一種具有殺蟲效果的dna片段及其在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用
【專利說明】-種具有殺蟲效果的DNA片段及其在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用
[0001]
技術(shù)領(lǐng)域： 本發(fā)明屬于生物轉(zhuǎn)基因技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種具有殺蟲效果的DNA片段及其在農(nóng)業(yè)上的 應(yīng)用。
[0002]
【背景技術(shù)】： 在20世紀(jì)80年代，人們已經(jīng)開始利用生物轉(zhuǎn)基因技術(shù)來進(jìn)行害蟲的防治以及抗蟲性 植物的培養(yǎng)，然而，時至今日抗蟲基因仍然以蘇云金芽孢桿菌毒素基因（Bt)為主，將該基因 轉(zhuǎn)入棉花中通過多年應(yīng)用發(fā)現(xiàn)，刺吸式害蟲如盲蝽蟓由次要害蟲逐步上升為主要害蟲，主 要因?yàn)樯鲜隹瓜x基因?qū)Υ涛娇谄骱οx的作用效果不明顯。同時，單一抗蟲基因的長期使 用可造成害蟲抗性的增加，也限制了此類抗蟲基因的進(jìn)一步應(yīng)用。因此，開發(fā)一種新型環(huán)保 高效的抗蟲基因或蛋白能夠有效補(bǔ)充這一空白。
[0003] 蜘蛛毒素由于可作用于靶細(xì)胞膜的離子通道，而昆蟲的離子通道相對保守，所以 其對昆蟲的作用具有廣譜的殺蟲性，對蜚蠊目、鞘翅目、雙翅目、鱗翅目、直翅目等害蟲均具 有抗蟲作用。但由于昆蟲的外表皮以及圍食膜的障礙，使蜘蛛毒素?zé)o法有效的進(jìn)入昆蟲體 內(nèi)/離子通道，直接影響其殺蟲效果，因此，在蜘蛛毒素的基礎(chǔ)上增加了殼多糖酶以及植物 凝集素，殼多糖酶可以突破昆蟲外表皮的障礙作用，植物凝集素可以和昆蟲圍食膜表面、消 化道上皮細(xì)胞的糖綴合物、或糖基化的消化酶等結(jié)合，誘發(fā)昆蟲消化道產(chǎn)生病灶而達(dá)到殺 蟲的目的。例如：現(xiàn)有技術(shù)公開號為CN103154022A的文獻(xiàn)中，將殼多糖酶通過分泌信號序 列連接于蜘蛛毒性序列上，蜘蛛毒素序列與植物凝集素序列連接上，來降低昆蟲外骨架的 保護(hù)作用，使蜘蛛毒素更好的作用于與昆蟲上，然而，將殼多糖酶與植物凝集素同時連接在 毒素蛋白的兩端會極大影響毒素的活性，因?yàn)榇蟛糠侄舅氐鞍椎淖饔梦稽c(diǎn)通常是在N端或 C端。另外，即使將毒素與殼多糖酶連接在凝集素的兩端，同樣也會影響凝集素蛋白的活性。 因此，現(xiàn)有技術(shù)很難發(fā)揮融合蛋白的作用。
[0004] 綜上，現(xiàn)有利用蜘蛛毒素序列進(jìn)行轉(zhuǎn)基因的方法不能充分發(fā)揮蜘蛛毒素的作用， 因此需要一種具有殺蟲效果的DNA片段，該片段既能夠?qū)崿F(xiàn)毒素蛋白序列對刺吸式害蟲以 及其他類害蟲具有良好的趨避殺蟲效果，也能夠保證該片段在基因轉(zhuǎn)入過程中的穩(wěn)定性。
[0005]

【發(fā)明內(nèi)容】
： 本發(fā)明一種具有殺蟲效果的DNA片段及其在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用是針對現(xiàn)有技術(shù)所存在的 一系列缺陷，將具有殺蟲作用的蜘蛛毒素序列和植物凝結(jié)素序列以特定的方式連接起來， 并添加輔助序列增加其表達(dá)量，形成一種具有殺蟲效果的DNA片段，該片段在植物、酵母等 各種宿主具有表達(dá)量高，廣譜性的特點(diǎn)。
[0006] 本發(fā)明技術(shù)技術(shù)方案如下： 1、一種具有殺蟲效果的DNA片段，其特征在于：所述一種具有殺蟲效果的DNA片段包 括：信號肽序列、毒素蛋白序列、植物凝集素序列以及輔助序列。
[0007] 2、根據(jù)技術(shù)方案1所述的DNA片段，其特征在于：所述一種具有抗蟲效果的DNA片 段還可以包括蛋白水解酶抑制基因。蛋白水解酶抑制劑基因如CPTI等，主要與蛋白酶分子 作用中心上的一些基團(tuán)結(jié)合，使昆蟲體內(nèi)的蛋白酶活力下降甚至消失，保護(hù)毒素蛋白不被 蛋白水解酶分解。
[0008] 3、根據(jù)技術(shù)方案1所述的DNA片段，其特征在于：所述輔助序列與毒素蛋白序列相 連接，毒素蛋白序列與植物凝集素序列相連接。其中，輔助序列不與植物凝集素連接，相關(guān) 序列的連接均需考慮到連接序列在翻譯后形成的氨基酸序列不影響毒素蛋白和植物凝集 素的空間結(jié)構(gòu)。當(dāng)前，現(xiàn)有技術(shù)多采用殼多糖酶與植物凝集素同時連接在毒素的兩端，然而 大部分的毒素蛋白的作用位點(diǎn)通常是在N端或C端，這種連接方式極大影響了毒素的活性。 此外，即使將毒素與殼多糖酶連接在凝集素的兩端，同樣也會影響凝集素蛋白的活性。因此 現(xiàn)有技術(shù)很難發(fā)揮融合蛋白的殺蟲作用。而采用本發(fā)明所用的額連接方式可充分發(fā)揮融合 蛋白殺蟲效果。
[0009] 4、根據(jù)技術(shù)方案1所述的DNA片段，其特征在于：所述毒素蛋白序列來源于蜘蛛毒 素蛋白或者與蜘蛛毒素蛋白具有功能等同的毒性蛋白；其中，蜘蛛毒素蛋白可來源于漏斗 網(wǎng)蜘蛛、狼蛛、黑腹櫛足蛛、悉尼漏斗網(wǎng)蜘蛛。蜘蛛毒素蛋白對于靶向昆蟲的神經(jīng)系統(tǒng)具有 損傷作用，但對哺乳動物、蜜蜂無毒，無害。
[0010] 5、根據(jù)權(quán)利要求4所述的DNA片段，其特征在于：所述毒素蛋白序列可選自SEQ 6、SEQ13、SEQ17、SEQ21，以及上述毒素蛋白序列80%以上同源的其他毒素蛋白中的一種或 者幾種組合物。
[0011] 6、根據(jù)技術(shù)方案1所述的DNA片段，其特征在于：所述的植物凝集素序列來源于雪 花蓮凝集素（GNA)或者與雪花蓮凝集素功能等同的植物凝集素。采用雪花蓮凝集素或者與 雪花蓮凝集素功能等同的植物凝集素克服了蜘蛛毒素易被昆蟲消化道中消化蛋白水解的 難題。與雪花凝集素功能等同的植物凝集素包括伴刀豆凝集素（ConA)、大蒜凝集素等植物 凝集素，上述植物凝集素對人、畜以及蜜蜂無害。
[0012] 7、根據(jù)技術(shù)方案1所述的DNA片段，其特征在于：其特征在于：所述的輔助序列具 有蛋白特異性，其中，輔助序列的選擇與其連接的毒素蛋白序列相關(guān)，輔助序列具有幫助毒 素蛋白折置，提尚蛋白活性的功能。
[0013] 其中，輔助序列可選自SEQ3、SEQ10、SEQ14、SEQ18序列，但不局限于上述序列。輔 助序列為特異性序列，與所用毒素蛋白相關(guān)，不同毒素蛋白輔助序列不同，根據(jù)技術(shù)方案5 提出的SEQ 6，SEQ13、SEQ17、SEQ21的毒素蛋白，其對應(yīng)的輔助序列分別為SEQ3、SEQ10、 SEQ14、SEQ18,該輔助序列具有幫助毒素蛋白折置，提尚蛋白活性的功能。該功能可使有效 毒素蛋白的表達(dá)量增加，同時，在DNA片段轉(zhuǎn)錄過程中本段序列被切掉，不增加該該融合片 段DNA的長度，減少了在通過細(xì)胞膜過程中斷裂的概率。
[0014] 8、一種具有抗蟲效果的DNA片段及其在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用，其特征在于：所述DNA片段 可轉(zhuǎn)錄翻譯成一種融合蛋白，所述融合蛋白對于靶標(biāo)昆蟲具有殺蟲效果。該融合蛋白主要 成分為毒素蛋白以及植物凝集素蛋白，使其本來不具有經(jīng)口活性的毒素蛋白具備了經(jīng)口的 殺蟲活性，本融合蛋白可作為殺蟲物質(zhì)的主要成分來進(jìn)行靶標(biāo)害蟲的防治。
[0015] 9、一種具有抗蟲效果的DNA片段及其在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用，其特征在于：將DNA片段與 植物啟動子構(gòu)建的DNA片段組合物轉(zhuǎn)入植物體內(nèi)表達(dá)形成抗性植物，所述抗性植物對靶標(biāo) 昆蟲具有一定的抗性。
[0016] 10、根據(jù)技術(shù)方案8所述的應(yīng)用，其特征在于：所述植物啟動子包括：CaMV35S啟動 子、泛素啟動子、actin啟動子、Nos啟動子以及特異性表達(dá)啟動子，其中特異性表達(dá)啟動子 包括：韌皮部特異性啟動子RSsl、葉部特異性啟動子rbcS啟動子。以上植物啟動子均為非 花表達(dá)的啟動子，避免了該段DNA片段在植物花部位的表達(dá)而造成的花粉逸散，降低了轉(zhuǎn) 基因污染的風(fēng)險。
[0017] 11、根據(jù)技術(shù)方案9所述的應(yīng)用，其特征在于：所述植物包括小麥，玉米，煙草，水 稻，油菜，高粱，馬鈴薯，番前，大麥，豆科作物，棉花。
[0018] 12、根據(jù)技術(shù)方案8或9所述的應(yīng)用，其特征在于：所述靶標(biāo)昆蟲的種類包括半翅 目昆蟲、同翅目昆蟲、鱗翅目昆蟲、鞘翅目昆蟲。
[0019] 13、根據(jù)技術(shù)方案12所述的應(yīng)用，其特征在于：所述靶標(biāo)昆蟲具體包括盲蝽蟓、桃 蚜、豌豆蚜、棉蚜、麥長管蚜、甘藍(lán)夜蛾以及馬鈴薯甲蟲。
[0020] 綜上所述：本發(fā)明將蜘蛛毒素蛋白序列和植物凝集素蛋白序列融合成具有殺蟲效 果的DNA序列的過程，去除殼多糖酶的序列，同樣實(shí)現(xiàn)了其害蟲滅殺的效果，也避免了由于 序列過長而造成轉(zhuǎn)入、表達(dá)以及發(fā)揮作用的不穩(wěn)定。本發(fā)明采用輔助序列與毒素蛋白序列 連接，幫助毒素蛋白序列折疊，提高毒素蛋白的活性，同時，該輔助基因不增加轉(zhuǎn)入目標(biāo)序 列的長度，進(jìn)一步保證了基因表達(dá)和發(fā)揮作用的穩(wěn)定性。關(guān)于本發(fā)明在農(nóng)業(yè)害蟲防治上的 應(yīng)用：一、可以將本發(fā)明的DNA序列轉(zhuǎn)錄翻譯成融合蛋白，將融合蛋白作為殺蟲劑的主要成 分，來進(jìn)行害蟲的防治。二、可將DNA序列轉(zhuǎn)入植物中，從而開發(fā)出抗蟲性的作物。
【附圖說明】：
[0021] 圖1為示意性示出本發(fā)明所述實(shí)施例1的實(shí)驗(yàn)結(jié)果的電泳圖；
【具體實(shí)施方式】： 通過實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，實(shí)施例不應(yīng)該當(dāng)作對本發(fā)明的限制。
[0022] 實(shí)施例1: 本發(fā)明在陸地棉的植物轉(zhuǎn)化中進(jìn)行表達(dá)選擇序列片段1，3, 5, 7依次連接，形成本發(fā)明 所述的DNA片段。棉花轉(zhuǎn)基因方法請參考transgenic cotton methods and protocols ( edited by Baohong zhang)，以CaMV35S啟動子為本發(fā)明啟動子，連同目的基因構(gòu)建到載體 PCHMBIA2300中，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的組織培養(yǎng)法完成轉(zhuǎn)基因過程，該方法非常成熟已經(jīng)發(fā)展 為本領(lǐng)域公知，