[002引術(shù)語"個別標(biāo)識標(biāo)簽"、"標(biāo)識標(biāo)簽"、"多重標(biāo)識標(biāo)簽"或"MID"在本文中可互換用 來指充當(dāng)獲得自特定樣品的DNA的標(biāo)志物的引物的區(qū)域。
[0026] 術(shù)語"擴增條件"是指核酸擴增反應(yīng)（例如，PCR擴增）中允許引物的雜交和模板 依賴性延伸的條件。術(shù)語"擴增子"是指含有目標(biāo)核酸序列的所有或片段且作為通過任何 合適的擴增方法的體外擴增的產(chǎn)物形成的核酸分子。各種PCR條件描述于化W 知es (M.A.Innis,D.H.Gelfand,和J.J.Sninsky編輯，1995,AcademicPress,San 芭0，說）化菓\\韋.，PCR Protocols : A Guide to Methods and Applications游.k.Innis,D.H.Gelfand,J.J.Sninsky,和T.J.怖ite編輯，AcademicPress,NY, 1990)〇
[0027] 術(shù)語"樣品"是指含有或推測含有來自個體的核酸的任何組合物。在本發(fā)明的背景 下，其中測定胎兒分?jǐn)?shù)的樣品是母體血液和由其衍生的部分，例如血漿。然而，對于本發(fā)明 的某些方面，例如用于測定親本基因型，可W使用任何其他類型的身體樣品，包括但不限于 皮膚、血漿、血清、全血和血液組分、唾液、尿液、淚液、精液、陰道分泌液和其他流體和組織， 包括石蠟包埋組織。樣品還可W包括獲得自個體的細胞的體外培養(yǎng)物的成分和組分。
[0028] 與核酸測序相關(guān)的術(shù)語"有效讀取值"是指成功分配（有或沒有誤差校正）至特 定基因組序列的序列讀取值。關(guān)于HLA等位基因，有效讀取值是成功分配（有或沒有誤差 校正）至預(yù)計存在于樣品中的HLA等位基因之一的序列讀取值。無法被分配至預(yù)計存在于 樣品中的任何等位基因或IMGTHLA序列數(shù)據(jù)庫中的任何序列的讀取值是無效讀取值。
[0029] 本發(fā)明提供了使用人白細胞抗原（HLA)基因座的獨特特性估計胎兒分?jǐn)?shù)的方法。 HLA區(qū)域的基因化LA基因）在人基因組中是最多態(tài)性的。HLA區(qū)域跨越染色體6的短臂上 的近似350萬個堿基對。主要區(qū)域是I類和II類區(qū)域。I類基因是HLA-A、HLA-B和HLA-C， 且主要II類基因是HLA-DP、HLA-DQ和HLA-DR。在蛋白水平表達的多態(tài)性反映于HLA抗原 的氨基酸序列中，且因此對于組織分型用于移植具有很大興趣。運些多態(tài)性，對于II類基 因主要位于外顯子2中，且對于I類基因主要位于外顯子2和3中。然而，對于胎兒分?jǐn)?shù)測 定的目的，所有多態(tài)性，包括沉默變化（不導(dǎo)致氨基酸變化的核巧酸變化），W及HLA基因的 內(nèi)含子和其他非編碼區(qū)中的變化是有用的。
[0030] 選擇HLA基因座作為待檢測的目標(biāo)非母本序列遠優(yōu)于現(xiàn)有目標(biāo)。因此，本發(fā)明是 對于測定胎兒分?jǐn)?shù)的現(xiàn)有方法的重大改進。例如，檢測Y-染色體序列的方法排除女性胎 兒。相反，HLA基因位于常染色體（染色體6)，因此可W在兩種性別中檢測。此外，由于 父親和母親兩者，不像Y染色體標(biāo)志物，具有HLA基因，所W計數(shù)器中的序列讀數(shù)來自與胎 兒分?jǐn)?shù)計算中的分母相同的擴增子。廣泛使用的基于SNP的方法（例如，美國申請系列號 12/644,388)目的在于檢測母本和胎兒序列之間的單核巧酸差異（SNP)。然而，大多數(shù)擴增 和測序技術(shù)是易錯的，使得許多人感覺單核巧酸變化是人為且不正確的SNP。相反，HLA等 位基因彼此差異多個核巧酸。因此，包括檢測HLA基因座內(nèi)的等位基因的方法與非HLA基因 座相比不那么易錯。使用例如克隆測序的目前可用的HLA基因分型方法，使得能夠?qū)⒍鄠€ 連鎖的多態(tài)性的階段設(shè)置于外顯子內(nèi)，且使得可能明確測定每個HLA等位基因的序列。該 特點在從母本DNA區(qū)分胎兒DNA和準(zhǔn)確定量胎兒分?jǐn)?shù)中添加了額外的準(zhǔn)確度。
[0031] 本發(fā)明是定量母體血液或血漿中存在的無細胞DNA間的變體（非母本）HLA序列 的分?jǐn)?shù)或量的方法。所述方法進一步包括通過測定非母本HLA序列與母本HLA序列或HLA 序列的總量相比的比例而獲得胎兒DNA的比例（胎兒分?jǐn)?shù)）的估計值。在一個實施方案 中，所述方法進一步包括使用估計的胎兒分?jǐn)?shù)作為用于測定胎兒非整倍性的參考。在其他 實施方案中，估計的胎兒分?jǐn)?shù)用作用于排斥（即，從診斷程序排除）具有不足量的胎兒DNA 的樣品的闊值。在又另一個實施方案中，所述方法包括使用估計的胎兒分?jǐn)?shù)或胎兒DNA的 量或濃度來診斷先兆子痛的可能性。在本實施方案的變型中，所述方法進一步包括監(jiān)測胎 兒分?jǐn)?shù)或胎兒DNA的量或濃度且如果已經(jīng)檢測到增加則將患者鑒定為具有或可能發(fā)展先 兆子痛。在又另一個實施方案中，所述方法包括使用估計的胎兒分?jǐn)?shù)W確定胎兒中等位基 因的存在或純合狀態(tài)。在本實施方案的變型中，所述方法包括檢測胎兒中的隱性等位基因 的純合狀態(tài)（例如，與死亡率和發(fā)病率相關(guān)的狀態(tài)）。在本實施方案的其他變型中，所述方 法包括檢測胎兒中的等位基因的單一拷貝（例如，關(guān)于隱性等位基因的攜帶者狀態(tài)或關(guān)于 常染色體顯性或單倍體不足化aploinsufficient)的等位基因的與死亡率和發(fā)病率的相 關(guān)的狀態(tài)）。用HLA標(biāo)志物測定的胎兒分?jǐn)?shù)的準(zhǔn)確和精確的估計值在解釋對于突變體疾病 相關(guān)的等位基因獲得的結(jié)果是關(guān)鍵的。可W用本發(fā)明的方法使用任何多態(tài)性HLA基因或基 因座。在一些實施方案中，所述HLA基因選自HLA-A、HLA-B、HLA-C、DRB1、DRB3、DRB4、DRB5、 DQA1、D地1、DPA1和DPB1。在一些實施方案中，祀向HLA基因的特異性外顯子或外顯子的 部分，例如，HLA-A，外顯子2和3 ;HLA-B，外顯子2和3 ;HLA-C，外顯子2和3 ;DQA1:外顯 子2 ;D地1:外顯子2和3 ;DPA1:外顯子2 ;DPB1:外顯子2 ;DRB1:外顯子2、DRB3:外顯子 2 ;DRB4:外顯子2 ;和DRB5:外顯子2。在其他實施方案中，多態(tài)性HLA基因序列包含內(nèi)含 子序列或外顯子和內(nèi)含子序列的組合。
[0032] 在一些實施方案中，W基因?qū)嶒瀸ο蠼M（genepanel)的形式在相同反應(yīng)中分析多 個HLA基因或基因座。在一個實施方案中，所述實驗對象組由基因序列形成，所述基因序列 沒有緊密連鎖，且不處于連鎖不平衡。當(dāng)親本HLA基因型未知時，該方法是特別有利的：使 用幾個不連鎖的基因座確保至少一些基因座將是有信息的（即，關(guān)于胎兒中存在且在母親 中不存在的等位基因在母親和胎兒之間的多態(tài)性）。例如，在本實施方案的變型中，同時分 析來自基因DPB1和D地1或DPB1和DRB1的序列。在另一個實施方案中，所述實驗對象組 由強連鎖不平衡的緊密連鎖的基因序列形成。該方法確保實驗誤差，諸如母本序列中的測 序誤差（其生成對應(yīng)于不同于母本等位基因的已知HLA等位基因的序列）被認(rèn)識到，且作 為"噪聲"而非"信號"被丟棄。例如，如果來自DQA1基因座的序列讀數(shù)與母本等位基因相 差一個堿基，則運些原則上可W，反映胎兒DNA中存在的未知的親本等位基因，或者，相反， 母本等位基因中的測序誤差。如果運些DQA1非母本序列事實上源自胎兒DNA，則會基于已 知的連鎖不平衡模式預(yù)期，所述胎兒將具有特定D地1或DRB1等位基因。如果非母本DQA1 序列事實上是測序誤差，則母本D地1或DRB1序列中的獨立測序誤差會生成預(yù)期的D地1或 DRB1等位基因是極端不可能的。運允許區(qū)分胎兒等位基因（如果親本等位基因是未知的）， 且將其與導(dǎo)致對應(yīng)于已知HLA等位基因的序列的母本等位基因中的測序誤差進行區(qū)分。例 如，在本實施方案的變型中，同時分析來自基因D地1和DRB1的序列。在又另一個實施方 案中，本發(fā)明包括檢測包括彼此連鎖不平衡的兩個或更多個基因和不與剩余部分連鎖不平 衡的至少一個基因的HLA基因的組合。例如，在本實施方案的變型中，同時分析來自基因 DPBUD地1和DRB1的序列。DPB1不與D地1或不與DRB1強連鎖不平衡，盡管D地1和DRB1 彼此連鎖不平衡。
[0033] 可W在平行反應(yīng)中或通過一個、多重反應(yīng)（例如，基因組PCR，其中幾個擴增引物 存在于相同的反應(yīng)體積中）中組合分開的反應(yīng)進行同時分析。在一些實施方案中，本發(fā)明 的方法包括測序步驟，其使得能夠定量檢測樣品中的母本和非母本HLA等位基因。在本實 施方案中，所述方法需要"深度測序"，因為母本血漿或血液中的總DNA的僅一小部分（百分 之幾）預(yù)計源自胎兒。下一代測序（NG巧方法（也稱為大規(guī)模平行測序（MP巧方法）平行 克隆擴增數(shù)百萬個單一DNA分子。然后個別測序每個克隆群體。有時，NGS(MP巧方法被稱 為克隆測序。技術(shù)的進步已經(jīng)允許越來越長的序列讀數(shù)，多達250個且更近多達700個核 巧酸。然而，無細胞胎兒DNAW短片段存在，其中大部分為約160個堿基對長。（參見美國 申請系列號12/940,992)對于此類短目標(biāo)序列，確?，F(xiàn)有測序技術(shù)的穩(wěn)健性能。
[0034] 本發(fā)明的方法的深度測序步驟需要目標(biāo)富集步驟。在一些實施方案中，目標(biāo)富集 步驟包括擴增步驟。在其他實施方案中，使用其他目標(biāo)富集方法，例如，描述于例如美國專 利號7, 867, 703或8, 383, 338中的目標(biāo)富集的基于文庫或基于探針的方法。至少一輪擴 增，例如，第一輪可W通過本領(lǐng)域已知的任何方法來進行。在一些實施方案中，進行多于一 輪，例如，兩輪擴增。在本實施方案的變型中，使用相同的引物進行隨后幾輪的擴增，例如， 通過PCR的擴增。在本實施方案的其他變型中，所述引物的差異在于W3'-方向進一步延 伸至HLA序列（嵌套引物）或在5'-末端具有額外的序列，例如，非HLA序列。
[0035] 在一些實施方案中，富集的目標(biāo)進行通過本領(lǐng)域已知的任何合適的方法的克隆擴 增。在一些實施方案中，克隆擴增包括美國申請系列號12/245, 666中詳細描述的乳液PCR。 簡而言之，在乳液PCR過程中，使來自前輪擴增的擴增子和與寡核巧酸綴合的固相（例如， 珠粒）接觸，所述寡核巧酸能夠與擴增子雜交，例如，經(jīng)由與前輪擴增中使用的引物的銜接 子區(qū)域雜交。作為結(jié)果，所述珠粒攜帶與珠粒上存在的銜接子區(qū)域雜交的退火的擴增子。然 后將珠粒懸浮于水溶液中，且添加油W生成乳液。各珠粒變得懸浮于含有實施克隆輪的擴 增所必要的所有試劑的油封閉的微滴中。各微滴封裝用于擴增反應(yīng)的反應(yīng)室。在本實施方 案的變型中，使用兩種類型的珠粒：一種類型綴合至能夠與擴增子的兩條鏈之一雜交的寡 核巧酸；且第二類型綴合至能夠與擴增子的另一鏈雜交的寡核巧酸。在其他實施方案中，所 述克隆擴增包括如例如美國專利號7, 835, 871、8, 244, 479、8, 315, 817和8, 412, 467中描述 的基于二維表面的（例如，基于載片的）擴增。通常，可用或?qū)⒆兊每捎玫目寺U增的任何 方法在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
[0036] 本發(fā)明的方法包括使用祀向（即，特異性雜交且能夠擴增）HLA基因HLA-A、HLA-B、 化八-(：、01?1、01?3、01?4、01?5、0941、0981、0?41、和0?81的序列的部分的引物。在一些實施 方案中，所述引物祀向HLA基因的某些外顯子或內(nèi)含子，例如，HLA-A，外顯子2和3 ;HLA-B， 外顯子2和3 ;HLA-C，外顯子2和3 ;DQA1:外顯子2 ;D地1:外顯子2和3 ;DPA1:外顯子 2 ;DPB1:外顯子2 ;DRB1:外顯子2、DRB3:外顯子2 ;DRB4:外顯子2 ;和DRB5:外顯子2。在 其他實施方案中，成對的引物祀向外顯子和內(nèi)含子序列的組合。在一些實施方案中，使用表 1中列出的一種或多種引物。如表1中所示，一些引物是基因特異性的，即，可W從僅一個基 因擴增序列。其他引物是通用的，即，可W從多于一個基因擴增序列。
[0037] 在一些實施方案中，為了測定樣品中的胎兒分?jǐn)?shù)，在相同基因座的母本和非母本 HLA等位基因的量通過數(shù)字小滴PCR定量測定。數(shù)字小滴PCR(ddPCR)使得能夠絕對測量 樣品中的目標(biāo)核酸，甚至在非常低的濃度。所述ddPCR方法包括數(shù)字稀釋或小滴生成、PCR 擴增、檢測和（任選）分析的步驟。小滴生成步驟包括生成多個單獨反應(yīng)體積（小滴），各 自含有進行核酸擴增所必需的試劑。PCR擴增步驟包括使小滴（或更大的反應(yīng)體積，其中已 經(jīng)沉積小滴）經(jīng)受適于擴增核酸目標(biāo)W生成擴增子的熱循環(huán)條件。檢測步驟包括鑒定含有 和不含擴增子的小滴（或更大的反應(yīng)體積，其中已經(jīng)沉積小滴）。分析步驟包括產(chǎn)生例如樣 品中的目標(biāo)核酸的濃度、絕對量或相對量（與另一目標(biāo)相比）的定量。
[003引ddPCR步驟可W手動（即，用通用設(shè)備）進行或用?？谠O(shè)備（諸如例如，得自Bio-RadL油S.化ercules,Cal.)或RainDanc