羅非魚無乳鏈球菌GapA蛋白亞單位疫苗、其制備方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及羅非魚無乳鏈球菌GapA蛋白亞單位疫 苗、其制備方法及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 無乳鏈球菌是鏈球菌屬的一個(gè)種。1896年按照Lancefield氏血清學(xué)分類法把無 乳鏈球菌歸為B群鏈球菌，因?yàn)樵撊簝H有無乳鏈球菌一種，因此無乳鏈球菌又稱B群鏈球菌 (GBS)。GBS是重要的人畜共患病的細(xì)菌性病原之一，能引起嬰兒敗血癥、腦膜炎等，新生兒 晚發(fā)性感染的死亡率可達(dá)2 %~6 %。GBS也是動(dòng)物，包括牛、山羊和綿羊等的急、慢性乳腺 炎的主要病原菌。Robinson等人于1966年第一次報(bào)道在淡水魚金色美鳊（Notemigonus crysoleucas)中分離出B群鏈球菌。隨后相繼有包括羅非魚在內(nèi)的多種魚類受無乳鏈球菌 感染而大量死亡的報(bào)道。魚類受鏈球菌感染后出現(xiàn)的典型癥狀之一是運(yùn)動(dòng)失控，組織切片 顯示鏈球菌可侵襲魚類腦部神經(jīng)系統(tǒng)。羅非魚是世界性養(yǎng)殖魚類，也是我國(guó)重要的淡水養(yǎng) 殖魚類，近年來鏈球菌病給羅非魚養(yǎng)殖業(yè)造成極大的威脅。
[0003] 在鏈球菌的免疫預(yù)防上，以色列的Eldar等人在1993年開發(fā)了虹鱒海豚鏈球菌 (Streptococcus iniae)全菌滅活疫苗，從1995年到1997年，以色列的養(yǎng)殖虹鱒使用該疫 苗進(jìn)行免疫，每年大約免疫300萬尾，使虹鱒因受海豚鏈球菌感染所致的死亡率由每年的 50%下降至低于5%。但1997年以后，以色列養(yǎng)殖虹鱒暴發(fā)的海豚鏈球菌病，發(fā)病癥狀有 別于以往，原疫苗對(duì)此病失去了保護(hù)效果。對(duì)從1997-2000年連續(xù)4年采集的樣品進(jìn)行血 清學(xué)分析表明新菌株的血清型與早期的不同，且試驗(yàn)證實(shí)這兩種血清型疫苗無交叉保護(hù)作 用。由于針對(duì)某種血清型制備的滅活疫苗難以對(duì)所有血清型產(chǎn)生有效的保護(hù)作用，因此成 功的無乳鏈球菌疫苗必須要包含各種血清型均保守的抗原區(qū)段。而無乳鏈球菌的莢膜免疫 被證明保護(hù)力低下。
[0004] 鑒于此，克服以上現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，提供一種新的無乳鏈球菌亞單位疫苗成為 本領(lǐng)域亟待解決的技術(shù)問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的上述缺陷，提供了羅非魚無乳鏈球菌GapA蛋 白亞單位疫苗、其制備方法及應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明的目的可通過以下的技術(shù)措施來實(shí)現(xiàn)： 本發(fā)明提供了一種羅非魚無乳鏈球菌GapA蛋白亞單位疫苗，包括： (i) 如SEQ ID No :1所示的氨基酸序列的多肽或其同源物或片段；和/或 (ii) 能夠編碼如以SEQ ID No :1所示的氨基酸序列或其同源物或片段的核酸序列。
[0007] 優(yōu)選地，該疫苗還包括藥物學(xué)上可接受的載體、稀釋劑和/或佐劑。
[0008] 優(yōu)選地，該疫苗還包括弗氏佐劑，所述疫苗為如SEQ ID No :1所示的氨基酸序列的 多肽或其同源物或片段與完全弗氏佐劑、不完全弗氏佐劑中的一種或兩種形成的混合乳化 物。
[0009] 優(yōu)選地，所述的核酸序列如SEQ ID No :2所示。
[0010] 本發(fā)明還提供了一種重組構(gòu)建體，該重組構(gòu)建體包含如SEQ ID No :2所示的核酸 序列，所述核酸序列被可操作地連接于表達(dá)調(diào)控區(qū)域。
[0011] 本發(fā)明還一種用于制備如SEQ ID No :2所示的GapA蛋白的編碼基因的試劑，該試 劑包括核苷酸序列如SEQ ID No :3和SEQ ID No :4所示的引物。
[0012] 本發(fā)明還提供了一種制備上述的疫苗的方法，其包括如下步驟： (a) 使用上述的試劑擴(kuò)增得到GapA蛋白的編碼基因 SEQ ID No :2 ; (b) 獲得含有GapA蛋白的編碼基因 SEQ ID No :2的重組構(gòu)建體； (c) 用所得重組構(gòu)建體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞； (d) 將轉(zhuǎn)化后的宿主細(xì)胞置于足以表達(dá)所述GapA蛋白的編碼基因的條件下進(jìn)行培養(yǎng)； (e ) GapA蛋白的分離純化。
[0013] 本發(fā)明另外還提供了如SEQ ID No :1所示的氨基酸序列的多肽或其同源物或片段 在制備用于預(yù)防和/或治療羅非魚鏈球菌病藥物中的用途。
[0014] 本發(fā)明的有益效果在于，本發(fā)明的疫苗具有良好的免疫原性、安全性高、使用方 便。
【附圖說明】
[0015] 圖1是實(shí)施例1中GapA基因 PCR擴(kuò)增結(jié)果圖。
[0016] 圖2是實(shí)施例1中GapA基因重組質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果圖。
[0017] 圖3是實(shí)施例1中GapA蛋白的Western-blot結(jié)果圖。
[0018] 圖4是應(yīng)用例1的羅非魚免疫后累計(jì)死亡率統(tǒng)計(jì)圖。
[0019] 圖5是本發(fā)明的疫苗的制備過程的具體流程圖。
【具體實(shí)施方式】
[0020] 為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施 例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明， 并不用于限定本發(fā)明。
[0021] 本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)材料無乳鏈球菌取樣自受無乳鏈球菌感染的羅非魚體內(nèi)，為野生型 無乳鏈球菌。
[0022] 術(shù)語"多肽"以正常的意義使用，指通過相鄰氨基酸的α -氨基和羧基基團(tuán)之間的 肽鍵彼此連接的一系列殘基，通常是L-氨基酸，該術(shù)語與"蛋白質(zhì)"是同意的。多肽可以從 其天然環(huán)境分離，例如，從羅非魚無乳鏈球菌提取或在羅非魚無乳鏈球菌外部生成。
[0023] 術(shù)語"同源物"指可源自另一品系或物種的多肽，其與初始蛋白質(zhì)實(shí)施相同的功 能，和/或可以預(yù)測(cè)為就其序列而言共享共同的進(jìn)化史。
[0024] 術(shù)語"片段"指多肽包含野生型氨基酸序列的部分。它可以包含序列的一個(gè)或多 個(gè)大的連續(xù)部分或多個(gè)小的部分。多肽也可以包含序列的其他元件，例如，它可以是與另一 種蛋白質(zhì)的融合蛋白。片段可以包含野生型序列的至少50%，更優(yōu)選地至少65%，最優(yōu)選地 至少80%。片段可以是或包含主題序列的亞單位。
[0025] 同源蛋白質(zhì)（或其片段）可以通過序列同源性(包括至關(guān)重要的殘基的位置)、結(jié) 構(gòu)、生物物理、生物化學(xué)或功能性同源性來鑒定。
[0026] 同源序列可以通過保守推定結(jié)構(gòu)或氨基酸序列間的相似性，使得使用BLASTp比 較的比對(duì)在全序列的相當(dāng)一部分間產(chǎn)生le-20或更小的E值。
[0027] 同源序列可以通過氨基酸序列間的相似性或保守的推定結(jié)構(gòu)來鑒定。
[0028] 術(shù)語"核酸"可以是任何合適類型的核苷酸序列，如合成的RNA/DNA序列、重組 RNA/DNA序列（g卩，通過使用重組DNA技術(shù)制備)、cDNA序列或部分基因組DNA序列。核酸可 以自其天然環(huán)境分離，例如，從羅非魚無乳鏈球菌提取或在羅非魚無乳鏈球菌外部生成。
[0029] 關(guān)于GapA (三磷酸甘油醛脫氫酶）蛋白 GapA蛋白是鏈球菌的具有三磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH)活性的蛋白，最早在A族鏈 球菌中發(fā)現(xiàn)，GAPDH是糖酵解過程中的關(guān)鍵酶，該酶存在于細(xì)胞表面，能結(jié)合細(xì)胞分子，在 引發(fā)癌癥及細(xì)胞凋亡方面其重要作用。鏈球菌具有單拷貝的GAPDH基因，該單拷貝基因 對(duì)細(xì)菌的生存是至關(guān)重要的。目前已發(fā)現(xiàn)能合成GAPDH的鏈球菌有A族鏈球菌（plasmin receptor，Pit)，B組鏈球菌、C組鏈球菌、乳房鏈球菌、停乳鏈球菌、肺炎鏈球菌、豬鏈球菌I 型、豬鏈球菌II型、口腔鏈球菌等。
[0030] 以SEQ ID No :1顯示的多肽(蛋白質(zhì)）可源自羅非魚無乳鏈球菌，此蛋白質(zhì)顯示出 了 GapA蛋白的活性。
[0031] 以SEQ ID No :2顯示的核酸序列可源自羅非魚無乳鏈球菌，此核酸序列為GapA蛋 白的編碼基因。
[0032] 關(guān)于弗氏佐劑 弗氏佐劑（Freundad j uvan t)是目前常用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的佐劑，它是將抗原水溶液與油 劑(石蠟油或植物油）等量混合，再加乳化劑（羊毛脂或葉吐溫80)制成油包水抗原乳劑，稱 之為不完全弗氏佐劑。如在不完全佐劑中加入分枝桿菌(如死卡苗）則稱為完全弗氏佐劑。 其制備方法如下：弗氏佐劑是現(xiàn)在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中最常用的佐劑，分為不完全弗氏佐劑和完全 弗氏佐劑。不完全弗氏佐劑是液體石蠟與羊毛脂混合而成，組分比為1~5 :1，可根據(jù)需要 而定，通常為2 :1。不完全佐劑中加卡介苗(最終濃度為2~20mg/mL)或死的結(jié)核分枝桿 菌，即為完全弗氏佐劑（FCA)。在本發(fā)明的實(shí)施例中，一般首次注射時(shí)用1 / 2體積FCA加 上1 / 2體積的抗原進(jìn)行乳化，第二次或第三次注射時(shí)用不完全佐劑或不用佐劑，如不加佐 劑，要達(dá)到同樣的免疫或治療效果，抗原用量要增大10~20倍。
[0033] 本發(fā)明的第一方面涉及一種疫苗，其可以包括多種氨基酸/核酸序列，其對(duì)應(yīng)來 自于羅非魚無乳鏈球菌的不同品系和/或物種的SEQ ID No :1同源物和/或能夠編碼如以 SEQ ID No :1所示的氨基酸序列或其同源物或片段的核酸序列。
[0034] 疫苗還可以包括藥物學(xué)上可接受的載體、稀釋劑和/或佐劑，例如，疫苗還包括弗 氏佐劑，該疫苗為如SEQ ID No :1所示的氨基酸序列的多肽或其同源物或片段與完全弗氏 佐劑、不完全弗氏佐劑中的一種或兩種形成的混合乳化物。更一步地，該多肽與弗氏佐劑的 體積比為1 :(1~2);進(jìn)一步地，該多肽與弗氏佐劑的體積比為1 :1 ;更進(jìn)一步地，該疫苗可 進(jìn)行二次免疫，第一次免疫使用體積比為1:1的多肽與完全弗氏佐劑混合物，第二次免疫 使用體積比為1:1的多肽與不完全弗氏佐劑的混合物。
[0035] 疫苗可以用于預(yù)防和/或治療疾??；"預(yù)防"意指對(duì)尚未染上疾病和/或沒有顯 示任何疾病癥狀的受試者施用疫苗以阻止或削弱疾病(例如感染）的原因或者降低或阻止 至少一種與疾病有關(guān)的癥狀的形成；"治療"（"處理"）意指對(duì)具有現(xiàn)有疾病的受試者施用 疫苗以減輕、減少或改善至少一種與疾病有關(guān)的癥狀和/或減緩、降低或阻斷疾病的進(jìn)展。 如SEQ ID No :1所示的氨基酸序列的多肽直接用作免疫原進(jìn)行羅非魚免疫接種，能夠降低 羅非魚的死亡率，顯示出了良好的免疫原性(參見實(shí)施例1)。
[0036] 本發(fā)明第二方面提供了一種重組構(gòu)建體，其包含如SEQ ID No :2所示的核酸序列， 所述核酸序列被可操作地連接于表達(dá)調(diào)控區(qū)域。
[0037] 本發(fā)明第三方面提供了一種用于制備如SEQ ID No :2所示的GapA蛋白的編碼基 因的試劑，其包括核苷酸序列如SEQ ID No :3和SEQ ID No :4所示的引物。
[0038] 本發(fā)明第四方面提供了一種制備上述疫苗的方法，其主要包括如下步驟：（a)使 用上述的試劑擴(kuò)增得到GapA蛋白的編碼基因 SEQ ID No :2 ; (b)獲得含有GapA蛋白