一種嘧啶核苷磷酸化酶基因及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及一種嘧啶核苷磷酸化酶基因及其應(yīng) 用，具體涉及一類嘧啶核苷磷酸化酶及其基因，及含有該嘧啶核苷磷酸化酶基因的重組表 達(dá)載體和基因工程菌，并用于催化合成索非布韋中間體（2' R)-2' -脫氧-2' -氟-2' -甲基 脲苷，以及其他核苷類原料藥及醫(yī)藥中間體的生產(chǎn)。
【背景技術(shù)】
[0002] 索非布韋（sofosbuvir，商品名Sovaldi)是美國Gilead Sciences公司研發(fā)的口 服治療丙肝（HCV)藥物，于2013年12月經(jīng)FDA批準(zhǔn)上市。索非布韋是首個獲得批準(zhǔn)用于 丙型肝炎全口服治療方案的藥物，是全球第一個上市的HCV聚合酶核苷類抑制劑，通過作 用于HCVNS5B聚合酶靶點干擾病毒遺傳物質(zhì)RNA的合成，從而終止HCV病毒的RNA鏈復(fù)制， 并對多種基因型HCV有治療效果，單獨應(yīng)用索非布韋或與NS5A蛋白酶抑制劑合用，丙肝患 者服用12周持續(xù)病毒學(xué)應(yīng)答率達(dá)到95%以上，臨床效果顯著，被醫(yī)學(xué)界視為治療丙型肝炎 的突破性藥物。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，全球丙肝的感染率約為3%，約1. 8億人感染HCV，丙 肝呈現(xiàn)全球化流行趨勢。索非布韋上市僅一年多，其銷售額即過百億美元，成為史上最快達(dá) 到年銷售百億美元的藥品。
[0003] 索非布韋是尿嘧啶核苷類似物的前藥，分子式為C22H29FN 3O9P,分子量529. 45, CAS 登記號為 1190307-88-0。中文化學(xué)名為（S)-2-(((S)-(((2R，3R，4R，5R)-5-(2,4-二氧 代-3,4-二氫嘧啶-I (2H)-基]-4-氟-3-羥基-4-甲基四氫呋喃-2-基）甲氧基）（磷酰 化苯氧基）氨基）丙酸異丙酯；英文化學(xué)名稱為（S)-isopropyl 2-{ (S) _{{(2R，3R，4R，5R) -5-[2, 4-diox0-3, 4-dihydr0-pyrimidin-l(2H)-yl]-4-fluor〇-3-ydroxy-4-methyltetra hydrofuran-2-yl}methoxy}(phenoxy phospho-ryla-mino}pr〇-panoate〇
[0004] 核苷類似物的合成主要有化學(xué)合成法、堿基修飾法和生物轉(zhuǎn)化法三種，前兩種方 法工藝步驟多，反應(yīng)條件苛刻，需要進(jìn)行異構(gòu)體的分離；堿基和核糖基團(tuán)縮合時還需要進(jìn)行 基團(tuán)的保護(hù)和去保護(hù)，使合成反應(yīng)的總收率偏低，成本居高不下（MENG W，ELLSWORTH B A， NIRSCHL A A,et al. J Med Chem,2008,51(5):1145-1149. CARR R,HILDBR AND S,HODGES M L，et al.WO, 2013178571 Al. 2013-11-05)。而酶催化合成方法具有反應(yīng)條件溫和、反應(yīng)專 一性強、副反應(yīng)少、產(chǎn)物容易分離純化，可合成復(fù)雜的生物分子，無需基團(tuán)保護(hù)等優(yōu)點。目 前，嘧啶核苷磷酸化酶已被廣泛用于酶法合成抗腫瘤、抗病毒的核苷類似物。
[0005] 核苷磷酸化酶（Nucleoside Phosphorylase，NPase)是核苷補救代謝途徑中的 關(guān)鍵酶，廣泛存在于真核或原核生物中，可分為噪呤核苷磷酸化酶（purine nucleoside phosphorylas，PNPase，EC2. 4· 2. I)，尿苷磷酸化酶（uridine phosphorylase， UrdPase, EC2. 4· 2· 4)和胸苷磷酸化酶（thymidine phosphorylase，dThdPase，EC2. 4· 2· 3)。 核苷磷酸化酶能可逆地催化核苷（或脫氧核苷）磷酸化反應(yīng)。目前，利用核苷磷酸化酶已 成功合成了阿糖腺苷、利巴韋林、5-甲基尿苷等藥物。但利用含有核苷磷酸化酶的天然菌株 合成核苷類藥物存在酶量小的缺點，構(gòu)建基因工程菌可從解決酶量問題。
[0006] 核苷磷酸化酶催化的化學(xué)反應(yīng)如下：
[0009] 本發(fā)明開發(fā)了一個具有較高催化活性的嘧啶核苷磷酸化酶，可用于索非布韋中間 體的生產(chǎn)，以及相關(guān)核苷類原料藥及醫(yī)藥中間體的生產(chǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供一種嘧啶核苷磷酸化酶基因及其 編碼的蛋白。
[0011] 本發(fā)明的另一目的是提供該基因、含有該基因的重組質(zhì)粒及基因工程菌的應(yīng)用。
[0012] 本發(fā)明的又一目的是提供一種催化合成（2' R) -2' -脫氧-2' -氟-2' -甲基脲苷的 方法。
[0013] 本發(fā)明的目的可通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)：
[0014] -種嘧啶核苷磷酸化酶基因，核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。本發(fā)明中嘧 啶核苷磷酸化酶的基因序列來源可以為大腸桿菌Escherichia Coli)、產(chǎn)氣腸桿菌 (Enterobacter aerogenes)、芽抱桿菌（Bacillus)、微桿菌（Exiguobacterium)、胡蘿卜軟 腐歐文氏菌（Erwinia carotovora)、乙酰短桿菌（Brevibacterium actylium)、短乳桿菌 (Lactobacillus brevis)等。本發(fā)明的一個實施例中啼啶核苷磷酸化酶的基因序列來自大 腸桿菌。嘧啶核苷磷酸化酶基因可以通過PCR擴增法、重組法或者化學(xué)合成方法獲得。
[0015] -種嘧啶核苷磷酸化酶，氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
[0016] 含有本發(fā)明所述的嘧啶核苷磷酸化酶基因的重組載體。可通過本領(lǐng)域常規(guī)方法 將本發(fā)明的嘧啶核苷磷酸化酶基因的核苷酸序列連接于各種載體上構(gòu)建而成，如質(zhì)粒 pUC18, pUC19, pET系列等，更優(yōu)選地選自pET系列。本發(fā)明的一個實施例中所使用的質(zhì)粒 為 pET-28a(+)。
[0017] -種生產(chǎn)所述的嘧啶核苷磷酸化酶的基因工程菌，所述基因工程菌中包含所述的 嘧啶核苷磷酸化酶基因或所述的重組載體。
[0018] 所述基因工程菌的宿主細(xì)胞優(yōu)選為大腸埃希氏菌（Escherichia coli) BL21(DE3) 〇
[0019] 本發(fā)明所述的嘧啶核苷磷酸化酶基因、所述的重組載體、所述的基因工程菌在制 備嘧啶核苷磷酸化酶中的應(yīng)用。
[0020] -種嘧啶核苷磷酸化酶的制備方法，包括如下步驟：培養(yǎng)所述的基因工程菌，獲得 重組表達(dá)的嘧啶核苷磷酸化酶。
[0021] 所述的方法，優(yōu)選還包括在一定生產(chǎn)罐發(fā)酵條件下，進(jìn)行工業(yè)化制備所述嘧啶核 苷磷酸化酶的步驟。
[0022] 本發(fā)明所述的嘧啶核苷磷酸化酶在催化合成（2'R) _2'_脫氧_2'_氟_2'_甲基脲 苷中的應(yīng)用。
[0023] -種利用本發(fā)明所述的嘧啶核苷磷酸化酶催化合成（2' R)_2' -脫 氧-2' -氟-2' -甲基脲苷的方法，以（3R，4R，5R) -3-氟-4-羥基-5-(羥甲基）-3-甲基四 氫呋喃-2-二氫磷酸和尿嘧啶為底物，權(quán)利要求2所述的嘧啶核苷磷酸化酶為催化劑，催化 合成（2' R) -2' -脫氧-2' -氟-2' -甲基脲苷。
[0024] 有益效果：
[0025] 本發(fā)明通過易錯PCR和定點突變方法獲得了 SEQ ID NO. 1所示的嘧啶核苷磷 酸化酶基因變體，通過將該基因?qū)氪竽c桿菌構(gòu)建基因工程菌，并進(jìn)行誘變表達(dá)，獲得 了 SEQ ID NO. 2所示的重組嘧啶核苷磷酸化酶。重組嘧啶核苷磷酸化酶突變體的酶 活為612U/mg，比突變之前提高了 30-60%。該重組嘧啶核苷磷酸化酶能夠用于催化 (3R，4R，5R)-3-氟-4-羥基-5-(羥甲基）-3-甲基四氫呋喃-2-二氫磷酸和尿嘧啶合成索 非布韋中間體（2' R)-2' -脫氧-2' -氟-2' -甲基脲苷。 生物材料保藏信息 本發(fā)明基因工程菌分類命名為大腸桿菌NP1506Escherichia coli NP1506,2015年 12月25日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址為中國武漢武漢大學(xué)，保藏編號為 CCTCC NO :M 2015782。
【具體實施方式】
[0026] 根據(jù)本發(fā)明一個實施例的嘧啶核苷磷酸化酶基因，其來源大腸桿菌 (Genbank:NC_000913. 3)。根據(jù)易錯PCR和定點突變方法對其進(jìn)行突變，從而獲得該重組氨 基轉(zhuǎn)移酶突變體目的基因，其基因序列為SEQ ID NO. 1。
[0027] 根據(jù)本發(fā)明一個實施例的嘧啶核苷磷酸化酶突變體的蛋白序列為SEQ ID NO. 2。
[0028] 根據(jù)本發(fā)明一個實施例的重組載體，包括本發(fā)明實施例的嘧啶核苷磷酸化酶突變 體基因，載體為pET-28a(+)，采用乳糖啟動子?；蚬こ叹鷵u瓶培養(yǎng)的誘導(dǎo)劑為IPTG，嘧啶 核苷磷酸化酶制備的誘導(dǎo)劑為乳糖。
[0029] 根據(jù)本發(fā)明一個實施例的生產(chǎn)嘧啶核苷磷酸化酶突變體的基因工程菌具有包括 嘧啶核苷磷酸化酶多肽基因突變體的重組載體。
[0030] 具體地，本發(fā)明的基因工程菌為保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC)的保藏 編號為CCTCC M 2015782的基因工程菌。
[0031] 實施例1基因工程菌的建立
[0032] 根據(jù)Genebank公布的大腸桿菌啼啶核苷磷酸化酶基因（Genbank:NC_000913. 3)， 人工合成嘧啶核苷磷酸化酶基因片段，以該基因片段為模版，通過PCR擴增擴 展該片段（片段兩側(cè)加 BamH I和EcoR I內(nèi)切酶片段），其核苷酸序列如SEQ ID N0.3(Genbank:NC_000913.3)所示。并利用 Hind III 和 BamH I 內(nèi)切酶位點 將基因插入pET-28a(+)質(zhì)粒中，將連接后的載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21 (DE3)中 建立嘧啶核苷磷酸化酶基因工程菌。其中PCR擴增嘧啶核苷磷酸化酶基因的 引物為：上游引物為5' -GTCTGATGTTTTTCATCTCG-3'（SEQ ID NO. 4)，下游引物為 5'-CCCGTTTTCCCGCTGGCTTT-3'（SEQ ID NO. 5)。
[0033] 實施例2嘧啶核苷磷酸化酶突變體基因的獲得
[0034] 本研究利用易錯PCR和定點突變的方法，對嘧啶核苷磷酸化酶進(jìn)行了蛋白質(zhì)工程 改造。易錯PCR是在采用DNA聚合酶進(jìn)行目的基因擴增時，通過調(diào)整反