急性心肌梗死早期診斷標(biāo)志物的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子診斷領(lǐng)域，涉及一種用于急性心肌梗死診斷的分子標(biāo)志物，具體 涉及血液中的分子標(biāo)志物-DSG3基因在制備診斷急性心肌梗死的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI)是冠狀動脈急性、持續(xù)性缺 血缺氧所引起的心肌壞死。臨床上多有劇烈而持久的胸骨后疼痛，休息及硝酸酯類藥物不 能完全緩解，伴有血清心肌酶活性增高及進(jìn)行性心電圖變化，可并發(fā)心律失常、休克或心力 衰竭，常可危及生命。本病在歐美最常見，美國每年約有150萬人發(fā)生心肌梗死。中國近年 來呈明顯上升趨勢，每年新發(fā)至少50萬，現(xiàn)患至少200萬。
[0003] 現(xiàn)有技術(shù)中用于診斷急性心肌梗死的方法包括：（1)心電圖特征性改變?yōu)樾鲁霈F(xiàn) Q波及ST段抬高和ST-T動態(tài)演變；（2)心肌壞死血清生物標(biāo)志物升高，肌酸激酶同工酶 (CK-MB)及肌鈣蛋白（T或I)升高。可于發(fā)病3~6小時(shí)開始增高，CK-MB于3~4d恢復(fù) 正常，肌鈣蛋白于11~14天恢復(fù)正常；（3)其他，白細(xì)胞數(shù)增多，中性粒細(xì)胞數(shù)增多，嗜酸 性粒細(xì)胞數(shù)減少或消失，血沉加快，血清肌凝蛋白輕鏈增高。關(guān)于心電圖特征性改變的診斷 方法，由于國內(nèi)，國外缺乏較大樣本的臨床對照研究，目前各個(gè)權(quán)威機(jī)構(gòu)推薦的AMI的心電 圖診斷標(biāo)準(zhǔn)的靈敏度和特異性尚不清楚，沒有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，限制了其應(yīng)用。用于診斷急性心肌 梗死的血清蛋白標(biāo)志物經(jīng)常聯(lián)合使用，因?yàn)樵贏MI的早期，特別是在梗塞發(fā)生后的最初幾 個(gè)小時(shí)，當(dāng)心肌酶尚未升高而心電圖又不典型時(shí)，肌鈣蛋白I(cTnl)、肌紅蛋白（Mb)、心肌 酶譜的聯(lián)合檢測具有重要意義。因此一個(gè)血清蛋白標(biāo)志物的檢測特異性、準(zhǔn)確性均不盡人 意。而通過白細(xì)胞數(shù)等免疫細(xì)胞的檢測來診斷急性心肌梗死不能體現(xiàn)早期診斷的理念。基 于現(xiàn)有技術(shù)中檢測急性心肌梗死的手段的局限性，尋找一種特異性和靈敏性高的用于急性 心肌梗死早期診斷的方法是亟待解決的問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為了彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種可用于急性心肌梗死早期 診斷的分子標(biāo)志物。相比傳統(tǒng)的急性心肌梗死的診斷方法，使用基因標(biāo)志物來診斷急性心 肌梗死的具有及時(shí)性、特異性和靈敏性的特點(diǎn)，從而使患者在疾病早期就能知曉疾病風(fēng)險(xiǎn)， 針對風(fēng)險(xiǎn)高低，采取相應(yīng)的預(yù)防和治療措施。
[0005] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0006] 本發(fā)明提供了檢測DSG3基因表達(dá)的產(chǎn)品在制備診斷急性心肌梗死的工具中的應(yīng) 用。
[0007] 進(jìn)一步，上面所提到的檢測DSG3基因表達(dá)的產(chǎn)品包括：通過RT-PCR、實(shí)時(shí)定量 PCR、免疫檢測、原位雜交、芯片或高通量測序平臺檢測DSG3基因表達(dá)水平以診斷急性心肌 梗死的產(chǎn)品。
[0008] 進(jìn)一步，所述用RT-PCR診斷急性心肌梗死的產(chǎn)品至少包括一對特異擴(kuò)增DSG3基 因的引物；所述用實(shí)時(shí)定量PCR診斷急性心肌梗死的產(chǎn)品至少包括一對特異擴(kuò)增DSG3基因 的引物；所述用免疫檢測診斷急性心肌梗死的產(chǎn)品包括：與DSG3蛋白特異性結(jié)合的抗體； 所述用原位雜交診斷急性心肌梗死的產(chǎn)品包括：與DSG3基因的核酸序列雜交的探針；所述 用芯片診斷急性心肌梗死的產(chǎn)品包括：蛋白芯片和基因芯片；其中，蛋白芯片包括與DSG3 蛋白特異性結(jié)合的抗體，基因芯片包括與DSG3基因的核酸序列雜交的探針。
[0009] 在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，所述用實(shí)時(shí)定量PCR診斷急性心肌梗死的產(chǎn)品至少 包括一對特異擴(kuò)增DSG3基因的引物的序列如SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 4所示。
[0010] 優(yōu)選地，所述診斷工具包括芯片、試劑盒、試紙、高通量測序平臺、診斷數(shù)據(jù)庫。其 中，高通量測序平臺是一種特殊的診斷工具，檢測DSG3基因表達(dá)的產(chǎn)品可以應(yīng)用于該平臺 實(shí)現(xiàn)對DSG3基因的表達(dá)情況的檢測。隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，對一個(gè)人的基因表達(dá)譜 的構(gòu)建將成為十分便捷的工作。通過對比疾病患者和正常人群的基因表達(dá)譜，容易分析出 哪個(gè)基因的異常與疾病相關(guān)。因此，在高通量測序中獲知DSG3基因的異常與急性心肌梗死 相關(guān)也屬于DSG3基因的用途，同樣在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0011] 急性心肌梗死診斷數(shù)據(jù)庫也是一類特殊的診斷工具，這類數(shù)據(jù)庫通過以下方式實(shí) 現(xiàn)疾病的診斷：數(shù)據(jù)庫設(shè)置疾病的入庫標(biāo)準(zhǔn)，當(dāng)輸入病例的基因組信息、轉(zhuǎn)錄組信息等遺傳 信息時(shí)，用入庫標(biāo)準(zhǔn)對病例的遺傳信息進(jìn)行篩選分析，這個(gè)入庫標(biāo)準(zhǔn)就是與正常組相比，病 例的DSG3基因表達(dá)明顯升高，則允許該病例進(jìn)入到該數(shù)據(jù)庫中。通過以上方法實(shí)現(xiàn)急性心 肌梗死診斷的數(shù)據(jù)庫也在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0012] 本發(fā)明還提供了一種診斷急性心肌梗死的工具，所述診斷工具包括芯片、試劑盒、 試紙、高通量測序平臺或診斷數(shù)據(jù)庫。
[0013] 其中，所述芯片包括基因芯片、蛋白質(zhì)芯片；所述基因芯片包括固相載體以及固定 在固相載體的寡核苷酸探針，所述寡核苷酸探針包括用于檢測DSG3基因轉(zhuǎn)錄水平的針對 DSG3基因的寡核苷酸探針；所述蛋白質(zhì)芯片包括固相載體以及固定在固相載體的DSG3蛋 白的特異性抗體；所述基因芯片可用于檢測包括DSG3基因在內(nèi)的多個(gè)基因（例如，與急性 心肌梗死相關(guān)的多個(gè)基因）的表達(dá)水平。所述蛋白質(zhì)芯片可用于檢測包括DSG3蛋白在內(nèi) 的多個(gè)蛋白質(zhì)（例如與急性心肌梗死相關(guān)的多個(gè)蛋白質(zhì)）的表達(dá)水平。通過將多個(gè)與急性 心肌梗死的標(biāo)志物同時(shí)檢測，可大大提高急性心肌梗死診斷的準(zhǔn)確率。
[0014] 其中，所述試劑盒包括基因檢測試劑盒和蛋白免疫檢測試劑盒；所述基因檢測試 劑盒包括用于檢測DSG3基因轉(zhuǎn)錄水平的試劑；所述蛋白免疫檢測試劑盒包括DSG3蛋白的 特異性抗體。進(jìn)一步，所述試劑包括使用RT-PCR、實(shí)時(shí)定量PCR、免疫檢測、原位雜交或芯片 方法檢測DSG3基因表達(dá)水平過程中所需的試劑。優(yōu)選度，所述試劑包括針對DSG3基因的 引物和/或探針。根據(jù)DSG3基因的核苷酸序列信息容易設(shè)計(jì)出可以用于檢測DSG3基因表 達(dá)水平的引物和探針。
[0015] 與DSG3基因的核酸序列雜交的探針可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合體、PNA或其它 衍生物。所述探針的長度沒有限制，只要完成特異性雜交、與目的核苷酸序列特異性結(jié)合， 任何長度都可以。所述探針的長度可短至25、20、15、13或10個(gè)堿基長度。同樣，所述探針 的長度可長至60、80、100、150、300個(gè)堿基對或更長，甚至整個(gè)基因。由于不同的探針長度 對雜交效率、信號特異性有不同的影響，所述探針的長度通常至少是14個(gè)堿基對，最長一 般不超過30個(gè)堿基對，與目的核苷酸序列互補(bǔ)的長度以15-25個(gè)堿基對最佳。所述探針自 身互補(bǔ)序列最好少于4個(gè)堿基對，以免影響雜交效率。
[0016] 所述高通量測序平臺包括檢測DSG3基因表達(dá)水平的試劑。
[0017] 所述試紙包括試紙載體和固定在試紙載體上的寡核苷酸，所述寡核苷酸能夠檢測 DSG3基因的轉(zhuǎn)錄水平。
[0018] 所述診斷數(shù)據(jù)庫是以DSG3基因的異常表達(dá)為入庫標(biāo)準(zhǔn)。所述DSG3基因的異常表 達(dá)為：與正常組相比，病例組的DSG3基因表達(dá)顯著升高，該病例即診斷為急性心肌梗死。
[0019] 進(jìn)一步，所述DSG3蛋白的特異性抗體包括單克隆抗體、多克隆抗體。所述DSG3 蛋白的特異性抗體包括完整的抗體分子、抗體的任何片段或修飾（例如，，嵌合抗體、scFv、 Fab、F(ab'）2、Fv等。只要所述片段能夠保留與DSG3蛋白的結(jié)合能力即可。用于蛋白質(zhì) 水平的抗體的制備時(shí)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，并且本發(fā)明可以使用任何方法來制備所述抗 體。
[0020] 在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，所述針對DSG3基因的引物序列如下：正向引物序列 如SEQ ID NO. 3所示，反向引物如SEQ ID NO. 4所示。
[0021] 用于診斷急性心肌梗死的DSG3基因及其表達(dá)產(chǎn)物的來源包括但不限于血液、組 織液、尿液、唾液、脊髓液等可以獲得基因組DNA的體液。在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，用于 診斷急性心肌梗死的DSG3基因及其表達(dá)產(chǎn)物的來源是血液。
[0022] 在本發(fā)明的上下文中，"DSG3基因"