0. 1MHC1 (10mL)，冷凍干燥得到64. 5mg化合物5的鹽酸鹽 (5. (HCl)n) (41% )，為黃色固體。
[0202] LRMS(母分子）C2SH27D6N702: (ES,m/z) : 506 [M+H]+·
[0203] ^-NMR: (DMS0-d6, 300MHz,ppm).δ2. 74 (s, 3H), 2. 76 (s, 3H), 3. 32-3. 38 (m, 4H), 3. 94 (s, 3H), 5. 67 (d,J= 12. 3Hz, 1H), 6. 20 (d,J= 18. 6Hz, 1H), 7. 02 (s, 1H), 7. 22-7. 38 (m, 3H ),7. 43 (d,J= 6. 9Hz, 1H), 7. 60 (d,J= 7. 8Hz, 1H), 8. 22-8. 42 (m, 3H), 8. 84 (s, 1H,),9.99(s，1H)，10. 0 (brs, 1H)，10. 76 (brs, 1H)。
[0204] 實施例6
[0205]
[0206] L中間體006-1合成
[0207]
[0208] 在 50mL三口 瓶中依次加入 002-9(150mg, 0· 38mmol)、NMP(lOmL)、 K2C03(156mg, 1. 13mmol)和003-7(100mg，粗品）。加熱到105°C反應3h。反應完全后降至 室溫，將反應液倒入50mL冰水中淬滅。用100mLDCM萃取3次，合并有機相，用100mL飽和 NaCl溶液反洗3次，用無水Na2S04干燥后，濃縮至干燥。所得粗品經快速過柱儀純化（色 譜柱：硅膠柱；流動相：Me0H/DCM= 23% -29%，15min;檢測波長：UV254nm)。收集產品濃 縮后得到142mg006-1(78% )，為紅棕色固體。
[0209] LC-MS：485, 3〇
[0210] 2.中間體006-2的合成
[0211]
[0212] 在 100mL單 口瓶中，依次加入 006-l(142mg，0.29mmol)、無水乙醇（30mL)、水 (10mL)、鐵粉（98. 6mg，1. 76mmol)和氯化銨（llmg，0· 21mmol)。加熱到85°C后反應過夜。反 應完全后降至室溫，抽濾，收集濾液，濃縮至干。粗產品用快速過柱儀純化（色譜柱：C18硅 膠柱；流動相：水（〇· 05%TFA)/CH3CN= 33% -50%，18min;檢測波長：UV254nm)。收集產 品濃縮后得到176mg006-2,為黃色固體。LC-MS:455. 3。
[0213] 3.化合物6的合成
[0214]
[0215]在10011^三口瓶中，氮氣保護下加入 006-2(17611^，0.31臟〇1)、1'冊(201^)和 DIPEA(160mg，1. 24mmol)，冷卻到0°C下滴加丙烯酰氯（25mg，0· 28mmol)。在0°C下保溫反 應lh。反應完全后滴加lmL水淬滅，濃縮至干。所得粗品經制備（Prep-HPLC)純化（色 譜柱：XbridgePr印RP18 5um19*150mm;流動相：CH3CrV(0.05%氨水+10mM碳酸氫銨）， 77-81 %，4min;檢測波長：254nm)，收集產品濃縮至干，得化合物6。
[0216]
[0217]仕化甘物6甲刀P入（λ1MHUUlUmU
，/辛爍十爍得b9. 6mg化甘物6的鹽酸鹽 (6. (HCl)n) (35% )，為黃色固體。
[0218] LRMS(母分子）C2SH24D9N70 2: (ES, m/z) :509[M+H]+。
[0219] ^-NMR: (DMS0-d6, 300MHz,ppm) :δ2. 75-2. 76 (d,J=5. 1Hz, 6H), 3. 33-3. 37(m,4H ),5. 67-5. 72 (d,J=12. 6Hz, 1H),6. 19-6. 24 (d,J=15. 3Hz, 1H),7. 02 (s, 1H),7. 16-7. 34(m ,3H),7. 40-7. 42 (d,J=6. 9Hz, 1H),7. 58-7. 61 (d,J=7. 8Hz, 1H),8. 17-8. 39 (m, 3H),8. 82 ( s, 1H)，9. 98 (s, 1H)，10. 60 (br s, 1H)。
[0220] 實驗實施例
[0221] 實驗實施例1細胞生長抑制實驗：
[0222] 用測定細胞的生長的方法鑒定優(yōu)先靶向針對EGFR突變，而對野生型EGFR的活性 相對較弱的化合物。NCI-H1975細胞株是具有T790M和L858REGFR突變的人類非小細胞 肺癌細胞，該細胞生長在含10%胎牛血清（FBS)的RPMI-1640培養(yǎng)基（GIBC0)中。LoVo 細胞株是一個野生型EGFR的人結腸腺癌細胞，該細胞生長在含有10%FBS的F-12K培養(yǎng) 基（GIBC0)中。NCI-H1975和LoVo細胞的生長快慢由CellTiter-Glo發(fā)光活力測定法 (Promega公司 #G7572)來檢測。
[0223] 簡要地說，用胰蛋白酶來消化在對數生長期的細胞，并以每孔5000個細胞接種到 96孔板中，并孵育在37°C，有5%C02的濕潤的培養(yǎng)箱內，同時設不接種細胞僅加入營養(yǎng)液 的空白對照孔。24小時后，將不同化合物的鹽的DMS0溶液用細胞培養(yǎng)基液體從高到低稀 釋到不同濃度，每次用3. 16倍稀釋，共有8個不同濃度。NCI-H1975細胞中測試藥物的濃 度從0. 03-100nM，LoVo細胞中測試藥物的濃度從3ηΜ-10μM。然后將不同化合物的細胞培 養(yǎng)基液體加入到有細胞的96孔細胞板中，同時設僅有含DMSO的細胞培養(yǎng)基液體的對照孔。 在藥物處理72小時后，將細胞板從培養(yǎng)箱中取出并放置在室溫下30分鐘。然后加Cell Titer-Glo試劑到孔中，并將96孔細胞板在室溫下搖晃10分鐘，以誘導細胞裂解。再將96 孔細胞板放在實驗臺上2分鐘，讓發(fā)光信號穩(wěn)定。最后將96孔細胞板放入EnVision多標 記微孔板檢測儀（PerkinElmer)中，用0. 5秒的積分時間來讀取信號。
[0224] 計算公式為：
[0225] 細胞生長抑制百分比％ =(最大信號-化合物信號V(最大信號-最小信 號）*100%
[0226] 最大信號由沒有化合物的DMS0對照處理的細胞孔中獲得；
[0227] 化合物信號由加入化合物的藥物處理的細胞孔中獲得
[0228] 最小信號由沒有細胞的，只有營養(yǎng)液的孔中獲得。
[0229] 通過GraphPad Prism V5.0軟件計算出細胞生長抑制曲線，并基于此數據計算出 獲得50%抑制效果所需的化合物濃度，即化合物IC5。。
[0230] 所得結果列在下表1中。其中IC5。值為A表示IC5Q〈15nM，為B表示IC5Q>200nM。
[0231] 表1 :化合物活性實驗結果：
[0232]
[0233] 實驗實施例2
[0234] 本發(fā)明的氘代嘧啶類化合物和AZD9291在小鼠體內血濃度的比較：
[0235] 簡要地說，通過灌胃的方法讓23-25克的成年雄性⑶-1小鼠口服25毫克/公斤的 AZD9291或根據本發(fā)明的氘代嘧啶類化合物；實施例3的化合物3(以3. (HC1)n的形式）或 實施例4的化合物4(以4. (HCl)n的形式）。每個給藥組有三個小鼠，給藥后，在不同的時 間（0.25,0.5,1，2,4,6小時）從小鼠尾巴靜脈抽取30微升的血，放入有肝素鈉的管子內， 馬上置于冰上，然后將血液樣品在4度的離心機內以2000g的轉速，轉5分鐘。取出血漿， 放入小管里，保存于零下80°C的冰箱內。用LC/MS的方法來分析血漿樣本內的藥物濃度。
[0236] 所得結果顯示在圖1中。從圖1可以看出，在同等劑量下，本發(fā)明的氘代嘧啶類 化合物（實施例3中的化合物3和實施例4中的化合物4)與AZD9291相比在小鼠體內具 有更高的血漿濃度。
【主權項】
1. 式（I)的化合物或者其藥學上可接受的鹽、立體異構體、前藥分子或溶劑合物： 其中：Ri是気，R2、R3、R4和R5是甲基；或 Ri是氨，R2、R3、R4和R5中至少有兩個是CD3,其余的是甲基。2. 根據權利要求1所述的化合物或者其藥學上可接受的鹽、立體異構體、前藥分子或 溶劑合物，其中，所述式（I)的化合物選自下列化合物：3. 根據權利要求1-2中任一項所述的化合物或者其藥學上可接受的鹽、立體異構體、 前藥分子或溶劑合物，其中，所述藥學上可接受的鹽選自鹽酸鹽、氨漠酸鹽、氨艦酸鹽、硫酸 鹽、硫酸氨鹽、硝酸鹽、憐酸鹽、酸式憐酸鹽、高氯酸鹽、甲酸鹽、乙酸鹽、Ξ氣乙酸鹽、丙酸 鹽、丙酬酸鹽、徑乙酸鹽、乙二酸鹽、丙二酸鹽、下二酸鹽、戊二酸鹽、富馬酸鹽、馬來酸鹽、乳 酸鹽、蘋果酸鹽、巧樣酸鹽、酒石酸鹽、苦味酸鹽、谷氨酸鹽、苯甲酸鹽、甲橫酸鹽、乙橫酸鹽、 苯橫酸鹽、對甲苯橫酸鹽、水楊酸鹽、抗壞血酸鹽、精腦酸鹽和精腦橫酸鹽，尤其是鹽酸鹽和 甲橫酸鹽。4. 根據權利要求1-2中任一項所述的化合物或者其藥學上可接受的鹽、立體異構體、 前藥分子或溶劑合物，其中，所述藥學上可接受的鹽選自鹽酸鹽和甲橫酸鹽。5. -種藥物組合物，其包含選自根據權利要求1-4中任一項所述的化合物、其藥學上 可接受的鹽、立體異構體、前藥分子和溶劑合物中的一種或多種，w及非必需地包含藥學輔 料。6. 根據權利要求1-4中任一項所述的化合物、其藥學上可接受的鹽、立體異構體、前藥 分子和溶劑合物W及根據權利要求5所述的藥物組合物用于制備用于抑制腫瘤細胞生長 的藥物的用途。7. 根據權利要求6所述的用途，其中，所述腫瘤選自卵巢癌、宮頸癌、結腸直腸癌、乳腺 癌、膜腺癌、膠質瘤、膠質母細胞瘤、黑色素瘤、前列腺癌、白血病、淋己瘤、非霍奇金淋己瘤、 胃癌、肺癌、肝細胞癌、胃腸道基質瘤（GIST)、甲狀腺癌、膽管癌、子宮內膜癌、腎癌、間變性 大細胞淋己瘤、急性髓細胞白血?。ˋML)、多發(fā)性骨髓瘤、W及間皮瘤。8. 根據權利要求1-4中任一項所述的化合物、其藥學上可接受的鹽、立體異構體、前藥 分子和溶劑合物W及根據權利要求5所述的藥物組合物用于制備用于治療或預防由EGFR 介導的或由激活突變體或抗性突變體形式的EGH?介導的疾病、障礙、素亂或病況的藥物的 用途。9. 根據權利要求8所述的用途，其中，所述由EGH?介導的或由激活突變體或抗性突變 體形式的EGFR介導的疾病、障礙、素亂或病況選自卵巢癌、宮頸癌、結腸直腸癌、乳腺癌、膜 腺癌、膠質瘤、膠質母細胞瘤、黑色素瘤、前列腺癌、白血病、淋己瘤、非霍奇金淋己瘤、胃癌、 肺癌、肝細胞癌、胃腸道基質瘤（GIST)、甲狀腺癌、膽管癌、子宮內膜癌、腎癌、間變性大細胞 淋己瘤、急性髓細胞白血?。ˋML)、多發(fā)性骨髓瘤、W及間皮瘤。10. 根據權利要求8所述的用途，其中，所述激活突變體或抗性突變體形式的EGFR選自 L858R激活突變體、Exonl9缺失激活突變體和T790M抗性突變體。
【專利摘要】本發(fā)明涉及下面式(I)所示的氘代嘧啶類化合物，其藥學上可接受的鹽、立體異構體、前藥和溶劑合物，其制備方法、藥物組合物以及用途。所述化合物可以對EGFR蛋白激酶的變異形態(tài)產生抑制作用，因此有效抑制多種腫瘤細胞的生長，可用于制備抗腫瘤藥物，用于很多不同的癌癥的治療或預防，并可以克服現有藥物吉非替尼、厄洛替尼等第一代EGFR抑制劑誘發(fā)的耐藥性。更特別地，該類化合物可用于制備用于治療或預防由某些變異形態(tài)的表皮生長因子受體(例如L858R激活突變體、Exon19缺失激活突變體、和T790M抗性突變體)所介導的疾病、障礙、紊亂或病況的藥物。
【IPC分類】C07D403/04, A61P35/00, A61P35/02, A61K31/506
【公開號】CN105237515
【申請?zhí)枴緾N201510654436
【發(fā)明人】江岳恒
【申請人】上海頁巖科技有限公司
【公開日】2016年1月13日
【申請日】2015年10月10日