn)快速生產(chǎn)黃桿菌的方法，包括如下步驟:
[0028](1)菌種培養(yǎng):將黃桿菌(Flavobacterium mizutaii)按10%接種量接種至含糖量3%的培養(yǎng)液中，然后在溫度為30°C、初始pH為7.0條件下培養(yǎng)至細胞數(shù)為45億/ml，得種子培養(yǎng)液；
[0029](2)發(fā)酵罐種子培養(yǎng):將步驟(1)所得種子培養(yǎng)液按體積比為1:40接種至含糖量為4%的培養(yǎng)液中，按通氣量為10m3/h通入無菌空氣，在溫度為35°C條件下培養(yǎng)至細胞數(shù)為60億/ml，得發(fā)酵罐種子培養(yǎng)液；
[0030](3)將步驟(2)所得發(fā)酵罐種子培養(yǎng)液接種含糖量為6%培養(yǎng)液的發(fā)酵罐中，先按通氣量為26m3/h通入無菌空氣，在溫度為35°C條件下發(fā)酵8小時后，按通氣量為40m3/h通入無菌空氣，繼續(xù)發(fā)酵至細胞數(shù)在100?200億/ml則發(fā)酵完畢。出罐出灌后檢測出罐液，涂平板確定活細胞數(shù);結(jié)果顯示，使用本發(fā)明的方法發(fā)酵黃桿菌出罐數(shù)為150億/ml。
[0031 ] 本實施例中，黃桿菌(Flavobacterium mizutaii)由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所提供，并由本公司保存。上述培養(yǎng)液還包括有氮源6%，磷源0.15%，硫酸鎂
0.1%，碳酸鈣0.2%。氮源選自牛肉湯，蛋白胨，玉米汁，硫酸銨，碳酸氫銨，尿素，硝酸鉀，硝酸鈉，硝酸銨中的至少一種;磷源選自磷酸，磷酸銨，