026] 真核表達(dá)載體可以是任何適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體，包括但不限于pCMV-Myc表達(dá)載體、 pcDNA3. 0表達(dá)載體、pcDNA3. 1表達(dá)載體、pEGFP表達(dá)載體、pEFBos表達(dá)載體、pTet表 達(dá)載體、PTRE表達(dá)載體、或者在公知表達(dá)載體的基礎(chǔ)上經(jīng)改造的載體，比如pBin438、 PCAMBIA1301 等。
[0027] 在本發(fā)明的上下文中，ALKBH2基因表達(dá)產(chǎn)物包括人ALKBH2蛋白以及人ALKBH2蛋 白的部分肽。所述ALKBH2蛋白的部分肽含有與缺血性腦卒中相關(guān)的功能域。
[0028] "ALKBH2蛋白"包括ALKBH2蛋白以及ALKBH2蛋白的任何功能等同物。所述功能 等同物包括ALKBH2蛋白保守性變異蛋白質(zhì)、或其活性片段，或其活性衍生物，等位變異體、 天然突變體、誘導(dǎo)突變體、在高或低的嚴(yán)緊條件下能與人ALKBH2的DNA雜交的DNA所編碼 的蛋白質(zhì)。
[0029] 優(yōu)選地，ALKBH2蛋白是具有下列氣基酸序列的蛋白質(zhì)：
[0030] (1)由序列表中SEQIDN0. 2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；
[0031] (2)將SEQIDN0. 2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或 缺失和/或添加且與SEQIDN0. 2所示的氨基酸序列具有相同功能的由SEQIDN0. 2所示 的氨基酸序列衍生的蛋白質(zhì)。取代、缺失或者添加的氨基酸的個(gè)數(shù)通常為1-50個(gè)，較佳地 1-30個(gè)，更佳地1-20個(gè)，最佳地1-10個(gè)。
[0032] (3)與SEQIDN0. 2所示的氨基酸序列具有至少80%同源性（又稱為序列同一 性），優(yōu)選地，與SEQIDN0. 2所示的氨基酸序列至少約90%至95%的同源性，常為96%、 97 %、98 %、99 %同源性的氨基酸序列構(gòu)成的多肽。
[0033] 在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，所述ALKBH2蛋白是具有SEQIDN0.2所示的氨基酸 序列的蛋白質(zhì)。
[0034] 通常，已知的是，一個(gè)蛋白質(zhì)中一個(gè)或多個(gè)氨基酸的修飾不會(huì)影響蛋白質(zhì)的功能。 本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)認(rèn)可改變單個(gè)氨基酸或小百分比的氨基酸或?qū)Π被嵝蛄械膫€(gè)別添加、 缺失、插入、替換是保守修飾，其中蛋白質(zhì)的改變產(chǎn)生具有相似功能的蛋白質(zhì)。提供功能相 似的氨基酸的保守替換表是本領(lǐng)域公知的。
[0035] 通過添加一個(gè)氨基酸或多個(gè)氨基酸殘基修飾的蛋白質(zhì)的例子是ALKBH2蛋白的 融合蛋白。對于與ALKBH2蛋白融合的肽或者蛋白質(zhì)沒有限制，只要所得的融合蛋白保留 ALKBH2蛋白的生物學(xué)活性即可。
[0036] 本發(fā)明的ALKBH2蛋白也包括對SEQIDN0. 2所示的氨基酸序列的非保守修飾，只 要經(jīng)過修飾的蛋白質(zhì)仍然能夠保留ALKBH2蛋白的生物學(xué)活性即可。在此類修飾蛋白質(zhì)中 突變的氨基酸數(shù)目通常是10個(gè)或者更少，例如6個(gè)或者更少，例如3個(gè)或者更少。
[0037] 在本發(fā)明的上下文中，"診斷缺血性腦卒中"既包括判斷受試者是否已經(jīng)患有缺血 性腦卒中、也包括判斷受試者是否存在患有缺血性腦卒中的風(fēng)險(xiǎn)。
[0038] 在本發(fā)明的上下文中，"治療缺血性腦卒中"包括能消除、減輕、緩解、逆轉(zhuǎn)或預(yù)防 或延遲病癥的任何癥狀的發(fā)生和復(fù)發(fā)，即包括對疾病的治療性干預(yù)和預(yù)防性干預(yù)。
[0039] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和有益效果：
[0040] 本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)了ALKBH2基因表達(dá)與缺血性腦卒中相關(guān)，通過檢測受試者血液 中ALKBH2的表達(dá)，可以判斷受試者是否患有缺血性腦卒中、或者判斷受試者是否存在患有 缺血性腦卒中的風(fēng)險(xiǎn)，從而指導(dǎo)臨床醫(yī)師給受試者提供預(yù)防方案或者治療方案。
[0041] 本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了一種缺血性腦卒中的新的分子標(biāo)記物-ALKBH2基因，相比傳統(tǒng)的檢 測手段，基因診斷更及時(shí)、更特異、更靈敏，能夠?qū)崿F(xiàn)缺血性腦卒中的早期診斷，從而降低缺 血性腦卒中的死亡率。
【附圖說明】
[0042] 圖1顯示利用QPCR檢測ALKBH2基因在缺血性腦卒中患者中的表達(dá)情況；
[0043] 具體的實(shí)施方式
[0044] 下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。以下實(shí)施例僅用于說明本 發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條 件，例如Sambrook等人，分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊（NewYork:ColdSpringHarborLaboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0045] 實(shí)施例1篩選與缺血性腦卒中相關(guān)的基因標(biāo)志物
[0046] 1、樣品收集
[0047] 各收集10例正常人血液和缺血性腦卒中患者血液樣本，上述所有標(biāo)本的取得均 通過倫理委員會(huì)的同意。
[0048] 2、RNA樣品的制備及質(zhì)量分析
[0049] 2. 1RNA樣品的制備
[0050] 使用Promega公司的RNA提取試劑盒提取總RNA。具體步驟如下：
[0051] 1)取1ml收集在肝素或EDTA處理過的試管中的全血，放進(jìn)無菌離心管中；
[0052] 2)收集血細(xì)胞：3000rpm(400g)離心5min，小心地從樣品頂部吸走上清；
[0053] 3)加1ml血細(xì)胞裂解液，小心吸放4-5次，重懸沉淀物；
[0054] 4) 3000rpm離心 5min;
[0055]5)重復(fù)步驟3)、4)兩次（共三次）；
[0056] 6)避開細(xì)胞沉淀物，小心吸走幾乎所有上清，只保留100μ1上清液；確認(rèn)一下BME 已經(jīng)加到RNA裂解液中，然后加175μ1RNA裂解液到細(xì)胞中，吸放重懸并裂解細(xì)胞；
[0057] 7)加350μ1RNA稀釋液，顛倒混合3-4次；
[0058] 8)置于70°C水浴中 3min;
[0059] 9)室溫下13000g離心lOmin;
[0060] 10)將清亮裂解物轉(zhuǎn)移到一支無菌離心管中；
[0061] 11)向澄清裂解液中加入200μ1 95%乙醇，用移液槍吸放3-4次以混合；將此混 合物轉(zhuǎn)移到離心柱裝配體中，13000g離心lmin;
[0062] 12)從離心柱裝配體上拿下離心柱，棄去收集管中的液體，將離心柱裝回到收集管 上，確認(rèn)一下RNAWashSolution已用乙醇稀釋，加600μ1RNA洗滌液于離心柱裝配體， 13000g離心lmin;
[0063] 13)棄去收集管中的液體，將離心柱裝回到收集管上，將50μ1新鮮制備的DNase 孵育混合物直接加到離心柱內(nèi)的膜上；
[0064] 14)室溫下孵育15min，向離心柱中加入200μ1DNA酶終止緩沖液（確認(rèn)已加入 乙醇），13000g離心lmin;
[0065]15)加入600 μ1RNA洗滌液（已加入乙醇），13000g，離心lmin ;
[0066] 16)清空收集管，向離心柱內(nèi)加入250μ1RNA洗滌液（已加入乙醇），高速離心 2min；
[0067] 17)將離心柱從收集管上轉(zhuǎn)移到洗脫管上，向膜上加100μ1無核酸酶水，將離心 柱裝配體放進(jìn)離心機(jī)并使洗脫管的蓋子朝外，13000g離心lmin，丟棄離心柱，蓋好盛有RNA 的洗脫管，存于-70 °C。
[0068] 2. 2RNA樣品的質(zhì)量分析（NanoDroplOOO分光光度計(jì)）
[0069] NanoDroplOOO分光光度計(jì)檢測RNA樣品，RNA-seq測序的樣品要求：0D260/0D280 為 1. 8-2. 2〇
[0070] 2. 3RNA樣品的質(zhì)量分析（Agilent Technologies 2100Bioanalyzer)
[0071] 將上述提取的RNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，Agilent Technologies 2100Bioanalyzer檢測RNA樣品質(zhì)量，觀察28S rRNA和18S rRNA主帶明顯、無降解、RNA完 整性指數(shù)合格、濃度達(dá)到要求的符合RNA-seq測序cDNA文庫構(gòu)建的要求，可以用于文庫構(gòu) 建及測序。
[0072] 3、高通量轉(zhuǎn)錄組測序
[0073] 3.lRNA-seq讀段定位
[0074]首先將低質(zhì)量的讀段去除得到清潔讀段，然后利用TopHatvl. 3. 1將清潔片段與 UCSCH.sapiens參考基因組（hgl9)進(jìn)行匹配，H.sapiensUCSChgl9版的預(yù)先構(gòu)建的索引 從Top