一種乳腺癌pik3ca突變基因及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種乳腺癌中PIK3CA突變基因及其在輔助 制備乳腺癌診斷試劑中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 乳腺癌，所有女性和家庭的夢(mèng)魘。全球腫瘤流行病統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)（GL0B0CAN)顯示每 年約有130萬(wàn)婦女患乳腺癌，45. 8萬(wàn)人死于乳腺癌，無(wú)論是發(fā)達(dá)國(guó)家還是發(fā)展中國(guó)家，乳 腺癌都是全世界婦女目前面臨的最為常見(jiàn)的惡性腫瘤，也是引起女性死亡的重要病因。自 90年代以來(lái)，中國(guó)的乳腺癌發(fā)病率增長(zhǎng)速度是全球的2倍多，每年中國(guó)乳腺癌新發(fā)數(shù)量和 死亡數(shù)量分別占全世界的12. 2%和9. 6%1。目前，乳腺癌是中國(guó)女性發(fā)病率最高的癌癥，癌 癥死亡原因位居第六，且年輕化趨勢(shì)顯著，預(yù)計(jì)到2021年，中國(guó)乳腺癌患者將高達(dá)250萬(wàn) (Fan，L.etal. 2014)。雖然早期檢查及診斷技術(shù)的提高，手術(shù)及綜合輔助治療的進(jìn)步， 使得患者的預(yù)后有較明顯改善，但是總生存率并不理想（IndependentUKPanelonBreast CancerScreening. 2012)。對(duì)于特定的分子亞型，由于對(duì)藥物的原發(fā)或繼發(fā)耐藥、甚至 缺乏特定的治療祀點(diǎn)，使得部分中晚期病人缺乏有效的治療手段（Garcia-Closas,M.et al. 2014)。因此，尋找發(fā)生有效的腫瘤標(biāo)志物對(duì)于提高乳腺癌的診斷和預(yù)測(cè)發(fā)生、發(fā)展及 改善預(yù)后具有重要的臨床指導(dǎo)意義。
[0003] 腫瘤標(biāo)志物可以有效地作為臨床診斷依據(jù)，可以監(jiān)聽(tīng)高位人群、早期診斷、指導(dǎo)治 療、判斷治療療效、檢測(cè)復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移，是腫瘤患者的重要檢查指標(biāo)。乳腺癌是一種全身性疾 病、其發(fā)生和發(fā)展是一個(gè)涉及多因素、多環(huán)節(jié)的復(fù)雜過(guò)程，包括癌基因的激活以及抑癌基因 的失活等。因此，基因突變?cè)谌橄侔┑陌l(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起著非常重要的作用。PIK3CA基因 是近年來(lái)被發(fā)現(xiàn)除P53突變和Her-2擴(kuò)增之外最常見(jiàn)和最重要的乳腺癌中的突變基因，突 變比率高達(dá)40%，其突變可導(dǎo)致多條信號(hào)通路在不同水平發(fā)生調(diào)控異常，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞 的增殖和存活（Bachman,Κ·E.etal· 2004)。
[0004] 磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K)是一種可使肌醇環(huán)第三位羥基磷酸化的磷脂酰肌醇 激酶，具有磷脂酰肌醇激酶和絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶雙重活性（Fruman，D.A.etal. 2014)，調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、存活、迀移、凋亡和細(xì)胞周期等多種生物學(xué)功能。PIK3CA基因編碼 IA類(lèi)PI3K催化亞單位ΡΙΙΟα，其定位于3q26. 3,包含21個(gè)外顯子（Volinia，S.etal. 1994)。KANGS等研究發(fā)現(xiàn)，PIK3CA基因在多種腫瘤中扮演著癌基因的角色，約30%的人類(lèi) 實(shí)體瘤存在PIK3CA基因的突變，其中80%-90%的突變發(fā)生在該基因的第9和第20外顯子， 分別對(duì)應(yīng)該酶的螺旋區(qū)和激酶區(qū)。該區(qū)域的改變引起PIK3CA過(guò)表達(dá)、P110α活性增加，進(jìn) 而激活下游ΑΚΤ等信號(hào)分子，導(dǎo)致成纖維細(xì)胞和乳腺上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)化，并抑制細(xì)胞 凋亡，最終導(dǎo)致腫瘤發(fā)生（Vivanco，I.etal. 2002)?，F(xiàn)有研究顯示，應(yīng)用PCR或基因測(cè) 序的方法檢測(cè)組織中PIK3CA基因的突變情況，可提高腫瘤診斷的敏感性；PIK3CA基因突變 的腫瘤細(xì)胞對(duì)PI3K抑制劑更敏感，特異性地針對(duì)PIK3CA突變的靶向治療可有效降低惡性 腫瘤的發(fā)病率和死亡率。盡管PIK3CA突變對(duì)乳腺癌的診治及預(yù)后的影響還需進(jìn)一步研究， 但從目前已有的研究數(shù)據(jù)可以看出PIK3CA高頻突變和突變熱點(diǎn)區(qū)域的發(fā)現(xiàn)對(duì)于乳腺癌基 因診斷以及靶向治療的選擇具有重要的臨床意義。
[0005]S553fs*7突變是PIK3CA基因突變之一，然而關(guān)于PIK3CA基因S553fs*7突變?cè)谌?腺癌中尚未被報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種乳腺癌中PIK3CA突變基因，該突變基因具有 c. 1658_1659GT>C突變位點(diǎn)，其核苷酸序列如SEQIDN0 :1所示，乳腺癌PIK3CA突變基因 編碼的突變蛋白S553fs*7氨基酸序列如SEQIDN0 :2所示。
[0007] 該突變蛋白具有圖5所示的三維空間結(jié)構(gòu)。
[0008] 本發(fā)明另一目的是將上述乳腺癌中PIK3CA突變基因作為一種分子標(biāo)記，即作為 檢測(cè)乳腺癌的分子標(biāo)記物。
[0009] 本發(fā)明還可將將乳腺癌PIK3CA突變基因應(yīng)用在制備乳腺癌臨床診斷產(chǎn)品中； 進(jìn)一步地，在于提供一套檢測(cè)PIK3CA基因突變的引物組合，一對(duì)特異擴(kuò)增PIK3CA基因 9號(hào)外顯子的正向引物和反向引物，其正向引物的核苷酸序列如SEQIDN0 :3所示，反向引 物的核苷酸序列如SEQIDN0 :4所示。
[0010] 本發(fā)明將乳腺癌PIK3CA突變基因應(yīng)用在制備用于乳腺癌臨床診斷的檢測(cè)試劑盒 中，所述試劑盒包括核苷酸序列如SEQIDN0:3和SEQIDN0:4所示的引物。
[0011] 所述試劑盒組分包含下列組分中的一種或幾種：聚合酶、PCR反應(yīng)緩沖液、正反向 引物，純水。
[0012] 上述PCR反應(yīng)總體系為25yL:其中，PfuMix混合液12.5yL，所述正向引物 (5μM)的體積1μL，反向引物（5μM)的體積1μL，所述DNA模板1μL，其余為純水。PCR 反應(yīng)條件為：①94°C，5min預(yù)變性；②94°C，30s變性；③55°C，30s退火；④72°C，35s延伸； 循環(huán)②至④35次；⑤72°C，5min。
[0013] 通過(guò)對(duì)乳腺癌組織、癌旁組織及正常人血液樣本中PIK3CA基因突變檢測(cè)，本發(fā)明 首次發(fā)現(xiàn)了乳腺癌中PIK3CA基因S553fs*7突變，其對(duì)于臨床乳腺癌早期篩查、指導(dǎo)臨床用 藥以及監(jiān)測(cè)腫瘤預(yù)后具有很好的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。
【附圖說(shuō)明】
[0014] 圖1是本發(fā)明PIK3CA基因9號(hào)外顯子突變分布情況示意圖； 圖2是本發(fā)明不同樣本中PIK3CA基因第9外顯子S553fs*7突變測(cè)序圖； 圖3是本發(fā)明不同樣本中PIK3CA基因第9外顯子S553fs*7突變比率； 圖4是本發(fā)明PIK3CA基因結(jié)構(gòu)域示意圖； 圖5是本發(fā)明PIK3CA基因S553fs*7突變前后空間構(gòu)象對(duì)比圖。
【具體實(shí)施方式】
[0015] 下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明。以下實(shí)施例僅用于說(shuō)明本 發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍，該領(lǐng)域的技術(shù)人員可以根據(jù)上述本
【發(fā)明內(nèi)容】
對(duì)本發(fā)明做 出一些非本質(zhì)的改進(jìn)和調(diào)整。下述實(shí)施例中，若非特異表明，所用試劑均為分析純，所有試 劑均可從商業(yè)渠道獲得，百分比均為質(zhì)量百分比。文中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按 照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》中所述常規(guī)條件，或試劑制造廠商所建議的條件實(shí)施。除非另行定 義，文中所使用的所有專(zhuān)業(yè)和科學(xué)用語(yǔ)與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。
[0016] 實(shí)施例1:乳腺癌及癌旁組織中DNA提取 1、 實(shí)驗(yàn)材料 TES緩沖液(將一個(gè)50mL離心管洗干凈，高溫高壓滅菌后，加入0. 5mL1M的Tris-HCLlmL0. 5M的EDTA和2. 5mL的10%SDS，加超純水補(bǔ)足到50mL，調(diào)PH=8. 0后室溫 保存)，20mg/mL蛋白酶K，3M醋酸鈉（pH=5. 2)，TEBuffer，苯酸，氯仿，異戊醇，無(wú)水乙醇，TE 溶液。
[0017] 2、實(shí)驗(yàn)方法 2. 1組織塊解凍，剪取約0. 5g組織，放入1. 5mL離心管中，剪碎； 2. 2加入0· 45mL