一種羧甲基化龍眼肉多糖及其在制藥中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種羧甲基化龍眼肉多糖及其在制藥中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 分子修飾是運(yùn)用物理、化學(xué)、生物等方法對(duì)化合物分子進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造，以獲得不同 結(jié)構(gòu)類型衍生物的方法。對(duì)多糖進(jìn)行分子修飾，可以使多糖的相對(duì)分子質(zhì)量、黏度、水溶解 度、電荷數(shù)、空間構(gòu)象等發(fā)生改變，增強(qiáng)天然多糖的生物活性甚至使多糖產(chǎn)生新的活性，還 可降低多糖類藥物的毒副作用，從而有利于多糖類藥物的開發(fā)與應(yīng)用。羧甲基化修飾是向 多糖鏈上引入羧甲基，羧甲基化多糖可提高多糖的溶解性和電負(fù)性，并對(duì)其抗腫瘤活性有 很大的提高，且能增強(qiáng)甚至產(chǎn)生新的生物活性。例如，黑木耳多糖經(jīng)適當(dāng)羧甲基化修飾后可 使其抗氧化活性提高將近一倍;對(duì)虎奶多糖進(jìn)行羧甲基化修飾，得到一種水溶性良好的羧 甲基化虎奶多糖，它能有效抑制Fe 2+-Vc引起的大鼠肝線粒體脂質(zhì)過氧化、膜流動(dòng)性的降低 和線粒體的腫脹;孔石莼多糖經(jīng)羧甲基化修飾后，其降血脂作用得到顯著增強(qiáng);將黃芪多糖 進(jìn)行羧甲基化改性后，其促生長(zhǎng)和增強(qiáng)免疫活性均非常明顯。因此，非常有必要對(duì)龍眼肉多 糖進(jìn)行羧甲基化修飾，為探索結(jié)構(gòu)修飾對(duì)龍眼肉多糖生物活性的影響，通過分子修飾技術(shù) 提高和開發(fā)龍眼肉多糖的生物功效奠定基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的是提供羧甲基化龍眼肉多糖的合成方法，并獲得羧甲基化龍眼肉多 糖抗氧化作用和體內(nèi)調(diào)節(jié)免疫作用的結(jié)果。
[0004] 本發(fā)明通過以下技術(shù)方案達(dá)到上述目的：
[0005] -種羧甲基化龍眼肉多糖，由以下方法合成:將龍眼肉多糖溶于氫氧化鈉溶液中， 加入一氯乙酸的同時(shí)攪拌反應(yīng)，再將反應(yīng)液進(jìn)行透析濃縮、醇沉和冷凍干燥后得到羧甲基 化龍眼肉多糖。
[0006] 所述的羧甲基化龍眼肉多糖的合成方法具體為:將龍眼肉多糖溶于3mol/L氫氧化 鈉溶液中，劇烈攪拌下緩慢加入一氯乙酸，使其終濃度為1.2mol/L;混勻后在73°C下繼續(xù)攪 拌反應(yīng)3.2h后，冷卻，用HC1溶液調(diào)節(jié)pH值至中性;將反應(yīng)液置于截留分子量為3500的透析 袋中透析48h，透析液經(jīng)濃縮，醇沉和冷凍干燥后得到羧甲基化龍眼肉多糖。
[0007] 本發(fā)明還要求保護(hù)所述的羧甲基化龍眼肉多糖在制藥中的應(yīng)用。
[0008] 進(jìn)一步地，羧甲基化龍眼肉多糖在制備藥物中的應(yīng)用包括以下7個(gè)方面：
[0009] (1)羧甲基化龍眼肉多糖在制備抗氧化或免疫調(diào)節(jié)藥物中的應(yīng)用。
[0010] (2)羧甲基化龍眼肉多糖在制備清除自由基藥物中的應(yīng)用，羧甲基化龍眼肉多糖 有效濃度為2~12mg/ml。
[0011] (3)羧甲基化龍眼肉多糖在制備抗脂質(zhì)過氧化藥物的應(yīng)用，羧甲基化龍眼肉多糖 有效濃度為〇 · 25~4 · 00g/L。
[0012] ⑷羧甲基化龍眼肉多糖在制備抑制紅細(xì)胞溶血藥物的應(yīng)用，羧甲基化龍眼肉多 糖有效濃度為28.60~457. lμg/ml。
[0013] (5)羧甲基化龍眼肉多糖在制備提高T淋巴細(xì)胞免疫水平藥物中的應(yīng)用，羧甲基化 龍眼肉多糖有效濃度為20~160mg/kg。
[0014] (6)羧甲基化龍眼肉多糖在制備提高體液免疫功能藥物中的應(yīng)用，羧甲基化龍眼 肉多糖有效濃度為40~160mg/kg。
[0015] (7)羧甲基化龍眼肉多糖在制備增強(qiáng)非特異性免疫功能藥物中的應(yīng)用，羧甲基化 龍眼肉多糖有效濃度為20~160mg/kg。
[0016] 本發(fā)明的有益效果在于：
[0017] 將人工合成的羧甲基化龍眼肉多糖用于體外抗氧化和體內(nèi)免疫活性實(shí)驗(yàn)，獲得羧 甲基化龍眼肉多糖免疫調(diào)節(jié)作用及抗氧化作用的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，為羧甲基化龍眼肉多糖在醫(yī)藥 領(lǐng)域的應(yīng)用提供參考依據(jù)。
【附圖說明】
[0018] 圖1為實(shí)施例所述的龍眼肉多糖羧甲基化修飾前后紅外光譜分析圖，其中A線代表 龍眼肉多糖A，B線代表羧甲基化龍眼肉多糖A。
[0019] 圖2為實(shí)施例所述的超氧陰離子自由基清除實(shí)驗(yàn)結(jié)果示意圖。
[0020] 圖3為實(shí)施例所述的龍眼肉多糖A和羧甲基化龍眼肉多糖A對(duì)小鼠脾臟指數(shù)的影響 結(jié)果示意圖。（其中，n = 10/p〈0.05或#p〈0.01vS環(huán)磷酰胺組）
[0021] 圖4為實(shí)施例所述的龍眼肉多糖A和羧甲基化龍眼肉多糖A對(duì)小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng) 的影響結(jié)果示意圖。（其中，n = 10/p〈0.05或#p〈0.01vS環(huán)磷酰胺組）
[0022] 圖5為實(shí)施例所述的龍眼肉多糖A和羧甲基化龍眼肉多糖A對(duì)小鼠血清中溶血素 (HC5Q)的影響結(jié)果示意圖。（其中，n=10，*p〈0.05或、〈O.Olvs環(huán)磷酰胺組）
[0023] 圖6為實(shí)施例所述的龍眼肉多糖A和羧甲基化龍眼肉多糖A對(duì)小鼠脾臟中LZM的影 響結(jié)果示意圖。（其中，n = 10/p〈0.05或#p〈0.01vS環(huán)磷酰胺組）
[0024]圖7為實(shí)施例所述的龍眼肉多糖A和羧甲基化龍眼肉多糖A對(duì)小鼠血清中LZM的影 響結(jié)果示意圖。（n = 10，$〈0.05或#p〈0.01 vs環(huán)磷酰胺組）
【具體實(shí)施方式】
[0025]以下通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步說明。
[0026] 1、龍眼肉多糖A的制備
[0027]龍眼干果剝殼去核后，稱取1.5kg龍眼肉于4倍量水中，控制水浴溫度為90°C，每次 提取4h，提取次數(shù)3次。濾液濃縮后醇沉，干燥得龍眼肉粗多糖。龍眼肉粗多糖經(jīng)脫蛋白、脫 色處理后得到龍眼肉精制多糖。DEAE-纖維素柱(2.5cmX80cm)分級(jí)純化龍眼肉精制多糖， 依次用水，〇.125mol/L NaCl，0.30mol/L NaOH溶液進(jìn)行洗脫，選取NaCl流分，用 36口1^〇巧13-300冊(cè)柱(2.0〇111\40〇11)作進(jìn)一步純化，用水洗脫(48/滴），收集最大富集峰濃 縮后冷凍干燥，即得龍眼肉多糖A。
[0028] 2、龍眼肉多糖A羧甲基化修飾
[0029] 準(zhǔn)確稱取0.2000g龍眼肉多糖A樣品，溶于10ml 3mol/L氫氧化鈉溶液中，劇烈攪拌 下緩慢加入一氯乙酸，使其終濃度為1.2mol/L?；靹蚝笤?3°C下繼續(xù)攪拌反應(yīng)3.2h后，冷 卻，用2.0mol/L的HC1調(diào)至中性。將反應(yīng)液置于截留分子量為3500的透析袋中透析48h，透析 液經(jīng)濃縮，醇沉和冷凍干燥后得到羧甲基化龍眼肉多糖A。
[0030] 3、龍眼肉多糖羧甲基化前后紅外光譜分析
[0031]干燥的羧甲基化龍眼肉多糖A lmg與100mg KBr粉末于瑪瑙研缽研磨均勾，壓成薄 片，放入樣品室，以龍眼肉多糖A為對(duì)照，于傅里葉紅外變換光譜儀在4000~400CHT1范圍內(nèi) 進(jìn)行掃描得到紅外吸收光譜圖。
[0032]由圖1可知，3600-32000^1區(qū)域的吸收峰為糖的特征吸收峰，是由羥基0-H的伸縮 振動(dòng)引起的，表明存在分子間和分子內(nèi)氫鍵。3000-2800(31^1區(qū)域的吸收峰也為糖的特征吸 收峰，是由次甲基C-H的伸縮振動(dòng)引起，表明有-CH 2基存在。譜圖B在1603、1420、1326〇1^處 出現(xiàn)了C00-的特征吸收峰，其中，1603CHT 1處吸收峰為強(qiáng)峰，是C-0鍵非對(duì)稱伸縮振動(dòng)；在 1420、1326〇1^處兩個(gè)峰為中強(qiáng)峰，分別為-CH-的變角振動(dòng)和-C00的對(duì)稱伸縮振動(dòng)峰。證明 了龍眼肉多糖A確實(shí)已羧甲基化。羧甲基化后龍眼肉多糖A的其他特征吸收峰并無大的改 變，這是對(duì)羧甲基化修飾沒有改變龍眼肉多糖A結(jié)構(gòu)的佐證。
[0033] 4、羧甲基化龍眼肉多糖A相對(duì)分子量的測(cè)定
[0034]相對(duì)分子量的測(cè)定采用葡聚糖凝膠過濾法。SephadexG-100凝膠柱填裝完畢后，平 衡24h，將藍(lán)色葡聚糖2000配制3mg/ml的溶液，上樣計(jì)算洗脫體積Vo，將葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品T-10、 T-40、T-70、T-500 (分子量分別為 lOKDa、40KDa、70KDa、500KDa)配制成濃度 3mg/ml 的溶液， 分