專利名稱：：一種新型檢測急性心肌梗死變異生物標(biāo)志的試劑盒和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種新的生物樣品中蛋白質(zhì)分析方法，一種通過能與抗體結(jié)合的基質(zhì)去捕獲生物標(biāo)志，并用有定量控制的質(zhì)譜分析來檢測生物標(biāo)志。在此提及的此項(xiàng)發(fā)明涉及急性心肌梗死檢測領(lǐng)域，為一種新的非侵入性的體外檢測方法。更確切地講，此發(fā)明涉及到生物標(biāo)志(biomarkers)，而這些抗原或生物標(biāo)志能被以更高的特異性和靈敏度的抗體組及定量控制的質(zhì)譜將急性心肌梗死疾病一次性區(qū)分出來。本發(fā)明可以應(yīng)用到己經(jīng)脫離人體的體液中的生物標(biāo)志組合的急性心肌梗死檢測方法或試劑盒開發(fā)。
背景技術(shù)：
：隨著人類基因組計(jì)劃的實(shí)施和完成,科學(xué)家們提出了后基因組(post-genome)計(jì)劃的概念，研究要點(diǎn)轉(zhuǎn)移到功能基因組學(xué)上，而生物功能主要體現(xiàn)物質(zhì)是蛋白質(zhì)。1994年，澳大利亞Macquarie大學(xué)的Wilkins和Williams首先提出蛋白質(zhì)組(proteome)的概念，指的是"一種基因組所表達(dá)的全部蛋白質(zhì)"，即包括一種細(xì)胞乃至一種生物所表達(dá)的全部蛋白質(zhì)。對于蛋白質(zhì)組的研究是功能基因組學(xué)研究的核心，稱為蛋白質(zhì)組學(xué)(proteomics)。蛋白質(zhì)組學(xué)被認(rèn)為是后基因組研究中最主要的部分。與基因組相比，蛋白質(zhì)組的組成更復(fù)雜，功能更活躍，應(yīng)用前景更廣泛。蛋白質(zhì)組學(xué)從細(xì)胞整體水平進(jìn)行蛋白質(zhì)屬性的研究，如表達(dá)水平、翻譯后修飾及相互作用等，并由此獲得對于疾病過程、細(xì)胞生理生化特征和調(diào)控M絡(luò)的廣泛完整的認(rèn)識(shí)。所以，蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)正在逐步成為生物學(xué)、醫(yī)學(xué)及制藥學(xué)等的重要研究手段。不論是細(xì)胞的正常功能還是病理特性都在一定程度上取決于細(xì)胞所表達(dá)的蛋白質(zhì)功能。閑此，鑒定人體內(nèi)表達(dá)的蛋白質(zhì)的區(qū)別，可用于體外疾病樣本診斷及篩査，并最終用于藥物開發(fā)和疾病治療。而要進(jìn)行蛋白質(zhì)表達(dá)和功能的差異化分析，要求能夠達(dá)到分辨細(xì)胞內(nèi)分子的復(fù)雜混合物的程度。但細(xì)胞內(nèi)許多物質(zhì)往往以微量存在，R前用于分析蛋白的方法在上述各方面都有局限，用這些常規(guī)手段難以進(jìn)行化學(xué)結(jié)構(gòu)及蛋白質(zhì)序列鑒定分析。用抗體及質(zhì)譜聯(lián)合可克服這一技術(shù)缺點(diǎn)。本發(fā)明用抗體組及質(zhì)譜聯(lián)合可同時(shí)檢測出多種(三種以上)的生物標(biāo)志的方法。如，血庫篩查要求特異性地檢測出常見病毒微生物疾病的已知標(biāo)記。但是，制備特異性結(jié)合標(biāo)記并且能在復(fù)雜的混合物中鑒別出標(biāo)記的試劑需要大量時(shí)間，這阻礙了此類體外診斷試劑盒方法的發(fā)展。目前，還沒有一種方法能夠?qū)⑺姆N以上疾病標(biāo)志物同時(shí)檢出。ELISA(enzyme-linkedimmunosorbentassay)試劑盒等利用抗體可以用于檢測一種疾病標(biāo)志物。利用抗體及三色免疫熒光，最多可以做到檢測三種疾病標(biāo)志物，但三種以上疾病標(biāo)志物就無法同時(shí)檢測。利用抗體組與質(zhì)譜儀聯(lián)合應(yīng)用，即可以觶決同時(shí)鑒別三種以上的病毒或微生物抗原標(biāo)志物。舉例講，將抗HBV(HBsAg)抗體，抗HCV抗體，抗HIVp24antigen(RibasSGetal.Performanceofaquantitativehumani咖unodeficiencyvimstype1p24antigenassayonvariousHIV-lsubtypesforthefollow-upofhumanimmunodeficiencytype1seropositiveindividuals.JVirolMethods2003;113:29-34)及抗梅毒抗體(anti-treponemal17kDaprotein)(GeorgeRetal.Ananalysisofthevalueofsomeantigen-antibodyinteractionsusedasdiagnosticindicatorsinatreponemalWesternblot(TWB)testforsyphilis.JClinLabImmunol1998;50:27-44)等抗體聯(lián)合標(biāo)記至ProteinA或G的支持物(磁性珠子、芯片等)上。由于每種特異體抗體捕獲生物抗原的分子量是不同的，故ProteinA/G-抗體與質(zhì)譜儀聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，質(zhì)譜儀就非常容易地將這四種抗原同時(shí)分開了。由此推理，如果同時(shí)選擇四種以上的抗體，而這四種以上抗體所結(jié)合的抗原分子量是不同的，則本發(fā)明可同時(shí)區(qū)分四種以上不同種類的疾病。本發(fā)明可以檢測窗口期的獻(xiàn)血者，這比單純的ELISA抗體試劑盒更安全(LauDT,etal.ArapidimmunochromatographicassayforhepatitisBvirusscreening.JViralH印at2003:10:331-334)。另外，本發(fā)明的方法可同時(shí)檢測出多種變異的生物標(biāo)志，抗體與質(zhì)譜儀聯(lián)合應(yīng)用是一種高靈敏度、高準(zhǔn)確性的檢測方法，它能從一個(gè)不同成分的混合體系中檢查和區(qū)分不同組分、不同分子量(差別在1或2個(gè)氨基酸之間)的生物標(biāo)志(蛋白質(zhì))。將來，它可能成為臨床上許多疾病檢測的新模式，作為臨床檢査的常規(guī)方法。舉例，區(qū)別胃癌中血清纖維蛋白肽A及變異的纖維蛋白肽A,應(yīng)用以往方法不能確定哪種肽類片段與發(fā)病有關(guān)，現(xiàn)在可以抗體與質(zhì)譜儀聯(lián)合應(yīng)用，將其中這種組分和它們的分子量清晰區(qū)分開來，并找到與該病發(fā)病有關(guān)的特殊組分，這是分子醫(yī)學(xué)的革命。本發(fā)明的方法可同時(shí)檢測出多種修飾生物標(biāo)志。修飾的生物標(biāo)記群指的修飾蛋白質(zhì)為甲基化、乙?；?、羥基化、磷酸化修飾等。在人類腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，過去對腫瘤臨床檢測一直停留在細(xì)胞水平上，因此臨床醫(yī)生長期盼望的真正意義上的早期診斷(如實(shí)體瘤在尚未形成包塊以前，白血病在骨髓細(xì)胞檢査不能確診以前)是不可能實(shí)現(xiàn)的。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是建立一種在生物樣品中檢測正常人與愈性心肌梗死病人在離體血液中生物標(biāo)志的方法。此發(fā)明涉及到生物標(biāo)志(biomarkers)，而這些生物標(biāo)志能被用來以更高的特異性和靈敏度將急性心肌梗死患者同時(shí)區(qū)分出來。該方法為疾病的早期急性心肌梗死檢測提供了新的途徑，并為進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)新的變異的或修飾的生物標(biāo)志提供了基礎(chǔ)。本發(fā)明涉及一種通過標(biāo)記特異性抗體至能與抗體結(jié)合的基質(zhì)表面，并用定量性質(zhì)譜分析來同時(shí)檢測某種疾病的多種生物標(biāo)志或多種疾病狀態(tài)。生物標(biāo)志群可以是不變異的、變異的、修飾的。變異的的生物標(biāo)志群是指變異蛋白質(zhì)為增加或減少一個(gè)或多個(gè)氨基酸。修飾的生物標(biāo)記群是指修飾蛋白質(zhì)為甲基化、乙?；?、羥基化、磷酸化修飾等。本發(fā)明中的生物標(biāo)志是利用一臺(tái)質(zhì)譜儀來發(fā)現(xiàn)的。該設(shè)備的質(zhì)量精確度約為+/-0.1%?；|(zhì)是任何能與抗體選擇性或特異性結(jié)合的物質(zhì)。舉例說明，ProteinA和G基質(zhì)吸附抗體Fc段的功能。具有吸收劑功能的ProteinA和G底基與抗體結(jié)合，抗體結(jié)合血清中生物標(biāo)志。經(jīng)過一段足夠的時(shí)間使生物標(biāo)志能與抗體-ProteinA和G結(jié)合。WCX陰離子，SAX陽離子，C8/C18疏水作用基質(zhì)吸附劑，分離生物化學(xué)中的這些方法和由這些方法產(chǎn)生的吸附劑具有診斷反面的用途(即陰離子吸附劑捕獲陽離子蛋白質(zhì)，配位共價(jià)金屬螯合劑上滯留說明多肽分析物內(nèi)存在組氨酸殘基)。底基洗去未吸附的物質(zhì)。任何適宜的洗液均可使用。生物標(biāo)志首先能夠被具有能與生物標(biāo)志物結(jié)合的抗體-基質(zhì)吸附表面捕獲，非吸附物能從基質(zhì)上洗脫，吸附到底基的生物標(biāo)志物在質(zhì)譜儀中被檢測。生物標(biāo)志通過離子發(fā)生源，如激光，被離子化，產(chǎn)生的離子被一個(gè)離子感受集合器收集，然后質(zhì)量分析器分析那些通過的離子。之后，檢測器將檢測的離子信息轉(zhuǎn)換為質(zhì)荷比。定量性控制及質(zhì)譜激光能量調(diào)控每次測試前，用質(zhì)譜的標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清，將標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清中用于定量的標(biāo)準(zhǔn)峰4091.1Da或6634.0Da強(qiáng)度調(diào)至50%質(zhì)譜信號(hào)強(qiáng)度的最大值。生物標(biāo)志的檢測明顯地將與信號(hào)強(qiáng)度的檢測有關(guān)。這樣，生物標(biāo)志的數(shù)量與質(zhì)量都可以被檢測出來。飛行質(zhì)譜對待分析物的分析生成飛行時(shí)間譜。該飛行時(shí)間譜的最終分析并不表示離子化能量攻擊一個(gè)樣本產(chǎn)生的單獨(dú)的脈沖信號(hào)，而是一系列脈沖的信號(hào)之和。這樣降低了干擾，并增加了動(dòng)態(tài)范圍。該飛行時(shí)間數(shù)據(jù)受數(shù)據(jù)處理軟件的影響。軟件中數(shù)據(jù)處理主要包括轉(zhuǎn)換飛行時(shí)間與質(zhì)荷比而產(chǎn)生質(zhì)譜，降低基線而減少儀器的偏移量，和過濾高頻噪音而減輕高頻噪音。通過對生物標(biāo)志的吸附和檢測而產(chǎn)生的數(shù)據(jù)可利用計(jì)算機(jī)的數(shù)據(jù)分析程序進(jìn)行分析。該計(jì)算機(jī)程序分析這些數(shù)據(jù)以顯示檢測出的生物標(biāo)志的數(shù)量，并顯示信號(hào)的強(qiáng)度和確定被檢測的每個(gè)生物標(biāo)志的分子量。數(shù)據(jù)分析還能包括一系列的確定生物標(biāo)志的信號(hào)強(qiáng)度和矯正數(shù)據(jù)對預(yù)定統(tǒng)計(jì)分布狀態(tài)的偏離。例如，通過計(jì)算與某些參數(shù)相關(guān)的每個(gè)峰值的高度，可規(guī)范觀測到的峰。該參數(shù)可能是由儀器和類似能量吸收分子等化學(xué)成分產(chǎn)生的不重要的千擾，這可以設(shè)置調(diào)零。計(jì)算機(jī)可以將計(jì)算結(jié)果數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成各種形式來表現(xiàn)。其標(biāo)準(zhǔn)譜可以表示，但在一種形式中只有峰高和質(zhì)量信息可以在譜帶中保留，產(chǎn)生一個(gè)較淸晰的圖，并使具有幾乎相同分子量的生物標(biāo)志物更易顯現(xiàn)。在另一種形式中，兩個(gè)或更多的譜比較，便于突顯獨(dú)特的生物標(biāo)志物和那些高于或低于校準(zhǔn)樣本的生物標(biāo)志物。分析一般包括展示從待分析物得到的信號(hào)的圖譜中峰的鑒定。峰可以通過視圖進(jìn)行選擇，軟件是可用的，它可自動(dòng)檢測峰。一般情況下，該軟伴通過鑒定信號(hào)具有信噪比高于一個(gè)選擇閾值并標(biāo)記出在峰信號(hào)的質(zhì)心處的峰的質(zhì)量這樣的方式操作。在一個(gè)有效的程序中，比較許多譜線以認(rèn)定出現(xiàn)在質(zhì)譜中某一選定范圍內(nèi)同樣的一些峰。該軟件的一個(gè)版本聚集所有出現(xiàn)在確定的質(zhì)量范圍內(nèi)的各條光譜的峰，對所有在質(zhì)量(質(zhì)荷比)中值附近的峰指定一個(gè)質(zhì)量(質(zhì)荷比)簇。發(fā)明中使用的生物標(biāo)志是被抗體所捕。這些生物標(biāo)記是進(jìn)一步通過質(zhì)譜(massspectrometry)測定其不同分子量來知道它們特定的身份。對生物標(biāo)志的檢測需要將一個(gè)樣本放基質(zhì)的一個(gè)吸附點(diǎn)上，接著進(jìn)行清洗。電噴霧電離質(zhì)譜(electrosprayionizsationmassspectrometry,ESI-MS)是在毛細(xì)管的出d處施加一高電壓，所產(chǎn)生的高電場使從毛細(xì)管流出的液體霧化成細(xì)小的帶電液滴，隨著溶劑蒸發(fā)，液滴表面的電荷強(qiáng)度逐漸增大，最后液滴崩解為大量帶一個(gè)或多個(gè)電荷的離子，致使分析物以單電荷或多電荷離子的形式進(jìn)入氣相?；|(zhì)輔助激光解析/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(matrix-assistedlaserdesorption/ionizationtimeoffightmassspectrometry,MALDI-TOF-MS)的基本原理是向吸附點(diǎn)上加入SINAPINIC酸等并讓其千燥，將分析物分散在分子中并形成晶體，當(dāng)用激光照射晶體時(shí)，由于基質(zhì)分子經(jīng)輻射所吸收的能量，導(dǎo)致能量蓄積并迅速產(chǎn)熱，從而使基質(zhì)晶體升華，致使連同分析物一起進(jìn)入氣相。而后，用質(zhì)譜測定法對基質(zhì)進(jìn)行分析，而一個(gè)顯示了蛋白質(zhì)分子的遺留物圖將生成，這張圖是在蛋白質(zhì)分子的質(zhì)量-電荷比的基礎(chǔ)上，以彼此分開的峰圖的形式顯示出來的。閑為本項(xiàng)發(fā)明中的生物標(biāo)志是通過質(zhì)譜和抗體基質(zhì)來標(biāo)識(shí)的，丙而它們可通過質(zhì)譜測定法進(jìn)行檢測而直接知道它們特定的身份。這種方法比抗體為基礎(chǔ)的ELISA及免疫熒光法更準(zhǔn)確。實(shí)施例2急性心肌梗死中血清生物標(biāo)志的排序鑒定，査已知基因組或cDNA庫數(shù)據(jù)庫中的正常纖維蛋白肽A分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)(從N端至C端排列16個(gè)氨基酸，分子量為1536.7Da):N端Ala-Asp-Ser-Gly-Glu-Gly-Asp-Phe-Leu-Ala-Glu"Gly-Gly-Gly-Val-ArgC端纖維蛋白肽A的抗體與質(zhì)譜儀聯(lián)合應(yīng)用發(fā)現(xiàn)分子量為1465土1Da變異的纖維蛋白肽A。則化學(xué)結(jié)構(gòu)及分子量可以(從N端至C端)排列為15個(gè)氨基酸N端Asp-Ser-Gly-Glu-Gly-Asp-Phe-Leu-Ala-Glu-Gly-Gly-Gly-Val-ArgC端?？贵w為基礎(chǔ)的ELISA及免疫熒光法則無法區(qū)別急性心肌梗死中血清纖維蛋白肽A及變異的纖維蛋白肽A。然而，如果有必要，這些生物標(biāo)志也可通過，比如，確定多肽的氨基酸序列來進(jìn)行鑒別。在蛋白質(zhì)化學(xué)及蛋白質(zhì)組學(xué)研究中，為了增加蛋白質(zhì)鑒定的可信度，獲得一段蛋白質(zhì)肽片段內(nèi)部序列信息通常是非常重要的。對于蛋白質(zhì)及多肽的序列測定，傳統(tǒng)的方法是采用Edman降解方法，而該方法最大的不足之處在于費(fèi)時(shí)太長(一個(gè)殘基需花費(fèi)30-40分鐘)。近年來，隨著質(zhì)譜技術(shù)的飛速發(fā)展，尤其是多級(jí)質(zhì)譜(MS/MS)以及源后裂解(PSD)等技術(shù)的發(fā)展，應(yīng)用質(zhì)譜測序已成為一種流行的方法。例如，一個(gè)生物標(biāo)志能用許多酶描繪出來，例如V8蛋白酶(V8protease)或胰蛋白酶，而且消化片段(digestionfragments)的分子量可被用來在數(shù)據(jù)庫中搜索序列，這些序列與由多種酶生成的消化片斷的分子量相吻合?；蛘?，如果此生物標(biāo)志不是已知數(shù)據(jù)庫中的蛋白質(zhì)分子，在生物標(biāo)志的N極氨基酸序列(N-terminalAminoAcidSequence)的基礎(chǔ)上，可使用降解探針，而后，這些探針會(huì)被用來描繪由探測到了生物標(biāo)志的樣本所生成的基岡組或cDNA庫。最后，蛋白質(zhì)生物標(biāo)志可用蛋白質(zhì)梯狀排序法(proteinladdersequencing)進(jìn)行排序。通過將分子碎成碎片并將碎片用酶解作用或其他可按順序從碎片末端除去一個(gè)單個(gè)氨基酸分子的方法進(jìn)行處理后，可生成蛋白質(zhì)梯度(proteinladders)。然后，用質(zhì)譜對此梯度進(jìn)行分析。階梯狀碎片(ladderfragments)在質(zhì)量上的差異可鑒別出從分子末端被除去的氨基酸。因此，本發(fā)明可以用于生物標(biāo)志鑒定的金標(biāo)準(zhǔn)。特異性是指某一物質(zhì)或某種疾病的專一屬性，它是代表某種物質(zhì)或某種疾病的特征。通過某些特征可以識(shí)別某種物質(zhì)或某種疾病，從而把它和其他物質(zhì)或疾病區(qū)分開來。對專有特征的識(shí)別往往依賴于特殊的檢測方法，例如要了解某種疾病是否存在有特異性抗原就要用有關(guān)特異性抗體來檢測。自蛋白質(zhì)組學(xué)研究有新發(fā)展以來，這種傳統(tǒng)意義上特異性檢測和界定方法有了很大的突破。如一個(gè)蛋白質(zhì)不同片段變異是不同類型腫瘤的標(biāo)志。根據(jù)基因到蛋白質(zhì)表達(dá)的復(fù)雜過程，一種特異性基因的產(chǎn)物一蛋白質(zhì)必定有相關(guān)多組分蛋白質(zhì)的表達(dá)。通過對這些不同組分的檢測形成一個(gè)綜合模式圖(蛋白指紋質(zhì)譜圖)，將這種圖譜(如某種腫瘤)與其他圖譜(如正常人或其他疾病)相比較，進(jìn)而識(shí)別這種特異蛋白(如抗原或其片段)，從而將正常人與急性心肌梗死病人區(qū)分開來(實(shí)施例1正常人及急性心肌梗死在血液中蛋白指紋差異的發(fā)現(xiàn)及區(qū)分)。本發(fā)明利用WCX陰離子基質(zhì)及利用C8/C18疏水基質(zhì)磁珠對確診為急性心肌梗死患者與正常人血清進(jìn)行蛋白質(zhì)對比分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)血清中質(zhì)荷比，1263.6tlDa、1350.6ilDa、1449.8土lDa、1465.7土lDa、1777.9土lDa、1865.0土lDa、3778.7土10Da、4649.6土15Da、8149.8土15Da、42kDa中的10個(gè)蛋白質(zhì)相對含量有明顯的差異，并且10個(gè)蛋白質(zhì)所組合成的分組標(biāo)準(zhǔn)診斷急性心肌梗死試劑盒的靈敏度為100%，特異性為100%(實(shí)施例1正常人及急性心肌梗死在血液中蛋白指紋差異的發(fā)現(xiàn)及區(qū)分)a鑒別出生物標(biāo)志及其化學(xué)結(jié)構(gòu)為變異的補(bǔ)體C3f及纖維蛋白肽A(從N端至C端排列、分子量)C3ffragment(SSKITHRIHWESASLL,1865.O土lDa)、C3ffragment(SKITHRIHWESASLL,1777.9土lDa)、C3ffragment(THRIHWESASLL,1449.8土lDa)、FPAfragment(DSGpGDFLAEGGGVR,1465.7土lDa)、FPAfragment(SGEGDFLAEGGGVR,1350.6土lDa)、FPAfragment(GEGDFLAEGGGVR,1263.6土lDa)、C3alphachainfragment(42kDa)(實(shí)施例2急性心肌梗死中血清生物標(biāo)志的排序鑒定及實(shí)施例3急性心肌梗死血液中42kDa生物標(biāo)志分子鑒定)?？捎米儺惖难a(bǔ)體C3f、變異的C3alphachain及變異的纖維蛋白肽A生物標(biāo)記制備抗體及試劑盒?？捎米儺惖难a(bǔ)體C3f抗體、變異的C3alphachain抗體及變異的纖維蛋白肽A抗體及質(zhì)譜聯(lián)合精確地檢測急性心肌梗死多種、變異的生物標(biāo)志試劑盒。用變異的補(bǔ)體C3f抗體、變異的C3alphachain抗體及變異的纖維蛋白肽A抗體(組)及質(zhì)譜聯(lián)合精確檢測多種變異的急性心肌梗死生物標(biāo)志試劑盒的方法準(zhǔn)確率為100%，靈敏度為100%,特異性為100%。一種新型檢測急性心肌梗死變異生物標(biāo)志的試劑盒和方法的具體操作步驟以下是用本發(fā)明提供的一個(gè)操作方案及試劑盒實(shí)例。1.樣品處理及標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清制備將生物樣品稀釋在稀釋緩沖溶液中，視需要離心澄清樣品。質(zhì)譜的標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清制備定義符合如下標(biāo)準(zhǔn)供血者10人，5男5女，血型為O型；年齡為18-30歲；民族漢。生化指標(biāo)正常，包括總膽固醇、甘油二酯、空腹血糖、乙肝表面抗原、肝功檢査、腎功檢査；無遺傳病家族史；無重大傳染病史。女性不能懷孕，男性為不吸煙者。2.基質(zhì)與多種抗體結(jié)合制備、樣品上樣將質(zhì)譜的標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清及樣品點(diǎn)樣在有支持物的基質(zhì)中的一個(gè)位點(diǎn)上。樣品來于血液，體液，分泌物，細(xì)胞溶解液，組織溶解物和器官溶解物。支持物可用金屬片、玻璃片、陶瓷片、陶瓷珠、磁性珠、多聚體、液相色譜柱子或S印harosebeads等?；|(zhì)是用于標(biāo)記、結(jié)合多種抗體的?？贵w為單克隆抗體或多克隆抗體。無限量地增加抗體組來達(dá)到無限量地檢測多個(gè)或多種生物標(biāo)志物或抗原標(biāo)記(只須生物標(biāo)志的分子量差異在質(zhì)譜檢測誤差率內(nèi))。將合成的變異的或修飾的生物標(biāo)志免疫小鼠，待免疫反應(yīng)出現(xiàn)后，從外周血中分離B細(xì)胞。用ELISA法篩選出效價(jià)最高的單抗株，大量制備，并從培養(yǎng)上清中提取所需抗體。此抗體可用于制備檢測變異或修飾生物標(biāo)志的所需試劑盒?；|(zhì)與多種抗體結(jié)合制備試劑盒的方法可用任何能與抗體結(jié)合的方法及任何能與抗體選擇性或特異性結(jié)合的物質(zhì)，舉例用蛋白A和G(ProteinAandG)標(biāo)記的S印harosebeads上基質(zhì)與抗體Fc段結(jié)合；用Carbodiimide方法(CarbodiimideMethod)將帶有carboxylate-groups標(biāo)記的磁性珠上基質(zhì)與抗體的氨基端(amino-groups)結(jié)合(GunnDL,etal.PreparationofsensitiveandstableerythrocytesbythecarbodiimidemethodforthedetectionofprimaryandsecondaryIgMandIgGantibody.JImmunolMethods.1972;1(4):381-389.);用str印tavidin標(biāo)記的基質(zhì)與biotin標(biāo)記的抗體結(jié)合用MEPHyperCel標(biāo)記的陶瓷珠與抗體結(jié)合(throughhighcapacityandhighselectivityinteractionandthecooperativeinfluenceofathioethergroup);等等方法。多種抗體標(biāo)記至液相色譜柱子上的基質(zhì)可用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(LC-MS)的標(biāo)準(zhǔn)方法去分析?？梢詫①|(zhì)譜的標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清用于質(zhì)譜儀試劑盒的定量方法。3.洗滌用結(jié)合緩沖液洗滌。在樣品完全干燥前將第一份洗滌瀋液加到該位點(diǎn)。洗滌溶液在位點(diǎn)上至少停留10秒。徹底清除第一份洗滌溶液，用第二滌液重復(fù)以上步驟。以下可有不同步驟(1)用水徹底洗滌整個(gè)陣列點(diǎn)，自然千燥基質(zhì)及滯留的生物標(biāo)志，加O.SnL吸能分子(以50%乙腈，0.5%三氟乙酸的制備的飽和標(biāo)準(zhǔn)溶液)；(2)或用0.05%1%三氟乙酸徹底洗滌整個(gè)陣列點(diǎn)(當(dāng)用陶瓷珠、磁性珠、多聚體或S印harosebeads為支持物時(shí))，將生物標(biāo)志洗脫至質(zhì)譜專用金屬片(有3x3mm圓孔)上，自然干燥金屬片，加0.5pL吸能分子(以50%乙腈，0.5%三氟乙酸制備的飽和標(biāo)準(zhǔn)溶液)。吸能分子可用Sinapinicacid或alpha-Cyano-4-hydroxycinnamicacid等。3.質(zhì)譜的定量控制及測試用激光解吸/離子化飛行時(shí)間質(zhì)譜儀，用氮激光儀(337nm)和80cm或120cm飛行管分析陣列，或用電噴霧電離已洗脫的生物標(biāo)志后用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(LC-)標(biāo)準(zhǔn)方法去分析滯留于各位點(diǎn)的生物標(biāo)志或蛋白質(zhì)。串聯(lián)四極桿質(zhì)譜或線性離子阱質(zhì)譜來鑒定修飾的與變異的的生物標(biāo)志及多肽denovo的測序。用計(jì)算機(jī)分析數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)重疊展示。定量性質(zhì)譜調(diào)控每次測試前，用質(zhì)譜的標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清，將標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血淸中用于定量的標(biāo)準(zhǔn)峰4091.1Da或6634.0Da等強(qiáng)度調(diào)至50%信號(hào)強(qiáng)度的最大值。本發(fā)明將蛋白質(zhì)分成了幾大類，即WCX陰離子、SAX陽離子、C8/C18疏水作用等蛋白。這樣，可用質(zhì)譜儀直接進(jìn)行分析。本發(fā)明利用WCX陰離子基質(zhì)及利用C8/C18疏水基質(zhì)磁珠對確診為急性心肌梗死患者與正常人血清進(jìn)行蛋白質(zhì)對比分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)血清中質(zhì)荷比，1263.6土lDa、1350.6土lDa、1449.8土lDa、1465.7土lDa、1777.9土lDa、1865.0土lDa、3778.7土10Da、4649.6土15Da、8149.8土15Da、42kDa中的10個(gè)蛋白質(zhì)相對含量有明顯的差異，并且10個(gè)蛋白質(zhì)所組合成的分組標(biāo)準(zhǔn)診斷急性心肌梗死試劑盒的靈敏度為100%,特異性為100%(實(shí)施例1正常人及急性心肌梗死在血液中蛋白指紋差異的發(fā)現(xiàn)及區(qū)分)。鑒別出生物標(biāo)志及其化學(xué)結(jié)構(gòu)為變異的補(bǔ)體C3f及纖維蛋白肽A(從N端至C端排列、分子量)C3ffragment(SSKITHRIHWESASLL,1865.O土lDa)、C3ffragment(SKIT冊IHWESASLL，1777.9土lDa)、C3ffragment(T冊IHWESASLL，1449.8土lDa)、FPAfragment(DSGEGDFLAEGGGVR,1465.7土lDa)、FPAfragment(SGEGDFLAEGGGVR,1350.6土lDa)、FPAfragment(GEGDFL旭GGGVR,1263.6土lDa)、C3alphachainfragment(42kDa)(實(shí)施例2急性心肌梗死中血清生物標(biāo)志的排序鑒定及實(shí)施例3急性心肌梗死血液中42kDa生物標(biāo)志分子鑒定)?？捎米儺惖难a(bǔ)體C3f、變異的C3alphachain及變異的纖維蛋白肽A生物標(biāo)記制備抗體及試劑盒?？捎米儺惖难a(bǔ)體C3f抗體、變異的C3alphachain抗^i及變異的纖維蛋白肽A抗體及質(zhì)譜聯(lián)合精確地檢測急性心肌梗死多種、變異的生物標(biāo)志試劑盒。用變異的補(bǔ)體C3f抗體、變異的C3alphachain抗體及變異的纖維蛋白肽A抗體(組)及質(zhì)譜聯(lián)合精確檢測多種變異的急性心肌梗死生物標(biāo)志試劑盒的方法準(zhǔn)確率為100%，靈敏度為100%,特異性為100%。本發(fā)明可用于體外細(xì)胞和非侵入性的臨床急性心肌梗死病人體外檢測方法，如離體體液的試劑盒用于臨床疾病的檢測方法。本發(fā)明中的試劑盒及方法與其他非侵入性的體外檢測方法比較，具有以下的特點(diǎn)(1)準(zhǔn)確及精確用多種抗體及質(zhì)譜聯(lián)合精確檢測多種生物標(biāo)志方法的一個(gè)特點(diǎn)是能夠從復(fù)雜的樣品混合物中準(zhǔn)確地分辨出分析物。抗體與抗原結(jié)合的準(zhǔn)確率超過95%。這是ELISA及免疫熒光試劑盒等的基楚。質(zhì)譜直接分析有很強(qiáng)的精確性，一般誤差率只有0.1Da。因?yàn)榈鞍踪|(zhì)是由氣基酸組成的，而氨基酸的平均質(zhì)量是己知的，如果知道了抗原或生物標(biāo)志的總分子量，那么抗原的變異(指氨基酸變化)就很容易被推測出來。但ELISA及免疫熒光試劑盒無法知道抗原的變異。所以，用抗體及質(zhì)譜聯(lián)合精確檢測生物標(biāo)志方法可提供被分析物(抗原或生物標(biāo)志)化學(xué)或結(jié)構(gòu)特征的直接信息。舉例已知纖維蛋白肽A分子的分子量為1536Da,化學(xué)結(jié)構(gòu)為16個(gè)氨基酸(N端Ala-Asp-Ser-Gly-Glu-Gly-Asp-Phe-Leu-Ala-Glu-Gly-Gly-Gly-Val-ArgC端)。纖維蛋白肽A的抗體與質(zhì)譜儀聯(lián)合應(yīng)用發(fā)現(xiàn)分子量為1536Da的纖維蛋白肽A。則100%可確定被分析物是纖維蛋白肽A，即最精確鑒別(金標(biāo)準(zhǔn))。用纖維蛋白肽A的抗體與質(zhì)譜儀聯(lián)合應(yīng)用發(fā)現(xiàn)被分析物是分子量為1465±1Da變異的纖維蛋白肽A。則化學(xué)結(jié)構(gòu)可以(從N端至C端)推測為15個(gè)氨基酸N端Asp-Ser-Gly-Glu-Gly-Asp-Phe-Leu-Ala-Glu-Gly-Gly-Gly-Val-ArgC端。即抗體及質(zhì)譜聯(lián)合，可省去變異的纖維蛋白肽A的排序鑒定。(2)便于聯(lián)合檢測用三種以上抗體組標(biāo)在基質(zhì)上與質(zhì)譜聯(lián)合，可同時(shí)檢湖出多種(三種以上)的生物標(biāo)志及一種或一種以上變異的或修飾的生物標(biāo)志。這樣產(chǎn)生了一種可用質(zhì)譜儀直接進(jìn)行分析多種(三種以上)的生物標(biāo)志及一種或一種以上變異的或修飾的生物標(biāo)志的方法(實(shí)施例4)。二色免疫熒光法可以同時(shí)分析二種生物標(biāo)志，但無、法達(dá)到三種以上的生物標(biāo)志的分析或像抗體與質(zhì)譜聯(lián)合來精確地、高效地確定一種變異的或修飾的被分析物(抗原或生物標(biāo)志)。基質(zhì)可用任何能與抗體選擇性或特異性結(jié)合的物質(zhì)。(3)快捷用本發(fā)明提供的多種已知抗體組及質(zhì)譜聯(lián)合精確檢測多種生物標(biāo)志方法進(jìn)行多種疾病檢測時(shí)，無需對蛋白質(zhì)進(jìn)行測序即可知"變異的或修飾的生物標(biāo)志"。不像免疫熒光法試劑盒，一個(gè)試劑盒最多可同時(shí)標(biāo)記二種抗體，無法知道"變異的或修飾的生物標(biāo)志"。修飾的生物標(biāo)志指甲基化、乙?；⒘u基化、磷酸化修飾等的高表達(dá)或低表達(dá)變化。質(zhì)譜直接分析有很強(qiáng)的精確性，一般誤差率只有0.1Da。舉例，在肝癌的血清中發(fā)現(xiàn)了4302Da帶正電的蛋白質(zhì)，而在正常人中只有4287Da帶正電的蛋白質(zhì)。兩種蛋白質(zhì)分子量差額為15Da，即甲基(-CH3)。用去甲基化酶驗(yàn)證4302Da的蛋白質(zhì)為甲基化的4287Da蛋白質(zhì)，即在去甲基化酶的處理下，4302Da蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)變?yōu)?287Da的蛋白質(zhì)。修飾蛋白可以用去甲基化酶、去乙?；浮⑷チu基化酶、去磷酸化酶來驗(yàn)證。甲基化試劑盒對腫癯細(xì)胞檢測的應(yīng)用，可以用于區(qū)分正常人樣品與癌癥患者群的樣品。本發(fā)明提供的一個(gè)多種抗體試劑盒方法用于質(zhì)譜來同時(shí)檢測，可不限于三種抗體。從而有助于臨床復(fù)雜的檢測，如可用此法進(jìn)行急性心肌梗死病人檢測試劑盒等。具體實(shí)施例方式本發(fā)明將結(jié)合具體實(shí)施例作進(jìn)一步說明，這些實(shí)例僅用于說明R的，而不用于限制本發(fā)明范圍。實(shí)施例1正常人及急性心肌梗死在血液中蛋白指紋差異的發(fā)現(xiàn)及區(qū)分(1)實(shí)驗(yàn)方法一、材料1.標(biāo)本來源急性心肌梗死患者組有100例患者，均經(jīng)心電圖和心肌酶譜診斷為急性心肌梗死；正常人組有100例正常人。二個(gè)組年齡均在45—60歲間，有相似的暴露史。男女比例為本l:l。二組均無影響血清中蛋白質(zhì)含量的其它相關(guān)性疾病。2.試劑尿素、乙腈、三氟乙酸、SPA(Sin即inicacid)均購自Sigma公司，WCX基質(zhì)磁珠來自賽爾迪公司。二、方法1.樣品的收集全血采集后吸取血清，置于—80'C保存；-80'C冰箱中取出血猜樣品，置冰盒上融解；以IO,000轉(zhuǎn)/分，4'C離心2分鐘；取上清液。2.樣品的準(zhǔn)備每個(gè)吸附劑基質(zhì)支持物點(diǎn)需要血清2.5W,將血清用2倍體積U9緩沖說明書第11/16頁液(9MUrea，2%CHAPS，50mMTris-HCL，pH9.0)稀釋(例如10W血清用20W緩沖液稀釋)。將樣品充分混勻。將30W上述樣品加入370W相應(yīng)的結(jié)合緩沖液，使得血洧的總稀釋倍數(shù)達(dá)到約40倍。將處理好的血清樣品100W上樣到吸附劑基質(zhì)上。3.樣品檢測上樣，在WCX基質(zhì)磁珠陣列點(diǎn)中加入10(Hil處理好的樣品，置振蕩器,400-600轉(zhuǎn)/分，4。C震蕩1小時(shí)。甩出樣品，每孔加入200M的結(jié)合緩沖液50mMNaAC,pH4.0-5.0。室溫置振蕩器400-600轉(zhuǎn)/分，震蕩5分鐘，甩去孔中液體，再次加入結(jié)合緩沖液200W，重復(fù)操作一次。每孔加入200WHPLC水，立刻甩出。0.5%三氟乙酸徹底洗滌整個(gè)WCX磁珠陣列點(diǎn)，將生物標(biāo)志洗脫至質(zhì)譜專用金屬片(有3x3mm圓孔)上，自然干燥金屬片，加0.5pL吸能分子SINAPINIC酸(以50%乙腈，0.5%三氟乙酸的制備的標(biāo)準(zhǔn)溶液)。4.將上述樣品加入質(zhì)譜中，就會(huì)生成質(zhì)譜蛋白指紋峰。計(jì)算機(jī)以每秒lGHz的速度從所獲得的原始數(shù)據(jù)快速精確的繪制出蛋白質(zhì)質(zhì)譜圖。其中縱坐標(biāo)為蛋白質(zhì)相對含量，橫坐標(biāo)為蛋白質(zhì)質(zhì)荷比。外部使用多肽分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)來校正質(zhì)量精確性。(2)實(shí)驗(yàn)結(jié)果用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，分析所得數(shù)據(jù)的形式是用計(jì)算機(jī)讀取的條碼格式，蛋白指紋顯示為沿蛋白指紋著線性軸的暗度強(qiáng)度值信號(hào)，此強(qiáng)度可以用掃描儀記錄并用分析軟件自動(dòng)分析對比強(qiáng)弱。通過分析幾千種血清蛋白指紋峰，發(fā)現(xiàn)下述蛋白措紋可以用于區(qū)分正常人與急性心肌梗死。1.質(zhì)譜圖分析設(shè)定參數(shù)分別對所得質(zhì)譜圖進(jìn)行分析，蛋白質(zhì)含量存在統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。2.蛋白質(zhì)的對比100例急性心肌梗死患者與100例正常人血清中蛋白質(zhì)的組成，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，1263.6土lDa、1350.6土lDa、1449.8土lDa、1465.7土lDa、1777.9土lDa、1865.O土lDa、3778.7土10Da、4649.6土15Da、8149.8土15Da、42kDa蛋白質(zhì)組成的生物標(biāo)志物可將急性心肌梗死患者與正常人準(zhǔn)確的分組。經(jīng)方差分析，蛋白質(zhì)含量差異有顯著性(/^0.01)。3.預(yù)測準(zhǔn)確率用統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果顯示用這蛋白質(zhì)組成的生物標(biāo)志物進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)100/100例急性心肌梗死患者與100/100例正常人被正確分組，準(zhǔn)確率為100%(200/200)。4.特異性和敏感度IOO例急性心肌梗死患者用本方法均被診斷為急性心肌梗死患者，IOO例正常人用本方法均被診斷為正常人。靈敏度和特異性分別為100%(100/100),100%(100/100)。(3)結(jié)論本研究利用WCX基質(zhì)磁珠對100例確診為急性心肌梗死患者與100例正常人血淸進(jìn)行蛋白質(zhì)對比分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)血清中質(zhì)荷比，1263.6土lDa、1350.6土lDa、1449.8土lDa、1465.7土lDa、1777.9土lDa、1865.O土lDa、3778.7土10Da、4649.6土15Da、8149.8j;15Da、42kDa中的10個(gè)蛋白質(zhì)相對含量有明顯的差異，并且10個(gè)蛋白質(zhì)所組合成的分組標(biāo)準(zhǔn)診斷急性心肌梗死的靈敏度為100%(100/100),特異性為100%(100/100)。利用C8及C18疏水基質(zhì)磁珠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與上述WCX陰離子基質(zhì)磁珠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。實(shí)施例2急性心肌梗死中血清生物標(biāo)志的排序鑒定選1263.6土lDa、1350.6土lDa、1449.8土lDa、1465.7土lDa、1777.9土lDa、1865.0土lDa生物標(biāo)志用MALDI-Qq-TOF多級(jí)質(zhì)譜(MS/MS)、源后裂解(PSD)及蛋白質(zhì)梯狀排序法(proteinladdersequencing)進(jìn)行排序。通過將分子碎成碎片，可生成蛋白質(zhì)梯度(proteinladders)。然后，用質(zhì)譜對此梯度進(jìn)行分析。鑒剮出生物標(biāo)志及其化學(xué)結(jié)構(gòu)為變異的補(bǔ)體C3f及變異的纖維蛋白肽A(從N端至C端排列)表一、急性心肌梗死中生物標(biāo)志蛋白質(zhì)的排序鑒定<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>查已知cDNA數(shù)據(jù)庫中的補(bǔ)體C3f分子的分子量為2021.1Da，化學(xué)結(jié)構(gòu)為SSKITHRIHWESASLLR;査已知cDNA數(shù)據(jù)庫中的纖維蛋白肽A分子的分子量為1536.7Da,化學(xué)結(jié)構(gòu)為ADSGEGDFLAEGGGVR。實(shí)施例3急性心肌梗死血液中42kDa生物標(biāo)志分子鑒定用Carbodiimide方法(CarbodiimideMethod)將帶有羧酸基團(tuán)標(biāo)記的磁性珠上基質(zhì)與抗補(bǔ)體蛋白C3alphachain抗體的氨基基團(tuán)結(jié)合(G,DL,etal.Pr印arationofsensitiveandstableerythrocytesbythecaxbodiimidemethodforthedetectionofprimaryandsecondaryIgMandIgGantibody.JImmunolMethods.1972:1(4):381-389.)。將樣品點(diǎn)樣在一個(gè)抗補(bǔ)體蛋白C3alphachain抗體基質(zhì)的位點(diǎn)上。用結(jié)合緩沖液洗滌。在樣品完全千燥前將第一份洗漆簿液加到該位點(diǎn)。洗滌洛液在位點(diǎn)上至少停留10秒。徹底清除第一份洗滌溶液，用第二份洗滌液重復(fù)以上步驟。用1%三氟乙酸徹底洗滌整個(gè)陣列點(diǎn)，將生物標(biāo)志洗脫至質(zhì)譜專用金屬片(有3x3mm圓孔)上，自然T燥金屬片，加0.5Sin叩inicacid吸能分子(以50%乙腈，0.5%三氟乙酸的制備的標(biāo)準(zhǔn)溶液)。用質(zhì)譜儀，用氮激光儀(337mn)和80cm或120cm飛行管分析陣列去分析各位點(diǎn)的生物標(biāo)志或蛋白質(zhì)。用計(jì)算機(jī)分析數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)重疊展示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果用抗補(bǔ)體蛋白C3alphachain抗體基質(zhì)與質(zhì)鐠儀聯(lián)合應(yīng)用發(fā)現(xiàn)被分析物是分子量與實(shí)施例1一致，是已知cDNA數(shù)據(jù)庫中的血液中補(bǔ)體蛋白C3alphachain分子片斷的分子量(42kDa)。發(fā)現(xiàn)下述變異的補(bǔ)體蛋白C3alphachain可以用于區(qū)分正常人血清、急性心肌梗死病人的血清表二、發(fā)現(xiàn)下述變異的補(bǔ)體蛋白C3alphachain分子片斷<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>IOO例正常人對照組的血清陰性IOO例急性心肌梗死病人的血清陽性實(shí)施例4變異的補(bǔ)體C3f、變異的補(bǔ)體蛋白C3alphachain及變異的纖維蛋白肽A生物標(biāo)記抗體的制備將合成的變異的補(bǔ)體C3f、變異的補(bǔ)體蛋白C3alphactein及纖維蛋白肽A生物標(biāo)記免疫小鼠，待免疫反應(yīng)出現(xiàn)后，從外周血中分離B細(xì)胞。用溶血噬菌斑分析法選擇并分離出能分泌所需抗體的單個(gè)淋巴細(xì)胞。將單個(gè)細(xì)胞擴(kuò)增至1X10'個(gè)以上，用QuickmRNAPurificationKit提取mRNA。以提取的mRNA為模板，合成cDNA鏈。以此cDNA為模板，加入鼠抗體重鏈可變區(qū)(V)通用引物，輕鏈可變區(qū)(V,.)通用引物，進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)，獲得擴(kuò)增的Vh基因片段和V,基因片段。將擴(kuò)增產(chǎn)物在15g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定和分離。用glassmilk回收擴(kuò)增的VH基因片段和V,.基因片段。與等摩爾嘗試的LimkerPrimerMix混合，進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)，連接Vu和V,.。擴(kuò)增產(chǎn)物分離純化后，獲得特異性單鏈抗體(ScFV)。此ScFV可用于制備檢測所需DNA片。將此擴(kuò)增產(chǎn)物兩端加限制性酶切位點(diǎn)，純化定量后，連接到P',載體上。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感染大腸桿菌TOPIO。經(jīng)藍(lán)白斑篩選及酶切鑒定，篩選出重組質(zhì)粒。在96孔板形成單克隆抗體。用ELISA法篩選出效價(jià)最高的單克隆抗體株，大量制備，并從培養(yǎng)上清中提取所需抗體。此抗體可用于制備檢測所需試劑盒。實(shí)施例5用多種抗體及質(zhì)譜聯(lián)合精確地檢測急性心肌粳死多種、變異的生物標(biāo)志(1)實(shí)驗(yàn)方法基質(zhì)與多種抗體結(jié)合制備試劑盒、樣品上樣將樣品點(diǎn)樣在有支持物的基質(zhì)中的一個(gè)位點(diǎn)上。支持物用磁性珠。取50^有carboxylate-groups標(biāo)記的磁性珠加在500^L的試管中。用Carbodiimide方法，將帶有carboxylate-groups標(biāo)記的磁性珠上基質(zhì)與多種抗體(補(bǔ)體蛋白C3alphachain抗體、FPA抗體、C3f抗體)的氨基端(amino-gro叩s)結(jié)合(GunnDL,etal.PreparationofsensitiveandstableerythrocytesbythecarbodiimidemethodforthedetectionofprimaryandsecondaryIgMandIgGantibody.JIiranunolMethods.1972;1:381-389.)。多種抗體磁珠試劑盒可用于質(zhì)譜測試了。將質(zhì)譜的標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清用于質(zhì)譜的定量。洗滌用結(jié)合緩沖液洗滌。在樣品完全干燥前將第一份洗滌癩液加到該位點(diǎn)。洗滌溶液在位點(diǎn)上至少停留10秒。徹底清除第一份洗滌溶液，用第二份洗滌液重復(fù)以上步驟。用1%二氟乙酸徹底洗滌整個(gè)陣列點(diǎn)，將生物標(biāo)志洗脫至質(zhì)譜專用金屬片(有3x3mm圓孔)上，自然干燥金屬片，加0.5nLSi,inicacid吸能分子(以50%乙腈，0.5%三氟乙酸制備的飽和標(biāo)準(zhǔn)溶液)。質(zhì)譜的定量控制及精確檢測用激光解吸/離子化飛行時(shí)間質(zhì)譜儀，用氮激光儀(337nm)和80cm或120cm飛行管分析陣列力分析試劑盒各位點(diǎn)的生物標(biāo)志或蛋白質(zhì)。用計(jì)算機(jī)分析數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)重疊展示。定量性質(zhì)譜調(diào)控每次測試前，用質(zhì)譜的標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血淸，將標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血淸中用于定量的標(biāo)準(zhǔn)峰4091.IDa或6634.0Da強(qiáng)度調(diào)至50%信號(hào)強(qiáng)度的最大值。(2)實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)用多種抗體及質(zhì)譜聯(lián)合試劑盒可將對照組與急性心肌梗死組準(zhǔn)確的分組。預(yù)測準(zhǔn)確率用統(tǒng)計(jì)學(xué)分析及雙盲分析中，結(jié)果顯示用抗體組(補(bǔ)體蛋白C3alphachain抗體、FPA抗體、C3f抗體)及質(zhì)譜聯(lián)合精確檢測多種變異的急性心肌梗死生物標(biāo)志的方法準(zhǔn)確率為100%，靈敏度為100%,特異性為100%(表二)。表二、用抗體組及質(zhì)譜聯(lián)合精確地檢測多種、變異的急性心肌梗死生物標(biāo)志<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>試劑加至血漿的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與血清一致。(3)結(jié)論本發(fā)明利用多種抗體及質(zhì)譜聯(lián)合對對照組與急性心肌梗死組進(jìn)行蛋白質(zhì)對比分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)分組檢測的靈敏度為100%,特異性為100%。本發(fā)明用抗體組及質(zhì)譜聯(lián)合，可同時(shí)精確地檢測出多種、變異的急性心肌梗死的生物標(biāo)志群。本發(fā)明涉及一種通過被抗體組吸附表面基質(zhì)上捕獲的生物標(biāo)志，用標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清控制下的定量性質(zhì)譜分析來檢測。在一個(gè)抗體組基質(zhì)上同時(shí)據(jù)獲多個(gè)生物標(biāo)志，并對捕獲的變異的或修飾的生物標(biāo)志進(jìn)行質(zhì)譜精確分析。可以同時(shí)檢灘多個(gè)生物標(biāo)志群。本發(fā)明的方法可用于檢測已經(jīng)脫離人體的體液中的生物標(biāo)志組合。這些生物標(biāo)志組合可以用于同時(shí)鑒別正常人及多種病人離體體液的試劑盒的檢測方法。在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用參考，就如飼每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。權(quán)利要求1.一種用含有抗體組的基質(zhì)去捕獲急性心肌梗死生物標(biāo)志的試劑盒制備和方法，其特征是采用質(zhì)譜法對樣品中已被抗體組捕獲的生物標(biāo)志進(jìn)行精確地鑒別、檢測的方法。該方法通過以下步驟實(shí)現(xiàn)(1)樣品處理及質(zhì)譜標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清制備；(2)基質(zhì)與多種抗體結(jié)合試劑盒制備、樣品上樣；(3)洗滌；(4)質(zhì)譜的定量控制及質(zhì)譜檢測；其中所述步驟(1)將生物樣品稀釋在稀釋緩沖溶液中。用O型血，男女相等，混合制備質(zhì)譜的標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清；所述步驟(2)將質(zhì)譜的標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清及樣品點(diǎn)樣在有支持物的基質(zhì)中的一個(gè)位點(diǎn)上。支持物可用金屬片、玻璃片、陶瓷片、陶瓷珠、磁性珠、多聚體、液相色譜柱子或Sepharosebeads等。基質(zhì)是任何能與抗體選擇性或特異性結(jié)合的物質(zhì)；所述步驟(3)用結(jié)合緩沖液洗滌。在樣品完全干燥前將第一份洗滌溶液加到該位點(diǎn)。洗滌溶液在位點(diǎn)上至少停留10秒。徹底清除第一份洗滌溶液，用第二份洗滌液重復(fù)以上步驟。用水徹底洗滌整個(gè)陣列點(diǎn)，自然干燥基質(zhì)及滯留的生物標(biāo)志；或用三氟乙酸徹底洗滌整個(gè)陣列點(diǎn)(當(dāng)用陶瓷珠、磁性珠、多聚體、液相色譜柱子或Sepharosebeads為支持物時(shí))，將生物標(biāo)志洗脫至質(zhì)譜專用金屬片或位點(diǎn)上。所述步驟(4)加0.5μL吸能分子(以50％乙腈，0.5％三氟乙酸的制備的飽和標(biāo)準(zhǔn)溶液)用質(zhì)譜儀去分析滯留與各位點(diǎn)的生物標(biāo)志或用電噴霧電離已洗脫的生物標(biāo)志后用質(zhì)譜儀去分析。本發(fā)明用WCX陰離子基質(zhì)磁珠及用C8/C18疏水基質(zhì)磁珠對確診為急性心肌梗死患者與正常人血清進(jìn)行蛋白質(zhì)對比分析，用計(jì)算機(jī)分析數(shù)據(jù)結(jié)果發(fā)現(xiàn)血清中質(zhì)荷比，1263.6±1Da、1350.6±1Da、1449.8±1Da、1465.7±1Da、1777.9±1Da、1865.0±1Da、3778.7±10Da、4649.6±15Da、8149.8±15Da、42kDa中的10個(gè)蛋白質(zhì)相對含量有明顯的差異，并且10個(gè)蛋白質(zhì)所組合成的分組標(biāo)準(zhǔn)檢測急性心肌梗死試劑盒的靈敏度為100％，特異性為100％。2.權(quán)利要求1所述的基質(zhì)是用于捕獲多種抗體的，抗體是用于捕獲已知的急性心肌梗死變異生物標(biāo)志。所述的生物標(biāo)志的分析方法，可以檢測多個(gè)的、變異的急性心肌梗死生物標(biāo)志群。3.權(quán)利要求1所述的急性心肌梗死生物標(biāo)志及其化學(xué)結(jié)構(gòu)為變異的補(bǔ)體C3f、C3alpha鏈及纖維蛋白肽A(從N端至C端排列氨基酸、分子量)C3ffragment(SSKITHRIHWESASLL,1865.0土lDa)、C3ffragment(SKIT冊IHWESASLL,1777.9土lDa)、C3ffragment(THRIHWESASLL,1449.8土lDa)、FPAfragment(DSGEGDFLAEGGGVR，1465.7土lDa)、FPAfragment(SGEGDFLAEGGGVR,1350.6土lDa)、FPAfragment(GEGDFLAEGGGVR,1263.6土lDa)、C3alphachainfragment(42kDa)。4.權(quán)利要求1所述的生物標(biāo)志的分析方法，所捕獲的急性心肌梗死生物標(biāo)志群來源于已經(jīng)脫離人體或動(dòng)物體的血液。5.用權(quán)利要求2的方法，可以同時(shí)檢測出三種以上急性心肌梗死變異的生物標(biāo)志。6.權(quán)利要求1中基質(zhì)是任何能與抗體結(jié)合的物質(zhì)用蛋白A和G標(biāo)記的基質(zhì)，用carboxylate-groups標(biāo)記的磁性珠上基質(zhì)，用str印tavidin標(biāo)記的基質(zhì)，或用NEPHyperCel標(biāo)記的陶瓷珠上基質(zhì)等。7.權(quán)利要求1中基質(zhì)的支持物可以是金屬片、玻璃片、陶瓷片、陶瓷珠、磁性珠、多聚體、液相色譜柱子或S印harosebeads。8.—種權(quán)利要求3所述的急性心肌梗死變異生物標(biāo)志的用途，其特征在于，用于制備檢測急性心肌梗死變異生物標(biāo)志的抗體及試劑盒。9.一種權(quán)利要求8所述的檢測急性心肌梗死變異生,志的試劑盒，其特征在于，它包括一容器以及裝于容器中的權(quán)利要求8所述的檢測急性心肌梗死變異生物標(biāo)志的抗體(組)。10.如權(quán)利要求9所述的試劑盒，其特征于，所述的抗體(組)為單克隆抗體(組)或多克隆抗體(組)。全文摘要本發(fā)明涉及一種通過被抗體組吸附表面基質(zhì)上捕獲的生物標(biāo)志，用標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清控制下的定量性質(zhì)譜分析來檢測。在一個(gè)抗體組基質(zhì)上同時(shí)捕獲多個(gè)生物標(biāo)志，并對捕獲的變異的生物標(biāo)志進(jìn)行質(zhì)譜精確分析?？梢酝瑫r(shí)檢測多個(gè)生物標(biāo)志群。本發(fā)明的方法可用于檢測已經(jīng)脫離人體的體液中的生物標(biāo)志組合。這些生物標(biāo)志組合可以用于同時(shí)鑒別正常人及急性心肌梗死病人離體體液的試劑盒的檢測方法。本發(fā)明檢測急性心肌梗死試劑盒的靈敏度為100％，特異性為100％。本方法精確、方便且快捷。文檔編號(hào)G01N33/53GK101165488SQ20061014051公開日2008年4月23日申請日期2006年10月16日優(yōu)先權(quán)日2006年10月16日發(fā)明者洋許申請人:洋許