羅非魚源無乳鏈球菌弱毒株及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物病害防治技術(shù)，具體涉及羅非魚源無乳鏈球菌弱毒株及應(yīng)用。羅非魚源無乳鏈球菌弱毒株為YM001，其保藏于CCTCC，保藏編號(hào)為：CCTCCM2014045。該弱毒菌株經(jīng)活化培養(yǎng)和發(fā)酵培養(yǎng)后，將106-109CFU/mL的弱毒菌株YM001的細(xì)菌細(xì)胞與無菌磷酸鹽緩沖溶液混合，作為防治羅非魚鏈球菌病的弱毒活疫苗，注射給藥濃度為105-108CFU/尾，口服給藥濃度為108-109CFU/尾，浸泡給藥濃度為107-108CFU/mL。本發(fā)明涉及弱毒株的菌種鑒定、毒力測(cè)定、返毒安全性和穩(wěn)定性、免疫原性和免疫保護(hù)效果，用該菌株制成的羅非魚鏈球菌病疫苗免疫保護(hù)效果好，安全性和穩(wěn)定性強(qiáng)。
【專利說明】羅非魚源無乳鏈球菌弱毒株及應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物病害防治技術(shù)，具體涉及無乳鏈球菌（SirepiococciAs 感染的羅非魚鏈球菌病免疫防治的弱毒株及應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 我國(guó)是羅非魚養(yǎng)殖第一大國(guó)，年產(chǎn)量占世界總產(chǎn)量50%以上。2001年開始至 2008年，中國(guó)羅非魚養(yǎng)殖陸續(xù)出現(xiàn)鏈球菌病感染，并在個(gè)別養(yǎng)殖場(chǎng)造成30%?50%的高死 亡率，主要流行菌種為海豚鏈球菌；2009?2013連續(xù)5年，鏈球菌病在中國(guó)羅非魚養(yǎng)殖大 面積暴發(fā)流行，發(fā)病區(qū)域逐年擴(kuò)大、發(fā)病率和死亡率逐年遞增，易感羅非魚規(guī)格范圍逐年擴(kuò) 大，主要流行菌種為無乳鏈球菌（Ming chen等，2011 ;Maixin Lu等，2010 ;祝環(huán)琳等，2010 ; 周素明，2008)。按我國(guó)年均羅非魚產(chǎn)量計(jì)算，估計(jì)鏈球菌病每年給我國(guó)羅非魚產(chǎn)業(yè)造成的 直接經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)4億美元。目前還未有能有效預(yù)防和治療該病的方法，藥物只能在早期 起到控制病情的輔助性作用，隨著耐藥和抗藥性的產(chǎn)生和積累，該病的現(xiàn)狀幾乎是"無藥可 治可防"，病害暴發(fā)與隨之而來的產(chǎn)品安全問題已嚴(yán)重制約我國(guó)羅非魚產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。
[0003] 國(guó)內(nèi)外研究和生產(chǎn)應(yīng)用結(jié)果顯示疫苗免疫預(yù)防和控制羅非魚鏈球菌病具有有 效、安全和環(huán)保等特點(diǎn)。1995年以色列學(xué)者Eldar通過免疫接種預(yù)防羅非魚鏈球菌病 (SirepiococciAs 開始，美國(guó)（Klesius 等，1999 ;Pridgeon 等，2011)、中國(guó)（Sun 等，2010 ;陳明等，2010)、日本（Dumrongphol等，2009)和韓國(guó)（Shin等，2007)等國(guó)家多個(gè) 實(shí)驗(yàn)室先后開展了羅非魚鏈球菌病滅活疫苗研究，在試驗(yàn)室和生產(chǎn)應(yīng)用示范均取得了良好 的免疫效果。但由于研制的滅活疫苗免疫途徑不便、免疫保護(hù)期較短和成本較高等問題，疫 苗一直未能在羅非魚養(yǎng)殖生產(chǎn)上廣泛應(yīng)用。弱毒疫苗具有免疫劑量低、免疫效果好、保護(hù)期 長(zhǎng)等特點(diǎn)，弱毒疫苗的開發(fā)對(duì)羅非魚鏈球菌病的免疫防控具有重要作用。美國(guó)Pridgeon等 通過抗生素篩選方法分別獲得了海豚鏈球菌和無乳鏈球菌的弱毒菌株，并證明了弱毒疫苗 的安全可行（Pridgeon等，2011)。本發(fā)明經(jīng)多年研究，采用溫差傳代快速培養(yǎng)毒力弱化方 法獲得一株羅非魚源無乳鏈球菌弱毒菌株YM001，該菌株可制備成羅非魚鏈球菌病疫苗，可 經(jīng)注射、口服或浸泡不同給藥途徑免疫羅非魚預(yù)防鏈球菌病，對(duì)羅非魚鏈球菌病的防治具 有巨大的開發(fā)價(jià)值。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于解決羅非魚鏈球菌病滅活疫苗免疫防控成本高、免疫保護(hù)期 短、免疫途徑不便等問題，提供羅非魚源無乳鏈球菌弱毒菌株及應(yīng)用，開發(fā)羅非魚鏈球菌病 弱毒活疫苗。
[0005] 為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案為： 羅非魚源無乳鏈球菌弱毒菌株YM001，該菌株保存于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心CCTCC， 保藏編號(hào)為：CCTCC Μ 2014045。
[0006] 所述羅非魚源無乳鏈球菌弱毒菌株ΥΜ001，其于2014年2月26日，保存于中國(guó)典 型培養(yǎng)物保藏中心CCTCC，地址武漢市武昌珞珈山，保藏編號(hào)為：CCTCC Μ 2014045,分類名 稱為無乳鏈球菌5?-印iococcws aga/aciiae。
[0007] 羅非魚源無乳鏈球菌弱毒菌株在防治羅非魚鏈球菌病中的應(yīng)用。
[0008] 所述菌株可采用胰豆蛋白胨液體培養(yǎng)基（TSB)進(jìn)行培養(yǎng)，該羅非魚源無乳鏈球菌 弱毒菌株經(jīng)活化培養(yǎng)和發(fā)酵培養(yǎng)后，將10 6-109 CFU/mL的無乳鏈球菌弱毒菌株的細(xì)菌細(xì)胞 與無菌磷酸緩沖鹽溶液混合，作為防治羅非魚鏈球菌病的弱毒活疫苗。
[0009] 將上述弱毒活疫苗注射給藥濃度為105-108 CFU/尾，口服給藥濃度為108-109 CFU/尾，浸泡給藥濃度為107-108 CFU/mL，浸泡時(shí)間10-30 min。
[0010] 本發(fā)明所具有的優(yōu)點(diǎn)： 本發(fā)明由溫差傳代快速培養(yǎng)毒力弱化獲得羅非魚源無乳鏈球菌弱毒菌株YM001，該菌 株具有毒力低、免疫原性強(qiáng)、穩(wěn)定性好等特點(diǎn)，應(yīng)用該菌株制成的羅非魚鏈球菌病疫苗免 疫保護(hù)效果好，安全性和穩(wěn)定性強(qiáng)，可有效保護(hù)實(shí)驗(yàn)魚防御強(qiáng)致病性羅非魚源無乳鏈球菌 毒株的感染。本發(fā)明制備的弱毒活疫苗可根據(jù)需要，以注射、口服或浸泡方式給藥免疫而使 羅非魚獲得高效的免疫保護(hù)。

【具體實(shí)施方式】
[0011] 實(shí)施例1本發(fā)明使用的菌株和培養(yǎng)基 羅非魚源無乳鏈球菌野生型毒株HN016,為我國(guó)南方暴發(fā)流行鏈球菌病的羅非魚養(yǎng)殖 場(chǎng)發(fā)病魚腦部分離，其生化鑒定特征符合伯杰氏細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)（第九版）。
[0012] 羅非魚源無乳鏈球菌弱毒菌株YM001，采用溫差傳代快速培養(yǎng)毒力弱化方法對(duì)野 生型毒株HN016毒力弱化獲得，保存于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心CCTCC，保藏編號(hào)為：CCTCC Μ 2014045。
[0013] 胰豆蛋白胨液體培養(yǎng)基（TSB):胰蛋白胨17.0 g/L，大豆蛋白胨5.0 g/L，NaCl 5.0 g/L，葡萄糖2.5 g/L，蒸饋水1000 mL，調(diào)pH 7.2,121 °C高壓滅菌20 min,冷卻置室溫備用。
[0014] 實(shí)施例2羅非魚源無乳鏈球菌弱毒株YM001的PCR和生化鑒定 采用羅非魚源鏈球菌(海豚鏈球菌和無乳鏈球菌）PCR鑒定方法、API 20 Strep生化條 和VITEK 2全自動(dòng)微生物分析儀對(duì)弱毒株YM001進(jìn)行鑒定。
[0015] 海豚鏈球菌和無乳鏈球菌二重PCR快速檢測(cè)：PCR引物參考黎炯等（2010)和 Zlotkin等（1998)公開發(fā)表論文，無乳鏈球菌特異性引物擴(kuò)增片段大小為474 bp，海豚 鏈球菌特異性引物擴(kuò)增片段大小為296 bp。PCR反應(yīng)試劑為中國(guó)大連TaKaRa公司PCR試 劑盒，PCR 體系如下：10X位 7? Buffer (Mg2+) 5.0 PL，dNTP 2.0 41^，!11，!12，？1和？2引 物各 2· 0 μ?，2· 0 μ? DNA 模板（大約 50 ng)，1· 0 μ? 位 7? (5 U/μυ，32. 0 μ? ddH20,總體積50 μ? ;PCR反應(yīng)在美國(guó)ΑΒΙ公司GeneAmp PCR system 9700進(jìn)行；PCR反應(yīng) 程序：第一步,94°C，5 min;第二步，94 °C，30 s, 58 °C，30 s，72 °C，45 s，35個(gè)循環(huán)；第三 步，72 °C，10 min ; 1. 2%瓊脂糖凝膠電泳，GeneGreen染色后使用凝膠成像系統(tǒng)觀察，設(shè)陽(yáng) 性和空白對(duì)照。PCR快速檢測(cè)結(jié)果顯示，致弱菌株YM001和原始野生毒株HN016均可擴(kuò)增出 特異條帶（474 bp)。結(jié)果說明本發(fā)明的弱毒株YM001可通過PCR方法進(jìn)行檢測(cè)，并且鑒定 為無乳鏈球菌，說明該菌株的基本屬性較原始強(qiáng)毒株HN016并未發(fā)生根本性的變化。
[0016] 生化鑒定：將保存的野生強(qiáng)毒株HN016和弱毒株YM001在血平板劃線培養(yǎng)，使用接 種環(huán)挑取固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的單菌落，接種于10 mL的TSB液態(tài)培養(yǎng)基28°C，120 rpm振蕩 培養(yǎng)24 h。利用法國(guó)生物梅里埃公司API 20 Str印生化條和VITEK 2全自動(dòng)微生物分析 儀對(duì)HN016和YM001進(jìn)行鑒定。生化鑒定結(jié)果顯示除抗桿菌肽（bacitracin resistance, BACI)HN016為陽(yáng)性，YM001為陰性外，其他生化指標(biāo)均一致。桿菌肽為枯草桿菌和地衣芽孢 桿菌產(chǎn)生的環(huán)肽，抑制革蘭氏陽(yáng)性菌細(xì)胞壁肽聚糖的合成，有殺菌作用，也抑制糖蛋白核心 寡糖的合成，對(duì)革蘭陽(yáng)性細(xì)菌和陰性球菌、肺炎雙球菌、葡萄球菌、淋球菌、腦膜炎雙球菌及 螺旋體等均有殺菌作用。致弱株抗桿菌肽呈陰性，表明菌株毒力弱化后抗殺菌作用有所減 弱，可能與細(xì)胞壁合成受到某種抑制相關(guān)。生化鑒定結(jié)果顯示本發(fā)明的致弱株YM001依然 可通過生化鑒定方法進(jìn)行檢測(cè)，并且鑒定為無乳鏈球菌，該菌株的生化指標(biāo)與原始強(qiáng)毒株 HN016除抗桿菌肽外，其他生化指標(biāo)均一致，表明弱毒株YM001生化屬性未發(fā)生巨大變化， 有利于維持弱毒株免疫原性。
[0017] 羅非魚源無乳鏈球菌弱毒株YM001的PCR和生化鑒定結(jié)果表明本發(fā)明的羅非魚源 無乳鏈球菌YM001的基因和生化特性較原始強(qiáng)毒株HN016未發(fā)生巨大改變，推測(cè)菌株的免 疫原性得到保留，利于后續(xù)羅非魚鏈球菌病弱毒疫苗的開發(fā)。
[0018] 實(shí)施例3 :羅非魚源無乳鏈球菌野生型毒株HN016和弱毒菌株YM001對(duì)羅非魚的 半數(shù)致死量LD 5(|測(cè)定 用TSB分別培養(yǎng)羅非魚源野生型菌株HN016和弱毒菌株YM001，25-30 °C，搖床振蕩培 養(yǎng)18-24小時(shí)，利用平板菌落計(jì)數(shù)法對(duì)菌液進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)。培養(yǎng)菌液以10倍梯度進(jìn)行8個(gè) 系列稀釋，每個(gè)濃度菌液通過腹腔注射感染20尾羅非魚，0. 1 ml/尾；對(duì)照組羅非魚腹腔注 射等體積TSB培養(yǎng)基，0.1 ml/尾。感染組和對(duì)照組羅非魚均飼養(yǎng)于裝有40 L水的充氣水 族箱，每2 d換水2/3,水溫控制在30?32 °C，每天按魚重3%分上下午兩次投料。攻毒后 飼養(yǎng)觀察20 d，每天記錄進(jìn)食、發(fā)病及死亡情況，并用血平板對(duì)死亡試驗(yàn)魚腦和肝組織進(jìn)行 細(xì)菌分離鑒定，計(jì)算累計(jì)死亡數(shù)和死亡率測(cè)定菌株HN016和YM001的半數(shù)致死量（LD50)。
[0019] 表1野生型菌株HN016和弱毒菌株YM001對(duì)羅非魚的毒力測(cè)定

【權(quán)利要求】
1. 羅非魚源無乳鏈球菌弱毒菌株YM001，該菌株保存于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心 CCTCC，保藏編號(hào)為：CCTCC Μ 2014045。
2. 羅非魚源無乳鏈球菌弱毒菌株在防治羅非魚鏈球菌病中的應(yīng)用。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的羅非魚源無乳鏈球菌弱毒菌株的應(yīng)用，其特征在于：該羅 非魚源無乳鏈球菌弱毒菌株經(jīng)活化培養(yǎng)和發(fā)酵培養(yǎng)后，將1〇 6-1〇9 CFU/mL的無乳鏈球菌弱 毒菌株的細(xì)菌細(xì)胞與無菌磷酸緩沖鹽溶液混合，作為防治羅非魚鏈球菌病的弱毒活疫苗。
4. 按權(quán)利要求3所述的羅非魚源無乳鏈球菌弱毒菌株的應(yīng)用，其特征在于：將上述 弱毒活疫苗注射給藥濃度為1〇5_1〇 8 CFU/尾，口服給藥濃度為108-109 CFU/尾，浸泡給藥濃 度為 107-108 CFU/mL，浸泡時(shí)間 10-30 min。
【文檔編號(hào)】A61K39/09GK104152368SQ201410087045
【公開日】2014年11月19日 申請(qǐng)日期:2014年3月11日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月11日
【發(fā)明者】陳明, 李莉萍, 王瑞, 甘西, 梁萬文, 黃婷, 朱佳杰, 雷愛瑩, 李健, 陳福艷 申請(qǐng)人:廣西壯族自治區(qū)水產(chǎn)科學(xué)研究院