一種無(wú)乳鏈球菌的gshF基因的突變基因及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，涉及一種通過(guò)定向進(jìn)化手段獲得源于無(wú)乳鏈球菌 Streptococcus agalactiae ATCC-BAA611的谷胱甘肽合成酶基因gshF基因的突變基因，以 及在構(gòu)建畢赤酵母和釀酒酵母谷胱甘肽生產(chǎn)菌株中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 谷胱甘肽（L-Glutathione)是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸縮合形成的生物活性 三肽，全稱為5-L-谷氨酰-L-半胱氨酰甘氨酸。
[0003] 在細(xì)胞內(nèi)，谷胱甘肽主要以還原型谷胱甘肽（GSH)和氧化型谷胱甘肽（GSSG)兩種 形式存在，其中主要以還原型為主。谷胱甘肽具有游離的巰基和很強(qiáng)的供電子或質(zhì)子氫的 能力，因此谷胱甘肽具有重要的生理功能：（1)作為胞內(nèi)最豐富的抗氧化劑，保護(hù)DNA、蛋白 質(zhì)和其它生物分子抵抗氧化損傷；(2)通過(guò)谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶完成對(duì)外源物質(zhì)的解毒作 用；（3)參與氨基酸的吸收及轉(zhuǎn)運(yùn)；(4)參與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，維持細(xì)胞正常生命活動(dòng)，其代謝 異常可導(dǎo)致細(xì)胞病變?nèi)缋w維化；(5)調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞的功能，發(fā)揮抗病毒作用。因此，谷胱甘 肽在醫(yī)藥、食品和化妝品等行業(yè)有著廣泛的應(yīng)用。
[0004] GSH含有氨基、羧基、巰基和酰胺等多種給電子配位基團(tuán)，可以和細(xì)胞內(nèi)的有毒金 屬咼子結(jié)合，從而起到解毒作用。大量的研究證明，有毒的金屬咼子（如Hg2+、Cu2+、Cd2+、 Ni2+)能使細(xì)胞內(nèi)的GSH的含量大大降低。有毒金屬離子通過(guò)和GSH結(jié)合排除體外，對(duì)金屬 離子細(xì)胞毒性起到保護(hù)作用。因此，近年來(lái)對(duì)GSH與金屬離子的相互作用的研究越來(lái)越受 到重視。
[0005]目前，谷胱甘肽（GSH)的生產(chǎn)方法主要有化學(xué)合成法、固定化細(xì)胞法、酶法和發(fā)酵 法?；瘜W(xué)合成法生產(chǎn)GSH工藝已較成熟，但存在成本高、反應(yīng)步驟多、反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)、操作復(fù) 雜、需光學(xué)拆分且存在環(huán)境污染等問(wèn)題；酶法生產(chǎn)谷胱甘肽需要獲得相關(guān)的酶系，需要消耗 ATP，需要加入前體氨基酸等物質(zhì)，造成成本較高；發(fā)酵法生產(chǎn)GSH就是選育GSH合成能力強(qiáng) 和胞內(nèi)含量高的微生物、篩選和優(yōu)化培養(yǎng)基配方、建立和優(yōu)化發(fā)酵控制策略、改進(jìn)和提高下 游過(guò)程技術(shù)等，最終提高GSH的產(chǎn)率和質(zhì)量。由于該方法所用原料可再生，產(chǎn)物對(duì)環(huán)境無(wú)污 染等優(yōu)點(diǎn)而越來(lái)越受人們的關(guān)注。目前國(guó)內(nèi)外發(fā)酵法合成GSH的菌種主要是釀酒酵母、畢 赤酵母、產(chǎn)朊假絲酵母、大腸桿菌等，而生產(chǎn)菌株主要依靠傳統(tǒng)的誘變育種方法獲得。
[0006] 利用基因工程構(gòu)建高產(chǎn)谷胱甘肽工程菌，主要有兩種途徑：
[0007] (1)將谷胱甘肽合成途徑中的將谷氨酰半胱氨酸合成酶（GSHI)和谷胱 甘肽合成酶（GSHII)在宿主細(xì)胞中過(guò)量表達(dá)。在大腸桿菌中過(guò)量表達(dá)大腸桿菌的 GSHA和GSHB，重組菌JM109(pVB303)谷胱甘肽的合成量達(dá)到34. 8mg/g濕菌體（Liao XY,Shenff,ChenJ,etal.Improvedglutathioneproductionbygeneexpressionin Escherichiacoli.LettApplMicrobiol，2006, 43 (2) :211-214.);在巴斯德畢赤酵母的基 因工程改造中，中國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?01110343872.4公開(kāi)了來(lái)源大腸桿菌的GSHA和GSHB在 巴斯德畢赤酵母組成型啟動(dòng)子GAP下過(guò)量表達(dá)，與對(duì)照菌株相比提高了谷胱甘肽的合成量。 來(lái)源釀酒酵母的GSHI和GSHII在重組畢赤酵母GS115 (pAGPZHGSH)表達(dá)并進(jìn)行高密度發(fā) 酵，GSH的產(chǎn)量達(dá)到 4. 15g/L(FeiLW，YangY,ChenSX.Improvedglutathioneproduction bygeneexpressioninPichiapastoris.BioprocessBiosystENG, 2009, 32:729-735)〇 中國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?00710036487. 9、200810039695. 9和200910176777. 2的專利也分別公開(kāi) 了釀酒酵母的GSHI和GSHII在重組畢赤酵母中過(guò)量表達(dá)來(lái)提高GSH的合成量，與對(duì)照菌 株相比提高了GSH的表達(dá)量；在釀酒酵母的基因改造中，過(guò)量表達(dá)自身的GSHI和GSHII， 在搖瓶條件下GSH產(chǎn)量達(dá) 5. 4mg/l/0D，而對(duì)照組為 1. 83mg/l/0D(KiriyamaK,HaraKY,Kondo A.ExtracellularglutathionefermentationusingengineeredSaccharomyces cerevisiaeexpressinganovelglutathioneexporter.ApplMicrobiolBiotechn ol，2012,96 (4):1021-1027)。
[0008] (2)將雙功能谷胱甘肽合成酶GshF在宿主細(xì)胞中過(guò)量表達(dá)。雙功能谷胱甘肽合 成酶GshF同時(shí)具有γ時(shí)具有γ和GS兩個(gè)功能域，使兩步催化反應(yīng)更加緊密，其主要來(lái)源 有無(wú)乳鏈球菌（Streptococcusagalactiae)、嗜熱鏈球菌（Streptococcusthermophilus)、 單增李斯特氏菌（Listeriamonocytogenes)、多殺巴斯德菌（Pasteurellamultocida)等。 中國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?01110003488.X公開(kāi)了對(duì)含有嗜熱鏈球菌的谷胱甘肽合成酶GshF的重組 大腸桿菌BL21/PET28a-GshF和JM109pTrc99a-GshF進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，在補(bǔ)加三種氨基酸前體 及ATP的條件下，其分批發(fā)酵GSH產(chǎn)量為4. 5g/L。同樣中國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?01110369992. 1公 開(kāi)了單增李斯特氏菌的GshF在巴斯德畢赤酵母中的表達(dá)，重組菌在搖瓶條件下GSH產(chǎn)量為 190mg/L，為野生型的4倍多。
[0009] 上述文獻(xiàn)、專利所報(bào)道的高產(chǎn)谷胱甘肽工程菌，均是通過(guò)過(guò)量表達(dá)谷胱甘肽合成 相關(guān)酶來(lái)提高GSH合成量，其中GSHA或GSHI由于GSH的反饋抑制，其&約為3mM，使得 GSH產(chǎn)量不會(huì)很高，盡管雙功能谷胱甘肽合成酶能一步合成GSH，但GSH對(duì)來(lái)源單增李斯特 菌的GshF的抑制常數(shù)&為5mM，依然受GSH反饋抑制。解除GSH對(duì)谷胱甘肽合成酶的反饋 抑制是提高谷胱甘肽產(chǎn)量的重要途徑，來(lái)源無(wú)乳鏈球菌的GshF對(duì)GSH的反饋抑制不敏感， 其心約140mM，但其對(duì)L-谷氨酸的KJ直為22mM。本發(fā)明通過(guò)易錯(cuò)PCR突變來(lái)源無(wú)乳鏈球 菌的谷胱甘肽合成酶基因gshF，利用高通量的篩選方法獲得Km降低，催化效率提高的突變 體，并用于構(gòu)建谷胱甘肽高產(chǎn)菌株。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種無(wú)乳鏈球菌的gshF基因的突 變基因及其應(yīng)用。
[0011] 本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：一種無(wú)乳鏈球菌的gshF基因的突變 基因，所述突變基因?yàn)間shFMl、gshFM2或gshFM3,所述gshFMl的核苷酸序列為SEQIDN0 : 1、所述gshFM2的核苷酸序列為SEQIDNO:2,所述gshFM3的核苷酸序列為SEQIDNO:3。
[0012] -種由上述突變基因編碼的谷胱甘肽合成酶突變體所述谷胱甘肽合成酶突變體 為GshFMl、GshFM2或GshFM3,所述GshFMl由突變基因gshFMl編碼，其氨基酸序列如SEQ IDN0 :4所示，所述GshFM2由突變基因gshFM2編碼，其氨基酸序列如SEQIDN0 :5所示， 所述GshFM3由突變基因gshFM3編碼，其氨基酸序列如SEQIDN0 :6所示。
[0013] -種谷胱甘肽合成酶突變體的合成方法，根據(jù)突變基因（gshFMl、gshFM2或 gshFM3)的核苷酸序列設(shè)計(jì)上游引物和下游引物，利用PCR擴(kuò)增的方法獲得擴(kuò)增產(chǎn)物，并將 擴(kuò)增產(chǎn)物與表達(dá)載體pET-28a(+)相連后，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21宿主細(xì)胞中，經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)后 獲得谷胱甘肽合成酶突變體；所述突變基因的核苷酸序列為SEQIDNO:1、SEQIDNO:2或 SEQIDNO:3。
[0014] 進(jìn)一步地，所述上游引物的序列為SEQ ID NO: 7,下游引物的序列為SEQ ID NO:8。
[0015] -種突變基因的應(yīng)用，所述應(yīng)用為：將突變基因用于制備畢赤酵母工程菌、釀酒酵 母工程菌。
[0016] 進(jìn)一步地，將突變基因用于制備畢赤酵母工程菌，具體為：將權(quán)利1所述的突變基 因（gshFMl、gshFM2或gshFM3)與pGAPZA畢赤酵母表達(dá)載體相連接，得到重組質(zhì)粒，將重組 質(zhì)粒利用內(nèi)切酶AvrII酶切線性化，導(dǎo)入巴斯德畢赤酵母菌GS115,得到表達(dá)權(quán)利2所述的 畢赤酵母工程菌。
[0017] 進(jìn)一步地，將突變基因用于制備釀酒酵母基因工程菌，具體為：根據(jù)突變基因 (gshFMl、gshFM2或gshFM3)的核苷酸序列設(shè)計(jì)上游引物和下游引物，利用PCR擴(kuò)增的方法 獲得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；將釀酒酵母啟動(dòng)子TEF1P、終止子TEF1T、Ecorl線性化載體pRS426與 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物共同轉(zhuǎn)化釀酒酵母By4741，利用釀酒酵母By4741自身重組系統(tǒng)得到重組質(zhì) 粒，并得到表達(dá)權(quán)利2所述谷胱甘肽合成酶的釀酒酵母工程菌，所述谷胱甘肽合成酶突變 基因選自gshFMl、gshFM2 或gshFM3。