一種檢測(cè)rs9263726等位基因的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物技術(shù)和基因診斷領(lǐng)域，具體涉及一種檢測(cè)rs9263726等位基因的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]當(dāng)多種原因引起血液中尿酸濃度升高、細(xì)胞外液的尿酸鹽呈現(xiàn)超飽和時(shí)，就會(huì)發(fā)生高尿酸血癥，若尿酸鹽在機(jī)體組織中沉積造成進(jìn)一步損害，則轉(zhuǎn)變?yōu)橥达L(fēng)，表現(xiàn)為患者關(guān)節(jié)活動(dòng)受限、熱、痛、腫，伴有關(guān)節(jié)畸形、結(jié)節(jié)性痛風(fēng)結(jié)石甚至腎臟病變，給痛風(fēng)患者帶來(lái)極大痛苦(Smith et al.,2011)o高尿酸血癥和原發(fā)性痛風(fēng)的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)的高尿酸血癥患者人數(shù)已達(dá)1.2億，其中痛風(fēng)患者超過(guò)7500萬(wàn)人，并且正以每年9.7%的年增長(zhǎng)率迅速增加，呈現(xiàn)出年輕化趨勢(shì)，痛風(fēng)已經(jīng)成為我國(guó)僅次于糖尿病的第二大代謝類疾病(張心菊等，2014)。痛風(fēng)的治療原則除了嚴(yán)格的低嘌呤飲食、戒酒之外，消炎止痛藥和控制尿酸藥物的使用也是必不可少的。
[0003]在痛風(fēng)發(fā)病間期和慢性期，通常使用降尿酸藥物治療。2012年11月，美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)(American College of Rheumatology, ACR)發(fā)布了最新的痛風(fēng)指南(Khanna Det al.，2012)，其中“降尿酸藥物治療建議”中推薦將別嘌醇(Allopurinol)或非布索坦(Febuxostat)作為一線降尿酸用藥。鑒于非布索坦是2009年上市的新藥，雖然療效顯著，但其長(zhǎng)期服用的安全性以及對(duì)4期及以上程度的慢性腎臟疾病患者的安全性尚未得到證實(shí)。而自上世紀(jì)六十年代起就推向臨床的別嘌醇價(jià)格低廉、療效明確，因此具有更好的應(yīng)用前景。
[0004]別嘌醇是一種黃嘌呤氧化酶抑制劑，通過(guò)抑制該酶的活性，減少次黃嘌呤和黃嘌呤合成尿酸，從而減少尿酸的生成，使血和尿中的尿酸含量減低到溶解度以下水平，防止尿酸形成結(jié)晶沉積在其他組織內(nèi)，被廣泛用于痛風(fēng)、高尿酸血癥的治療中，還可預(yù)防白血病、淋巴瘤或其他腫瘤在化療或放療后繼發(fā)組織內(nèi)尿酸鹽沉積、腎結(jié)石，尤其適用于尿酸生成過(guò)多、對(duì)排尿酸藥過(guò)敏或無(wú)效，以及不宜使用排尿酸藥物(如有腎功能不全)的患者(Hamburger M et al.，2011)。但2%-5%患者服用別嘌醇后會(huì)發(fā)生皮膚反應(yīng)(Hoskison TK et al.，2006)，雖然只有少于 I % 患者(Pluim H J et al., 1998 ；Kim S C et al., 2013)會(huì)轉(zhuǎn)變?yōu)榘?Stevens-Johnson 綜合征(Stevens-Johnson syndrome, SJS)、中毒性表皮壞死松解癥(toxic epidermal necrolysis，TEN)和剝脫性皮炎在內(nèi)的重癥藥疹，但是死亡率極高，其中SJS死亡率約5%，TEN死亡率約30-50% (Gerull R et al., 2011) 0 SJS表現(xiàn)為嚴(yán)重的多形性紅斑，可累及皮膚與粘膜，包括口、鼻、眼、陰道、尿道、胃腸道和下呼吸道粘膜，患者有失明之虞，可進(jìn)一步發(fā)展形成TEN，全身黏膜潰爛，在紅斑上發(fā)生松弛性大泡或表皮剝離，若遇輕度觸碰或牽拉可導(dǎo)致表皮大面積剝離(Aubock&Fritsch, 1982 ；Arellano&Sacristan, 1993)。因此，目前別嘌醇在臨床上的使用面臨極大的醫(yī)療風(fēng)險(xiǎn)。
[0005]美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)最新發(fā)布的2012痛風(fēng)指南(Khanna D et al., 2012)中建議在HLA-B*5801分布頻率較高且與重癥藥疹關(guān)系密切的國(guó)家(如中國(guó)和韓國(guó))，服用別嘌醇前需進(jìn)行HLA-B*5801等位基因檢測(cè)，以作為別嘌醇誘發(fā)重癥藥疹的篩查指標(biāo)，判斷該患者是否是別嘌呤醇所致重癥藥疹的高危人群。此項(xiàng)檢測(cè)的推出可以有效降低由別嘌醇引起的嚴(yán)重不良反應(yīng)，讓痛風(fēng)患者放心服用別嘌醇。但鑒于HLA-B多態(tài)性位點(diǎn)的復(fù)雜性，HLA-B*5801檢測(cè)方法操作繁瑣、干擾因素多，且可能由于罕見(jiàn)或未知HLA等位基因的干擾導(dǎo)致結(jié)果模棱兩可難以判讀。
[0006]2012年，日本學(xué)者M(jìn)aekawa等人(Maekawa K et al.，2012)發(fā)現(xiàn)，PS0RS1C1 基因上的 rs9263726 等位基因(G>A)與 HLA_B*5801 呈現(xiàn)完全連鎖(r2= 1，D’ = I)，即 rs9263726基因型為GA或AA型的人群，必定為HLA-B*5801等位基因攜帶者，反之亦然。這個(gè)發(fā)現(xiàn)意味著可以使用rs9263726等位基因的基因型，替代HLA_B*5801成為別嘌醇誘發(fā)重癥藥疹的預(yù)測(cè)指標(biāo)，進(jìn)行別嘌醇的個(gè)體化用藥指導(dǎo)。
[0007]目前，篩查已知SNP常用檢測(cè)方法有TaqMan探針?lè)?、測(cè)序、基因芯片、限制性酶切片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)等多種技術(shù)。但各有缺點(diǎn)，如TaqMan探針?lè)ㄒ资艿酱郎y(cè)位點(diǎn)周圍臨近的SNP位點(diǎn)的干擾，且價(jià)格昂貴；基因芯片不適宜小樣本、少數(shù)SNP位點(diǎn)的檢測(cè)；測(cè)序雖然是核苷酸檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)，但成本較高，周期長(zhǎng)，不適合向臨床推廣；而RFLP僅能檢測(cè)有酶切位點(diǎn)的SNP，無(wú)酶切位點(diǎn)不能檢測(cè)，且要用到電泳方法，靈敏度有限，對(duì)環(huán)境有污染。
[0008]因此，迫切需要建立一種操作簡(jiǎn)便、不受其他位點(diǎn)干擾的rs9263726檢測(cè)方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明的目的是建立一種快速、廉價(jià)、簡(jiǎn)便、高特異性、不受臨近SNP位點(diǎn)干擾的rs9263726等位基因檢測(cè)方法。
[0010]本發(fā)明提供的rs9263726等位基因檢測(cè)方法，首先通過(guò)Sanger測(cè)序方法對(duì)大樣本中國(guó)健康人群的rs9263726等位基因上游200bp與下游200bp序列進(jìn)行測(cè)序，構(gòu)建該位點(diǎn)該區(qū)域內(nèi)的多態(tài)性位點(diǎn)分布數(shù)據(jù)庫(kù)。測(cè)序發(fā)現(xiàn)位于PS0RS1C1基因的rs9263726位點(diǎn)(NG_021348.l:g.28892G>A)，其附近位置密布SNP和發(fā)生頻率較高的突變或缺失，包括已經(jīng)被報(bào)道的 2 種 SNP 位點(diǎn) rs3132557(NG_021348.l:g.28802T>C)和 rs9501057 (NG_021348.l:g.289090T)，以及尚未報(bào)道的 NG_021348.1: g.28852C>A、NG_021348.1: g.28999A>G、NG_021348.l:g.29036G>A、NG_021348.l:g.28900del C 和 NG_021348.l:g.28900 ins C共5種點(diǎn)突變和插入缺失突變。其中，最近的突變點(diǎn)距離待測(cè)位點(diǎn)rs9263726僅間隔7個(gè)堿基，且自待測(cè)點(diǎn)后第二個(gè)堿基起存在連續(xù)7個(gè)胞嘧啶(C)。這些特殊情況導(dǎo)致采用普通Taqman探針檢測(cè)rs9263726時(shí)，探針容易錯(cuò)配，從而干擾正常檢測(cè)。并且若要達(dá)到區(qū)分rs9263726等位基因型是GG、GA還是AA型的目的，必須設(shè)計(jì)2條Taqman探針才能實(shí)現(xiàn)，增加了檢測(cè)量和檢測(cè)成本。本發(fā)明根據(jù)rs9263726周圍干擾位點(diǎn)分布特點(diǎn)，以HRM法為基礎(chǔ)，采用unlabeled probe探針，對(duì)待測(cè)位點(diǎn)進(jìn)行精確區(qū)分，可做到既能準(zhǔn)確辨別rs9263726的GG、GA和AA基因型，又能同時(shí)顯示鄰近干擾位點(diǎn)突變情況，并且整個(gè)反應(yīng)僅使用了 I條探針進(jìn)行I次擴(kuò)增即可完成，方便、快捷，準(zhǔn)確度高。
[0011]具體地，為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:
[0012]—種檢測(cè)rs9263726等位基因的方法，其特征在于，包括以下步驟:
[0013]步驟一，從全血中抽提DNA ；
[0014]步驟二，以步驟一提取的DNA為樣本DNA進(jìn)行不對(duì)稱PCR擴(kuò)增；
[0015]步驟三，擴(kuò)增結(jié)束后，加入熒光染料SYTO 9，在高分辨率PCR儀上檢測(cè)熔解溫度，分析溫度上升時(shí)樣本熒光信號(hào)的變化；
[0016]步驟四，對(duì)待測(cè)樣本rs9263726的基因型進(jìn)行分析；
[0017]其中，所述步驟二中PCR擴(kuò)增中的探針為:
[0018]5’ -CTCCGAGGAAACTCATCCCCCC-PH0-3’
[0019]引物為:
[0020]上游引物:5，-ACCCCAGCTTTACAAGGACCC-3’
[0021]下游引物:5’ -GCTCCATGTGGCAAAGTCGGTCA-3 ’。
[0022]為了優(yōu)化上述技術(shù)方案，本發(fā)明所采取的技術(shù)措施還包括:
[0023]上述步驟二中PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系優(yōu)選為:10 μ I Premix Taq HS，2 μ M上游引物0.5 μ 1，10 μ M下游引物R 0.5 μ 1，探針0.5 μ I (10 μ Μ)，25ng樣本DNA，以及將體系總體積加至20 μ I的水。
[0024]上述步驟二中PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為:95 °C預(yù)變性2min，95 V 30s，55 V 30s，72°C 30s，50 個(gè)循環(huán)。
[0025]上述步驟三中的檢測(cè)恪解溫度的反應(yīng)條件和操作優(yōu)選為:95°C lmin，40°C Imin預(yù)處理后，熔解溫度從55°C升至90°C，每升高0.5°C采集一次數(shù)據(jù)，獲得高分辨率熔解曲線圖。
[0026]上述探針在3 ’端作磷酸化封閉。
[0027]本發(fā)明采用上述技術(shù)方案，與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下技術(shù)效果:
[0028]本發(fā)明在PCR完成后再加入飽和熒光染料SYTO 9，放大擴(kuò)增信號(hào)、減少熒光對(duì)PCR的抑制作用；本發(fā)明的方法根據(jù)大樣本測(cè)序發(fā)現(xiàn)的rs9263726周圍