一種通量定量測(cè)定菌株降氮能力的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明飼用微生物領(lǐng)域，具體涉及一種通量定量測(cè)定菌株降氮能力的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]近年來，人們?cè)诓粩嗵岣唣B(yǎng)殖密度以追求養(yǎng)殖產(chǎn)量的同時(shí)，也造成了一系列常見的問題。如水體中過量的有機(jī)質(zhì)分解不僅消耗水體中的溶解氧，且釋放出許多有害物質(zhì)，如氨氮、亞硝態(tài)氮等，因而水產(chǎn)養(yǎng)殖池塘水質(zhì)的控制和凈化已是我國池塘水產(chǎn)養(yǎng)殖健康發(fā)展的關(guān)鍵問題。為了研發(fā)出高效的水質(zhì)改良制劑，為所需種源的篩選提供快捷的方法顯得尤為重要。
[0003]目前，有許多可定性和定量測(cè)定水體中氨氮和亞硝態(tài)氮的方法。定性測(cè)定方法操作簡(jiǎn)單，但不同操作人員、不同測(cè)定批次的測(cè)定結(jié)果不具有可比性；現(xiàn)有的一些定量測(cè)定方法，如測(cè)定污水中氮含量的方法，測(cè)定食品中氮含量的方法(見GB/T12763.4-2007)，存在同時(shí)測(cè)定數(shù)量少，操作繁瑣，試劑眾多，且部分試劑有毒，結(jié)果計(jì)算復(fù)雜，結(jié)果不穩(wěn)定等缺點(diǎn)，且最重要的是，目前還沒有針對(duì)菌株降氮能力測(cè)定的定量的方法，還要符合適用于水產(chǎn)養(yǎng)殖這一條件。
[0004]因此，在接近實(shí)際生產(chǎn)養(yǎng)殖的條件下，建立一種定量準(zhǔn)確測(cè)定樣品中氨氮和亞硝態(tài)氮含量的方法，對(duì)于水質(zhì)改良制劑時(shí)種源的篩選非常重要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為了解決上述問題，本發(fā)明提供一種通量定量測(cè)定菌株降氮能力的方法。
[0006]本發(fā)明提供的通量定量測(cè)定菌株降氮能力的方法，其為將待測(cè)菌株菌液接入相應(yīng)的以粉碎蝦料為唯一碳源的篩選培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)后，將培養(yǎng)物離心取上清液，加入96孔板；測(cè)定亞硝態(tài)氮時(shí)，在96孔板中加入待測(cè)樣上清液后，每孔先后加入格里斯試劑A、B，于550nm測(cè)定吸光值；測(cè)定氨氮時(shí)每孔加入納氏試劑，于450nm測(cè)定吸光值，然后通過建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出體系中剩余氮濃度，從而計(jì)算出菌株的降氮能力；其中，氨氮篩選培養(yǎng)基的氮源以NH/-N為唯一氮源；亞硝態(tài)氮篩選培養(yǎng)基以N02 -N為唯一氮源的氮源。
[0007]其中，亞硝態(tài)氮濃度￥1與測(cè)定0D值Xi之間參考標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y1=3.508Χ「0.191 ;氨氮濃度Υ2與測(cè)定0D值Χ2之間參考標(biāo)準(zhǔn)曲線為Υ2 =14.085Χ2-0.620。
[0008]其中，待測(cè)菌株接種終濃度為5 X 104 5CFU/mL。
[0009]在本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案中，測(cè)定亞硝態(tài)氮時(shí)，菌株培養(yǎng)物上清液與格里斯試劑A、B的體積比優(yōu)選為10:1:1 ;測(cè)定氨氮時(shí)，菌株培養(yǎng)物上清液與納氏試劑的體積比優(yōu)選為
10:1ο
[0010]其中，菌株振蕩培養(yǎng)條件為培養(yǎng)28-33°C，150-200 r/min，培養(yǎng)24_48h。
[0011]其中，所述的N02 -N優(yōu)選由NaN02提供，亞硝態(tài)氮濃度優(yōu)選為2.5mg/l ;所述的NH/-N優(yōu)選由(NH4) 2S04提供，銨態(tài)氮濃度優(yōu)選為2.5mg/l。
[0012]其中，所述的篩選培養(yǎng)基中粉碎蝦料的濃度優(yōu)選為1.0g/L。
[0013]在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的菌株為芽孢桿菌，更優(yōu)選為枯草芽孢桿菌。
[0014]為了保證篩選得到的菌株在實(shí)際養(yǎng)殖環(huán)境下發(fā)揮作用，配制篩選培養(yǎng)基中只使用蝦料作為唯一碳源，且通過科學(xué)計(jì)算得到添加量:由生產(chǎn)實(shí)際調(diào)查可知，1000立方水體，養(yǎng)殖2000kg蝦，即每立方米水體2kg蝦，又知，在全程養(yǎng)殖中，有30%的蝦料被蝦吸收，70%的蝦料沉積中水體中(其中，20%未被利用，50%被排泄掉)，通過計(jì)算得到每L水體中大約有1.4-1.5g蝦料沉積下來，即每50mL水中添加0.075g蝦料即接近實(shí)際養(yǎng)殖條件，在本發(fā)明中為了提高篩選標(biāo)準(zhǔn)，應(yīng)用每50mL水中添加0.05g蝦料進(jìn)行測(cè)定。使用蝦料作為唯一碳源:養(yǎng)殖實(shí)際環(huán)境中的主要碳源即為蝦料，雖然有的養(yǎng)殖戶會(huì)使用紅糖、葡萄糖等活化液體菌劑，但本發(fā)明方法是為了保證篩選出來的菌株在碳源濃度低和可利用碳源有限的條件下，也能夠很好地發(fā)揮作用，且可使養(yǎng)殖戶節(jié)省養(yǎng)殖成本。
[0015]本專利定量測(cè)定菌株降氮能力的通量方法具有如下優(yōu)點(diǎn):
1、高效的前提:共篩選高效降氮菌的樣品目標(biāo)明確:采用福建、江蘇蝦池的水、泥樣樣品，此類樣品按照高溫的方法處理后，并按照本專利中的方法進(jìn)行篩選，可獲得優(yōu)良安全的高效降氮的芽孢桿菌。
[0016]2、本發(fā)明方法簡(jiǎn)明易行，培養(yǎng)基成分簡(jiǎn)單易準(zhǔn)備，成本低。
[0017]3、篩選結(jié)果可信度高。統(tǒng)一的篩選培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件、測(cè)定條件、實(shí)現(xiàn)量化的標(biāo)準(zhǔn)曲線，同一測(cè)定對(duì)象，多次重復(fù)檢測(cè)，結(jié)果一致性高。
[0018]4、獲得高效菌株的應(yīng)用效果好。經(jīng)過該種方法測(cè)定，得到的菌株制成菌液或者菌粉，降氮效果得到驗(yàn)證。
[0019]本發(fā)明方法與傳統(tǒng)方法相比，可以進(jìn)行批量(彡96個(gè))樣品的同時(shí)處理和測(cè)定，高效且準(zhǔn)確。
【附圖說明】
[0020]圖1所示為實(shí)施例148株初篩菌株亞硝態(tài)氮降解能力測(cè)定結(jié)果。
[0021]圖2所示為實(shí)施例148株初篩菌株氨氮降解能力測(cè)定結(jié)果。
[0022]圖3所示為實(shí)施例2菌株亞硝態(tài)氮降解能力復(fù)篩測(cè)定結(jié)果。
[0023]圖4所示為實(shí)施例2菌株氨氮降解能力復(fù)篩測(cè)定結(jié)果。
[0024]圖5所示為實(shí)施例3六種不同芽孢桿菌菌粉亞硝態(tài)氮降解能力測(cè)定結(jié)果。
[0025]圖6所示為六種不同芽孢桿菌菌粉氨氮降解能力測(cè)定結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0026]以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。
[0027]實(shí)施例1菌株降氮能力初篩
將48株菌單菌落接入LB液體培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)16h，進(jìn)行活菌數(shù)測(cè)定后，進(jìn)行各菌株的降氮能力測(cè)定實(shí)驗(yàn)。
[0028]測(cè)定方法:在超凈臺(tái)中，將48株待測(cè)菌株菌液接入相應(yīng)篩選培養(yǎng)基中，每株菌接種終濃度為5X105CFU/mL，重復(fù)數(shù)為3 ;放入搖床中進(jìn)行培養(yǎng)30°C，180 r/min，培養(yǎng)24、48h ;均勻取樣到1.5mL離心管中，12000 r/min離心3min,取上清200 μ L加入96孔板。
[0029]測(cè)定亞硝態(tài)氮時(shí)，在96孔板中加入待測(cè)樣上清液200 μ L后，每孔先后加入格里斯試劑A、B各20 μ L,于550nm比色測(cè)定；測(cè)定氨氮時(shí)每孔加入納氏試劑20 μ L,于450nm比色測(cè)定。
[0030]定量測(cè)定:首先制定標(biāo)準(zhǔn)曲線。選取亞硝態(tài)氮濃度依次為0、0.05、0.10、0.20、0.40,0.80,1.60、3.20、6.40，單位為mg/L,獲得亞硝態(tài)氮濃