TCAACCACA 3'）：0· 5ul ;
[0058] 其余均與甲基化引物進(jìn)行擴(kuò)增的PCR反應(yīng)體系中的相同。
[0059] 應(yīng)用上述MSP反應(yīng)體系對已制備的DNA模板（8個食管癌癌組織樣本ECl~EC8,8 個結(jié)直腸癌組織樣本CRCl~CRC8,4個正常食管組織樣本ENl~EN4,8個正常結(jié)直腸組織 樣本CNl~CN8)分別進(jìn)行擴(kuò)增，并以CldH 2O作為陰性對照，擴(kuò)增程序為：95°C預(yù)變性5min， 接著進(jìn)入循環(huán)，在95°C下變性30s，在60°C下退火30s，在72°C下延伸40s，共35個循環(huán)，之 后，繼續(xù)在72°C下延伸7min。
[0060] 3. PCR反應(yīng)產(chǎn)物的檢測
[0061] PCR產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳，紫外透射分析儀檢測并照相。
[0062] 4.結(jié)果
[0063] 結(jié)果判讀方法如下：
[0064] (1)應(yīng)用甲基化引物（圖中以M表示）進(jìn)行擴(kuò)增，有擴(kuò)增產(chǎn)物，并且應(yīng)用非甲基化 引物（圖中以U表示）進(jìn)行擴(kuò)增，無擴(kuò)增產(chǎn)物的樣本則判讀為完全甲基化結(jié)果；
[0065] (2)應(yīng)用甲基化引物及非甲基化引物進(jìn)行擴(kuò)增，均有擴(kuò)增產(chǎn)物的樣本判讀為部分 甲基化結(jié)果；
[0066] (3)應(yīng)用非甲基化引物進(jìn)行擴(kuò)增，有擴(kuò)增產(chǎn)物，并且用甲基化引物進(jìn)行擴(kuò)增，無擴(kuò) 增產(chǎn)物的樣本則判讀為非甲基化結(jié)果。
[0067] (4)部分甲基化及完全甲基化的樣本均判讀為甲基化結(jié)果。
[0068] 如圖1所示，食管癌組織中，EC2和EC7為非甲基化結(jié)果，ECl、EC3、EC4、EC5、EC6、 EC8為甲基化結(jié)果；結(jié)直腸癌組織中，CRC3、CRC5、CRC6、CRC7、CRC8為非甲基化結(jié)果，CRC1、 CRC2、CRC4為甲基化結(jié)果。如圖2所示，正常食管組織（EN1、EN2、EN3和EN4)、正常結(jié)直腸 組織（CN1、CN2、CN3、CN4、CN5、CN6、CN7、CN8)均為非甲基化結(jié)果。對照體系反應(yīng)正常，結(jié) 果可信。
[0069] 實施例2臨床標(biāo)本檢測
[0070] 取食管癌臨床標(biāo)本103例、結(jié)直腸癌臨床標(biāo)本96例，正常食管組織標(biāo)本4例、正常 結(jié)直腸組織標(biāo)本8例。進(jìn)行MS-PCR擴(kuò)增，模板制備、PCR擴(kuò)增體系及條件、擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測 均與實施一中的相同，檢測結(jié)果請見下表：
[0072] 實施例3敏感度實驗
[0073] 將食管癌細(xì)胞系K410的DNA(TMEM176A基因啟動子區(qū)100%甲基化）與正常食管 組織細(xì)胞的DNA(TMEM176A基因啟動子區(qū)100%非甲基化）按比例混合，進(jìn)行硫化修飾（方 法同實施例一），再進(jìn)行MS-PCR。PCR產(chǎn)物進(jìn)行2 %瓊脂糖凝膠電泳，紫外透射分析儀測定 并照相。
[0074] 分組：第1組：100%食管癌細(xì)胞系K410DNA+0%正常食管組織細(xì)胞DNA
[0075] 第2組：50%食管癌細(xì)胞系K410DNA+50%正常食管組織細(xì)胞DNA
[0076] 第3組：5%食管癌細(xì)胞系K410DNA+95%正常食管組織細(xì)胞DNA
[0077] 第4組：1%食管癌細(xì)胞系K410DNA+99%正常食管組織細(xì)胞DNA
[0078] 第5組：0. 5%食管癌細(xì)胞系K410DNA+99. 5%正常食管組織細(xì)胞DNA
[0079] 第6組：0%食管癌細(xì)胞系K410DNA+100%正常食管組織細(xì)胞DNA
[0080] 結(jié)果請見圖3:在1000個正常細(xì)胞中有5個癌細(xì)胞就可以被檢測出，即用本發(fā)明 中的TMEM176A基因特異性的引物對及反應(yīng)體系、條件檢測食管癌細(xì)胞TMEM176A基因啟動 子區(qū)的甲基化狀態(tài)其靈敏度可達(dá)到0.5%，靈敏度較高，可用來監(jiān)測早期癌變。
[0081] 實施例4檢測消化系腫瘤細(xì)胞的試劑盒組成
[0082] 檢測消化系腫瘤細(xì)胞的試劑盒包括以下成分，其中，進(jìn)行1次MS-PCR的用量為：
[0083] 1、濃度為50pmol/ul的甲基化引物：上游引物核苷酸序列為Primer-MF，下游引物 核苷酸序列為Primer-MR，各為0. 5ul。
[0084] 2、濃度為50pmol/ul的非甲基化引物：上游引物核苷酸序列為Primer-UF，下游引 物核苷酸序列為Primer-UR，各為0. 5ul。
[0085] 3、反應(yīng)液2份，分別配合甲基化引物和非甲基化引物試用，每份反應(yīng)體系包括：
[0086] (I) IOxMSP buffer (緩沖液）2. 5ul ;
[0087] (2)20mM dNTP ：1. 25ul ；
[0088] (3)Hot start taq 酶：0· 15ul ;
[0089] (4) ddH20 :18. Iul0
[0090] -個試劑盒可以包括上述各成分進(jìn)行多次MS-PCR的用量，如25次、50次、100次 等，各成分的具體量視情況需要而定。
[0091] 為防止出現(xiàn)MS-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的假陽性和假陰性，試劑盒最好還包括：
[0092] (1)陽性對照PCR模板：硫化修飾后的TMEM176A基因啟動子區(qū)為100%甲基化的 食管癌細(xì)胞系K410系DNA，進(jìn)行1次MSP的用量為：2ul。
[0093] (2)陰性對照PCR模板：硫化修飾后的TMEM176A基因啟動子區(qū)為100%非甲基化 的正常外周血淋巴細(xì)胞DNA，進(jìn)行1次MSP的用量為：2ul。
[0094] (3)雙陰性的體系對照：ddH20,用以評估體系是否存在PCR產(chǎn)物的污染，如ddH20 檢測的結(jié)果為雙陰性（Μ和U均為陰性），則體系結(jié)果可信。
【主權(quán)項】
1. 一種用于檢測細(xì)胞TMEM176A基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)的引物對，其為甲基化引物， 其上游引物核苷酸序列如Primer-MF所述，S卩：5'GAAGAAAGACGTTTTGTGGATAGGAC 3'，下游 引物核苷酸序列如Primer-MR所述，S卩：5'CTAATATCCGCTCTACTCGACCGCG 3'。2.-種用于檢測細(xì)胞TMEM176A基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)的引物對，包括甲基化引物 對和非甲基化引物對，所述甲基化引物對如權(quán)利要求1所述，所述非甲基化引物對的上游 引物核苷酸序列如Primer-UF所述，S卩：5' GGAAGAAAGATGTTTTGTGGATAGGAT 3'，下游引物核 苷酸序列如Primer-UR所述，S卩：5' CAACTAATATCCACTCTACTCAACCACA 3'。3. -種檢測TMEM176A基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)的方法，包括如下步驟：首先，利用甲 基化引物對，以硫化修飾后的DNA為模板進(jìn)行MS-PCR擴(kuò)增；然后，根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物判斷甲基化 狀態(tài)；其中，所述甲基化引物對如權(quán)利要求1所述；所述模板為硫化修飾后的待測細(xì)胞DNA。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測方法，同時利用甲基化引物對和非甲基化引物對，以硫 化修飾后的DNA為模板進(jìn)行MS-PCR擴(kuò)增；其中所述非甲基化引物對如權(quán)利要求2所述。5. 根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的檢測方法，其中利用引物對進(jìn)行MS-PCR擴(kuò)增中，反應(yīng)條 件如下：95°C下預(yù)變性5min，接著進(jìn)入循環(huán)，在95°C下變性30s，在60°C下退火30s，在72°C 下延伸40s，共35個循環(huán)，之后，繼續(xù)在72°C下延伸5min。6. -種檢測檢測細(xì)胞TMEM176A基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)的試劑盒，其特征在于：包含 權(quán)利要求1或2所述的引物對。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于：還包含甲基化陽性對照PCR模板，該模 板為硫化修飾后的TMEM176A基因啟動子區(qū)100%甲基化的食管癌、結(jié)直腸癌細(xì)胞DNA。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的試劑盒，其特征在于：還包含非甲基化陽性對照PCR模板，該 模板為硫化修飾后的TMEM176A基因啟動子區(qū)100%非甲基化的正常食管、結(jié)直腸細(xì)胞DNA。9.根據(jù)權(quán)利要求6至8任一項所述的試劑盒，其特征在于：還包含MS-PCR反應(yīng)所需的 下列成分：l〇XMSP buffer緩沖液，20mMdNTP，hotstar taq酶，去離子水。10. -種用于檢測細(xì)胞TMEM176A基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)的MS-PCR反應(yīng)體系，以總體 積25ul計，其包括： (1) 模板：2ul; (2) 濃度為50pm〇l/ul的權(quán)利要求1所述的甲基化引物對和權(quán)利要求2中所述的非甲 基化引物對，其中，上游引物與下游引物各為0. 5ul; (3) 10XMSPbuffer緩沖液：2.5ul ; (4) 20mMdNTP：1.25ul； (5)hot start taq酉每：0· 5ul; (6) 去尚子水：17. 75ul; 其中，所述模板為硫化修飾后的待測細(xì)胞DNA，或硫化修飾后的TMEM176A基因啟動子 區(qū)為100 %甲基化的食管癌、結(jié)直腸癌細(xì)胞DNA，或硫化修飾后的TMEM176A基因啟動子區(qū)為 100%非甲基化的正常食管、結(jié)直腸細(xì)胞DNA。
【專利摘要】發(fā)明人首次選用TMEM176A基因作為目標(biāo)基因，通過MSP技術(shù)證明在食管癌、結(jié)腸癌細(xì)胞中啟動子區(qū)呈高甲基化狀態(tài)，具有首創(chuàng)性。本發(fā)明提供用于檢測細(xì)胞TMEM176A基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)的引物及試劑盒，引物為一對甲基化引物或為一對甲基化引物和一對非甲基化引物。利用本發(fā)明所述引物及試劑盒檢測食管癌的特異性好，其中在食管癌中為61.2％，結(jié)直腸癌53.13％；靈敏度高，達(dá)到0.5％，即1000個細(xì)胞中有5個癌細(xì)胞就能夠被檢測出。應(yīng)用本發(fā)明試劑盒來檢測TMEM176A基因啟動子區(qū)高甲基化狀態(tài)可作為消化系腫瘤診斷、療效觀察、預(yù)后判斷、微小殘留病檢測等的有力手段，而且，操作簡便、穩(wěn)定性好，具有深遠(yuǎn)的臨床意義和推廣性。
【IPC分類】C12Q1/68, C12N15/11
【公開號】CN105400865
【申請?zhí)枴緾N201510390230
【發(fā)明人】郭明洲, 令狐恩強(qiáng), 張游, 韓英杰
【申請人】中國人民解放軍總醫(yī)院
【公開日】2016年3月16日
【申請日】2015年7月6日