一種利用堿性標(biāo)簽和內(nèi)含肽融合表達(dá)純化重組蛋白的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體公開(kāi)了一種利用堿性標(biāo)簽和內(nèi)含肽融合表達(dá)純化 重組蛋白的方法及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 酶、蛋白、抗體等重組蛋白類(lèi)產(chǎn)品在人們的生產(chǎn)、生活、醫(yī)療中發(fā)揮著不可或缺的 作用。尤其是重組蛋白、單克隆抗體等生物技術(shù)藥物是20世紀(jì)后期隨著生命科學(xué)的發(fā)展而 出現(xiàn)的最新一代藥物，具有高效、低毒、生物功能明確等一系列優(yōu)勢(shì)，連續(xù)6年的全球銷(xiāo)售 額增長(zhǎng)率保持在15%~33%，已成為我國(guó)的戰(zhàn)略支柱產(chǎn)業(yè)。
[0003] 然而重組蛋白在表達(dá)和純化工藝上還存在相當(dāng)大的技術(shù)困難，遠(yuǎn)未達(dá)到滿足人們 需求的程度。為達(dá)到增加表達(dá)量，提高產(chǎn)物的正確構(gòu)象及可溶性，方便下游純化操作，人們 可采用親和標(biāo)簽融合表達(dá)的方式，應(yīng)用如麥芽糖結(jié)合蛋白MBP，谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶GST，多 聚組氨酸6Hi s等。這些親和表達(dá)策略大大促進(jìn)了蛋白的研究和應(yīng)用，但面臨兩個(gè)主要的問(wèn) 題，一是親和純化介質(zhì)的成本較高；二是為保持目的蛋白的結(jié)構(gòu)、功能等特性，必須采取一 定的方法將標(biāo)簽去除。目前去除標(biāo)簽最常用的是酶切方法，包括激酶，Xa因子等，但酶的應(yīng) 用存在成本高，酶切效率低下以及后續(xù)酶本身的去除等問(wèn)題，難以實(shí)現(xiàn)大規(guī)模的工業(yè)生產(chǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種表達(dá)純化目的蛋白的方法，用 于解決現(xiàn)有技術(shù)中的問(wèn)題。所述方法將所要研究的目的蛋白與具有自剪接功能的內(nèi)含肽 (Intein)以及堿性標(biāo)簽融合表達(dá)，可通過(guò)離子交換層析快速實(shí)現(xiàn)目的蛋白的純化。與傳統(tǒng) 方法相比，本發(fā)明所述方法可省卻外源性酶的應(yīng)用，并且離子交換層析與親和層析相比成 本較低，對(duì)于放大規(guī)模的工業(yè)生產(chǎn)具有很好的應(yīng)用前景。
[0005] 本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
[0006] 本發(fā)明的第一方面公開(kāi)了一種表達(dá)純化目的蛋白的方法，所述方法具體包括如下 步驟：
[0007] (1)構(gòu)建目的蛋白表達(dá)載體：將目的蛋白編碼基因序列與具有自剪接功能的 Intein編碼基因序列以及堿性標(biāo)簽編碼基因序列融合后獲得目的蛋白表達(dá)單元，并將所述 目的蛋白表達(dá)單元插入表達(dá)質(zhì)粒上，構(gòu)建獲得目的蛋白表達(dá)載體；
[0008] (2)將步驟⑴中所得目的蛋白表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主系統(tǒng)，獲得轉(zhuǎn)化的宿主，并在表 達(dá)條件下，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的宿主，從而表達(dá)由目的蛋白、堿性標(biāo)簽、Intein組成的融合蛋白；
[0009] (3)去除不溶性物質(zhì)并采用離子交換層析法分離由目的蛋白、堿性標(biāo)簽、Intein 組成的融合蛋白；
[0010] (4)將步驟（3)所得融合蛋白在適當(dāng)?shù)臈l件下孵育，進(jìn)行切割，將目的蛋白從融合 蛋白中釋放到溶液中；
[0011] (5)分離目的蛋白和堿性標(biāo)簽：將步驟（4)中所得溶液進(jìn)行離子交換層析，洗脫得 到目的蛋白。
[0012] 優(yōu)選的，步驟（1)中，所述堿性標(biāo)簽為pl>7的超堿性蛋白或多肽，包括但不限于 Zbasic，Zbasic2〇
[0013] 更優(yōu)選的，所述堿性標(biāo)簽為Zbasic，所述Zbasic的編碼基因序列如SEQ ID NO. 1 所示，具體為：
[0014] GTTGATAACAAATTTAACAAAGAACGTCGCCGTGCTCGTCGTGAAATCCGTCATCTGCCGAATCTGA ATCGTGAACAGCGTCGTGCGTTTATTCGTAGCCTGCGCGATGACCCGTCACAAAGCGCAAACCTGCTGGCTGAAG CGAAAAAACTGAACGATGCCCAACCGAAA 〇
[0015] 優(yōu)選的，所述Intein包括具有自剪接或自我斷裂功能的已知各類(lèi)Intein的順式 及反式剪接形式。
[0016] 更優(yōu)選的，所述Intein為來(lái)源于Mtu RecA intein的Δ I-CM，所述Δ I-CM的編碼 基因序列如SEQ ID N0. 2所示，具體為：
[0017] GCCCTCGCAGAGGGCACTCGGATCTTCGATCCGGTCACCGGTACAACGCATCGCATCGAGGATGTTGTC GgtGGGCGCAAGCCTATTCATGTCGTGGCTGCTGCCAAGGACGGAACGCTGCATGCGCGGCCCGTGGTGTCCTGGTT CGACCAGGGAACGCGGGATGTGATCGGGTTGCGGATCGCCGGTGGCGCCATCctgtgGGCGACACCCGATCACAAGG TGCTGACAGAGTACGGCTGGCGTGCCGCCGGGGAACTCCGCAAGGGAGACAGGGTGGCGCAACCGCGACGCTTCGAT GGATTCGGTGACAGTGCGCCGATTCCGGCGCGCGTGCAGGCGCTCGCGGATGCCCTGGATGACAAATTCCTGCACGA CATGCTGGCGGAAGAACTCCGCTATTCCGTGATCCGAGAAGTGCTGCCAACGCGGCGGGCACGAACGTTCGGCCTCG AGGTCGAGGAACTGCACACCCTCGTCGCCGAAGGGGTTGTCGTGCACAAC〇
[0018] 優(yōu)選的，步驟（1)中，所述目的蛋白表達(dá)單元的序列還包括以下特征中的任一項(xiàng)：
[0019] a)所述目的蛋白表達(dá)單元的序列含有從N端到C端依次排列的堿性標(biāo)簽編碼基因 序列、Intein編碼基因序列以及目的蛋白編碼基因序列；
[0020] b)所述目的蛋白表達(dá)單元的序列含有從N端到C端依次排列的目的蛋白編碼基因 序列、Intein編碼基因序列以及堿性標(biāo)簽編碼基因序列；
[0021] c)所述目的蛋白表達(dá)單元的序列含有兩個(gè)閱讀框，分別是斷裂Intein的N端部 分，即Int (N);從N端到C端依次排列的堿性標(biāo)簽編碼基因序列、斷裂Intein的C端部分 即Int(C)編碼基因序列以及目的蛋白編碼基因序列。
[0022] 優(yōu)選的，所述堿性標(biāo)簽編碼基因序列與Intein編碼基因序列之間可以直接連接， 也可以采用GGGGS或GGSG及其重復(fù)等柔性肽端連接。
[0023] 優(yōu)選的，步驟（1)中，所述目的蛋白表達(dá)單元的序列還包括兩端的酶切位點(diǎn)序列。
[0024] 優(yōu)選的，步驟（1)中，所述表達(dá)質(zhì)粒為適用于原核或真核表達(dá)系統(tǒng)的質(zhì)粒。
[0025] 更優(yōu)選的，所述表達(dá)質(zhì)粒為采用 T7、lac、tac、araBAD、FLDl、AOXl、GAP、CMV、El α 等啟動(dòng)子的適用于原核或真核表達(dá)系統(tǒng)的質(zhì)粒。
[0026] 最優(yōu)選的，所述表達(dá)質(zhì)粒為pET30a。
[0027] 在本發(fā)明的一個(gè)較優(yōu)實(shí)施例中，所述目的蛋白表達(dá)序列插入到pET30a原核表達(dá) 載體的限制性酶切位點(diǎn)之間。更優(yōu)的，所述目的蛋白表達(dá)單元序列插入到pET30a原核表達(dá) 載體的Nde I酶和Xho I酶的限制性酶切位點(diǎn)之間。
[0028] 較優(yōu)的，步驟（1)具體為將目的蛋白表達(dá)單元通過(guò)酶切、連接的方法插入pET30a 原核表達(dá)載體，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化ToplO感受態(tài)細(xì)胞，篩選正確連接的載體作為構(gòu)建成功的目 的蛋白表達(dá)載體。
[0029] 所述篩選為采用添加有卡那霉素（Kana)的LB培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)轉(zhuǎn)化了連接產(chǎn)物的 感受態(tài)細(xì)胞，挑取單克隆進(jìn)行測(cè)序分析，驗(yàn)證連接產(chǎn)物正確連入了 pET30a原核表達(dá)載體。
[0030] 優(yōu)選的，步驟（1)中所述目的蛋白為白介素-15,所述白介素-15的編碼基因序列 如SEQ ID N0. 3所示，具體為：
[0031] CGCGTGCAGGCGCTCGCGGATGCCCTGGATGACAAATTCCTGCACGACATGCTGGCGGAAGAACTCCGC TATTCCGTGATCCGAGAAGTGCTGCCAACGCGGCGGGCACGAACGTTCGGCCTCGAGGTCGAGGAACTGCACACCCT CGTCGCCGAAGGGGTTGTCGTGCACAAC 〇
[0032] 在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，所述目的蛋白表達(dá)單元的序列如SEQ ID N0. 4所 示，具體為：
[0033] ATGGTTGATAACAAATTTAACAAAGAACGTCGCCGTGCTCGTCGTGAAATCCGTCATCTGCCGAATCTG AATCGTGAACAGCGTCGTGCGTTTATTCGTAGCCTGCGCGATGACCCGTCACAAAGCGCAAACCTGCTGGCTGAAGC GAAAAAACTGAACGATGCCCAACCGAAAGCCCTCGCAGAGGGCACTCGGATCTTCGATCCGGTCACCGGTACAACGC ATCGCATCGAGGATGTTGTCGgtGGGCGCAAGCCTATTCATGTCGTGGCTGCTGCCAAGGACGGAACGCTGCATGCG CGGCCCGTGGTGTCCTGGTTCGACCAGGGAACGCGGGATGTGATCGGGTTGCGGATCGCCGGTGGCGCCATCctgtg GGCGACACCCGATCACAAGGTGCTGACAGAGTACGGCTGGCGTGCCGCCGGGGAACTCCGCAAGGGAGACAGGGTGG CGCAACCGCGACGCTTCGATGGATTCGGTGACAGTGCGCCGATTCCGGCGCGCGTGCAGGCGCTCGCGGATGCCCTG GATGACAAATTCCTGCACGACATGCTGGCGGAAGAACTCCGCTATTCCGTGATCCGAGAAGTGCTGCCAACGCGGCG GGCACGAACGTTCGGCCTCGAGGTCGAGGAACTGCACACCCTCGTCGCCGAAGGGGTTGTCGTGCACAACCGCGTGC AGGCGCTCGCGGATGCCCTGGATGACAAATTCCTGCACGACATGCTGGCGGAAGAACTCCGCTATTCCGTGATCCGA GAAGTGCTGCCAACGCGGCGGGCACGAACGTTCGGCCTCGAGGTCGAGGAACTGCACACCCTCGTCGCCGAAGGGGT TGTCGTGCACAACTAATAATAA 〇
[0034] 優(yōu)選的，步驟（2)中，所述宿主系統(tǒng)選自真核表達(dá)系統(tǒng)或原核表達(dá)系統(tǒng)。
[0035] 進(jìn)一步優(yōu)選的，所述宿主系統(tǒng)包括真核表達(dá)系統(tǒng)，例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞，昆蟲(chóng)細(xì)胞， 酵母等；原核表達(dá)系統(tǒng)，例如大腸桿菌，枯草芽孢桿菌，巨大芽孢桿菌等。
[0036] 更優(yōu)選的，所述宿主系統(tǒng)為為大腸桿菌BL21 (DE3)或Rosetta(DE3)。
[0037] 優(yōu)選的，步驟（2)中，所述培養(yǎng)是將單菌落接種于添加有Kana+的LB液體培養(yǎng)基 中，37°C 200rpm培養(yǎng)12小時(shí)，作為種子菌；取種子菌接種于新鮮的培養(yǎng)基37°C培養(yǎng)至合適 菌密度后，加誘導(dǎo)劑，在20°C~37°C溫度下繼續(xù)培養(yǎng)12~20h。
[0038] 優(yōu)選的，步驟（3)中，所述離子交換層析具體方法是采用含有酸性基團(tuán)、磺酸基一 S03H、駿基一 C00H 等的凝膠介質(zhì)，例如 SP Sehparose，CM Sepharose，Capto S，Mono S 等， 對(duì)目的融合蛋白