專利名稱：母體血漿中無細(xì)胞胎兒dna的兩步富集的制作方法
母體血漿中無細(xì)胞胎兒DNA的兩步富集盡管胎兒DNA存在于母體血漿中，但其水平相對較低，不能進(jìn)行常規(guī)產(chǎn)前遺傳 分析。不愿拘于任何理論，我們相信部分胎兒DNA被包裹，并因此受保護(hù)而免于血漿內(nèi) 切核酸酶的威脅。我們提出一種結(jié)合了兩種不同方法的新型富集技術(shù)。首先用DNA酶 處理分離的血漿以有效減少污染性無細(xì)胞母體DNA片段的百分比。隨后胎兒序列的增加 使用修改的全基因組擴(kuò)增(WGA)技術(shù)實(shí)現(xiàn)。方法將血漿從母體全血(η = 24)中分離，然后用濃度逐漸增加的DNA酶處 理。在進(jìn)行修改的WGA實(shí)驗(yàn)方法之前使用Qiagen DNA提取小型試劑盒(Qiagen DNA extraction mini kit)對經(jīng)DNA酶處理的DNA進(jìn)行進(jìn)一步加工以富集較小的DNA片段。胎 兒序列的存在使用實(shí)時Taqman PCR(RT-PCR)測定β -珠蛋白和DYSl序列水平來加以確證。結(jié)果在所有DNA酶處理后檢測出胎兒DNA序列。在WGA之前和之后均確 證具有男性胎兒的全部試樣(η = 10)中達(dá)成了對男性胎兒的正確檢測。除了正確的性別 確定外，進(jìn)行了最高量的DNA酶處理以及修改的WGA實(shí)驗(yàn)方法的試樣(η = 7)顯示了 胎兒序列的顯著富集，達(dá)到了 50%的胎兒DNA。結(jié)論結(jié)果確認(rèn)了血漿中的胎兒DNA受到保護(hù)，并對DNA酶處理導(dǎo)致的降解 具有抗性。這些初步數(shù)據(jù)還提示可達(dá)成最理想水平的DNA酶處理，其允許使用WGA進(jìn) 行進(jìn)一步富集。觀察到DNA酶主要消除母體序列，這提示無細(xì)胞胎兒DNA與其母體對 應(yīng)物的包裹方式不同，從而允許對胎兒序列的優(yōu)先富集。背景介紹產(chǎn)前遺傳診斷一直依賴侵入性方法，如羊膜腔穿刺術(shù)或絨毛膜取樣(chorionic villous sampling, CVS)。盡管這些方法多年來提供了可靠的結(jié)果，其仍舊對胎兒具有些 微的風(fēng)險α)。自從在母體血漿中發(fā)現(xiàn)了可擴(kuò)增的胎兒無細(xì)胞核酸α)，就有許多研究 以確定臨床非侵入性產(chǎn)前遺傳測試的潛力為目標(biāo)。盡管這些研究中的許多都顯示出很大 的希望，但是胎兒DNA的小存在量使其難以在臨床上實(shí)施。因此，我們著眼于改善胎 兒DNA的分離和富集方法。不愿拘于任何理論，相信這些循環(huán)的核苷酸是胎兒細(xì)胞經(jīng) 歷凋亡的結(jié)果Q)。在血漿中(已知含有核酸酶)的無細(xì)胞DNA和RNA的相對穩(wěn)定性 表明這些核酸在具膜小泡(membrane bound vesicle)中進(jìn)行循環(huán)，所述小泡的形成是程序 性細(xì)胞死亡的結(jié)果(4)。這些胎兒DNA片段亦可在大小上區(qū)別于母體片段，胎兒片段 (< 300bp)通常小于母體片段(> 500bp) (5 ； JorgezC 等，2007)。我們描述了一種新型兩步富集胎兒片段的方法。第一階段涉及用DNA酶處理總 母體血漿(母體和胎兒DNA片段均包含在內(nèi))。鑒于胎兒片段更加穩(wěn)定，并可能由具膜 的凋亡小體(apoptoticbody)包裹，我們假設(shè)DNA酶處理會耗盡全部(未包裹的)母源序 列。第二階段涉及修改的全基因組擴(kuò)增(WGA)實(shí)驗(yàn)方法，其設(shè)計為擴(kuò)增較小的片段， 推定為胎兒片段。方法經(jīng)過IRB的批準(zhǔn)和書面同意，收集了總共24個全血試樣(10個確證為懷有男性，平均胎齡是18 1/7周，范圍為11 4/7到25 2/7周；12個確證為懷有女性，平均胎 齡是20 1/14周，范圍為9 6/7到37 4/7周；以及2個未懷孕的對照，一個男性和一個女 性)。對于每一個，對ACD真空采集管(vecutainer)中抽取的大約30ml的血液進(jìn)行處 理，通過在800g下IOmin的初始離心將血漿與細(xì)胞級分分離。去除血漿級分，并再一次 在16000g下離心IOmin以進(jìn)一步去除任何污染的細(xì)胞顆粒。隨即將該級分以800 μ 1的 等分試樣冷凍，之后解凍以供同時批量處理(simultaneous batch process)。將每份800 μ 1 的血漿試樣在室溫下解凍，隨后對其進(jìn)行不同濃度的(未處理、Ιμ 、5μ1、10 μ L 30 μ 1的1單位/ μ 1) DNA酶(Promega，Cat#M6101)處理。將試樣在37 °C下溫育1小 時，然后添加終止溶液。隨后使用Qiagen QiAamp Blood Mini Kit(Cat#51106)對試樣進(jìn) 行DNA提取，并洗脫得到終體積100 μ 1。隨后使用稍作修改的GenomePlex Complete Whole Genome Amplification (WGA) Kit (Sigma, Cat #WGA2_50rxn)的實(shí)驗(yàn)方法施用于 七個母體血樣(四個確證為男性胎兒，而三個確證為女性胎兒(4 confirmed males, and 3 confirmed females))。我們對該方法進(jìn)行了修改，首先由于靶序列的預(yù)期大小省略了生 產(chǎn)商建議的斷裂溫育。其次將擴(kuò)增步驟的循環(huán)數(shù)增加到20，而不是建議的14。擴(kuò)增的 試樣儲存于4°C，直至進(jìn)行RT-PCR分析以供檢測并量化β-珠蛋白(BGL0354F: GTG CAC CTGACT CCT GAG GAGA, BGL0455R CCT TGA TAC CAA CCT GCC CAG) (6) 禾口 DYSl (DYSIF TCC TGC TTA TCC AAA TTC ACC AT, DYSlR ACT TCC CTC TGA CAT TAC CTG ATA ATT G) (7) (Applied Biosystems 7700，F(xiàn)oster City, CA)。富集水平 基于按照DYSl對β-珠蛋白的比例計算出的％胎兒DNA來確定。β-珠蛋白代表分離 DNA的總量(母體的和胎兒的)，而在確證為懷有男性胎兒時，DYSl代表試樣中存在的 胎兒DNA的量。結(jié)果在對未懷孕對照試樣進(jìn)行初始DNA酶處理之后，β “珠蛋白和DYSl的水平作 為添加酶的量的函數(shù)均有所減少。兩者均被DNA酶處理有效的消除(

圖1)。在母體試 樣中，盡管檢測出的β-珠蛋白水平下降，但這些水平即使經(jīng)更加嚴(yán)苛的DNA酶處理仍 保持不變(對于男性胎兒母體的情況為916.5士91.2Geq/ml，而對于女性胎兒母體的情況 為610.5士389.62Geq/ml)。未在任何已知懷有女性胎兒的情況下檢測到假陽性的DYSl 水平。然而，在已知懷有男性胎兒的情況中(η= 10)，在所有的處理增量下均100% 的檢測出了 DYSl 序列(0μ1 127.4士72.3Geq/ml，Ιμ 71.4士57.3Geq/ml，5μ1 71 士 58.6Geq/ml，10 μ 1 57.1 士46.6Geq/ml，30 μ 1 154士 179.6Geq/ml)。對七個經(jīng)DNA酶處理的母體試樣(三個女性胎兒和四個男性胎兒)進(jìn)行了 WGA。盡管在所有試樣中檢測出了胎兒序列，但是僅在接受30 μ IDNA酶處理的試樣中 觀察到了胎兒 DYSl 序列水平的增加(0μ1 1979 士 2083.9Geq/ml，Ιμ 1.62 士 1.6Geq/ ml, 5μ 1 723.5 士 875.7Geq/ml，10 μ 1 0.83 士 1.22Geq/ml，30 μ 1 7025 士 4381Geq/ ml)。如此表明更加嚴(yán)格的DNA酶處理對將母體序列(基于β _珠蛋白)消減到不以能 夠在與DYSl序列擴(kuò)增的競爭中勝出的水平存在的程度而言是必要的。在接受30 μ IDNA 酶繼以修改的WGA實(shí)驗(yàn)方法的試樣中，我們能夠達(dá)成均值為49.96%的胎兒DNA。在 未經(jīng)DNA酶處理而僅進(jìn)行了修改的WGA的試樣中，試樣間的平均胎兒DNA百分比為 11.16%。經(jīng)1、5、IOyl的1單位/yl DNA酶處理的試樣在WGA后分別具有平均值為0.01%, 3.5%和0.01%的胎兒DNA。在WGA前，所述試樣具有從0.05%到0.17%范圍 的百分比。討論我們的結(jié)果說明無細(xì)胞胎兒DNA對由DNA酶造成的降解具有抗性，支持了無 細(xì)胞胎兒DNA包裹于具膜小泡中的假說。我們有效地去除了母體序列，以及任何可能導(dǎo) 致假陽性結(jié)果的污染序列。無細(xì)胞胎兒的DNA水平在患者試樣中相對對照試樣持續(xù)不 變。這一發(fā)現(xiàn)確證胎兒序列對降解具有抗性，且與母體序列相比以不同的方式受到保護(hù) 或包裹。β-珠蛋白水平代表總DNA(母體的和胎兒的)，因此無法檢測出β-珠蛋白的 完全消化并不令人驚訝，因?yàn)槠湟徊糠趾芸赡苁翘旱?。胎兒序列似乎具有?dú)特的分子 特征，將其與母體序列區(qū)分開來，并使富集成為可能。檢測出所有的男性案例且無假陽 性表明DNA酶處理在消除不需要的母體序列中具有新用途，所述母體序列在循環(huán)中進(jìn)一 步發(fā)生了降解。GenomePlex Complete Whole Genome Amplification Kit (Sigma-Aldrich)通過 首先隨機(jī)斷裂(fragment)DNA，并隨即在其末端附加共有序列來擴(kuò)增基因組DNA，所 述共有序列是用于通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增所有片段。我們消除了所述方法中 的斷裂步驟以阻止較大的母體序列被斷裂從而隨后被擴(kuò)增。這潛在地為小的事先存在 (pre-existing)的斷裂胎兒序列在擴(kuò)增過程中提供了優(yōu)勢。WGA增加了經(jīng)受最嚴(yán)格DNA 酶處理的試樣中胎兒對母體的比例。在WGA前，胎兒DNA的平均％在所有處理水平下 均小于1%。然而，在經(jīng)受30 μ 1 DNA酶以及修改的WGA實(shí)驗(yàn)方法的試樣中，得到了 50%的胎兒DNA，表明其為在母體血漿中富集無細(xì)胞胎兒DNA的可行方法?；讦?珠 蛋白水平，DNA酶似乎減少了試樣中存在的母體序列的量，使胎兒序列得以擴(kuò)增。母體 核酸的降解阻止了其在PCR反應(yīng)中與胎兒序列的擴(kuò)增競爭。經(jīng)受較溫和(1、5、10 μ 1) DNA酶處理的試樣在WGA后與未經(jīng)DNA酶處理的試樣相比較顯示出較低的胎兒對母 體的比例。一個可能的解釋是，在這些試樣中，較大的母體序列被降解，但未完全被消 除，產(chǎn)生替代原WGA實(shí)驗(yàn)方法中的斷裂步驟的效果，從而允許對所述母體序列更有效的 擴(kuò)增。我們描述的組合方法允許我們克服兩個限制非侵入性產(chǎn)前DNA遺傳測試的主要 難題胎兒對母體比例低，以及胎兒DNA的量小。總體而言，該新型兩步富集方法在擴(kuò) 增后的選擇性富集方面顯示了很大的潛力。鳴謝NIH研究基金參考文獻(xiàn)1.TaborA, Philip J, Madsen Μ, Banq J, Obel EB, N0rgaard Pedersen B.Randomised controlled trial of genetic amniocentesis in 4606 low-risk women.Lancet 1986 ； 8493 1287-93.2.Lo YM, Corbetta N, Chamberlain PF，Rai V, Sargent IL，Redman CW and Wainscoat JS.Presence of fetal DNA in maternal plasma and serum丄ancet 1997 ； 350 485-7.3.Bischoff FZ, Lewis DE, Simpson JL.CeU—free fetal DNA in maternal blood kinetics, source and structure.Human Reproductive Update 2004 ； 11: 59—67.
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權(quán)利要求
1.一種富集胎兒核酸的方法，包括用包含具有DNA酶活性的試劑的組合物處理含有無細(xì)胞胎兒核酸的母體生物試樣，其中在處理前所述生物試樣中胎兒核酸的第一百分比低于處理后所述生物試樣中胎 兒核酸的第二百分比。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述生物試樣是母體的血樣。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述生物試樣是母體的血漿或血清試樣。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述具有DNA酶活性的試劑是DNA酶。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述具有DNA酶活性的試劑是DNA酶且所述DNA酶的 量為約10到200單位/μ 。
6.權(quán)利要求1的方法，其中所述第二百分比為約10%到50%。
7.權(quán)利要求1的方法，其中所述第二百分比為至少10%、20%,30%, 40%或 50%。
8.權(quán)利要求1的方法，其中在處理前所述生物試樣中母體核酸的第一百分比高于處理 后所述生物試樣中母體核酸的第二百分比。
9.權(quán)利要求1的方法，進(jìn)一步包括在處理后擴(kuò)增所述生物試樣中的胎兒核酸。
10.權(quán)利要求1的方法，進(jìn)一步包括通過全基因組擴(kuò)增(WholeGenome Amplification, WGA)方法在處理后擴(kuò)增所述生物試樣中的胎兒核酸。
11.權(quán)利要求10的方法，其中進(jìn)行所述WGA方法不用斷裂溫育。
12.一種由權(quán)利要求1的方法獲得的混合物。
13.—種由權(quán)利要求1的方法獲得的混合物，其中所述混合物含有至少10%、20%, 30%, 40%或50%的胎兒核酸。
14.一種在胎兒核酸中檢測標(biāo)志物存在或不存在的方法，包括用包含具有DNA酶活性的試劑的組合物處理含有無細(xì)胞胎兒核酸的母體生物試樣，在處理后擴(kuò)增所述生物試樣中的胎兒核酸，和在擴(kuò)增過程中或之后在胎兒核酸中檢測標(biāo)志物的存在或不存在。
15.權(quán)利要求14的方法，其中所述生物試樣是血漿或血清試樣。
16.權(quán)利要求14的方法，其中所述試劑是DNA酶。
17.權(quán)利要求14的方法，其中所述擴(kuò)增通過全基因組擴(kuò)增(WGA)方法進(jìn)行。
18.權(quán)利要求17的方法，其中進(jìn)行所述WGA方法不用斷裂溫育。
19.權(quán)利要求14的方法，其中擴(kuò)增后胎兒核酸的百分比為至少10%、20%,30%, 40%或 50%。
20.—種自凋亡或壞死細(xì)胞富集無細(xì)胞核酸的方法，包括用包含具有DNA酶活性的試劑的組合物處理含有來自凋亡或壞死細(xì)胞的無細(xì)胞核酸 的生物試樣，其中在處理前來自凋亡或壞死細(xì)胞的無細(xì)胞核酸的第一百分比低于處理后所述生物 試樣中來自凋亡或壞死細(xì)胞的無細(xì)胞核酸的第二百分比。
21.權(quán)利要求20的方法，其中所述生物試樣是血樣、血漿試樣或血清試樣。
22.權(quán)利要求20的方法，其中所述具有DNA酶活性的試劑是DNA酶。
23.權(quán)利要求20的方法，其中所述具有DNA酶活性的試劑是DNA酶且所述DNA酶的量為約10到200單位/μ 。
24.權(quán)利要求20的方法，其中所述無細(xì)胞核酸來自腫瘤細(xì)胞或贅生性細(xì)胞(neoplastic cell) ο
25.權(quán)利要求20的方法，進(jìn)一步包括通過全基因組擴(kuò)增(WGA)方法在處理后擴(kuò)增所 述生物試樣中的無細(xì)胞核酸。
26.—種在腫瘤或贅生物核酸(neoplasticnucleic acid)中檢測標(biāo)志物的存在或不存在的 方法，包括用包含具有DNA酶活性的試劑的組合物處理含有來自腫瘤或贅生性細(xì)胞的無細(xì)胞核 酸的生物試樣，在處理后擴(kuò)增所述生物試樣中的無細(xì)胞核酸，和 在擴(kuò)增過程中或之后檢測腫瘤或贅生物核酸中標(biāo)志物的存在或不存在。
27.權(quán)利要求26的方法，其中所述生物試樣是血樣、血漿試樣或血清試樣。
28.權(quán)利要求26的方法，其中所述試劑是DNA酶。
29.權(quán)利要求26的方法，其中所述擴(kuò)增通過全基因組擴(kuò)增(WGA)方法進(jìn)行。
30.權(quán)利要求26的方法，其中進(jìn)行所述WGA方法不用斷裂溫育。
全文摘要
本發(fā)明提供了在來自母體的生物試樣中富集胎兒核酸的方法。還提供了檢測胎兒、腫瘤或贅生物核酸中標(biāo)志物存在或不存在的方法。所述方法可包括用DNA酶處理所述生物試樣，并任選地，對經(jīng)處理的試樣進(jìn)行全基因組擴(kuò)增。所述生物試樣可為，例如，血樣。
文檔編號C12Q1/34GK102016069SQ200980111659
公開日2011年4月13日 申請日期2009年1月30日 優(yōu)先權(quán)日2008年1月30日
發(fā)明者法里德·比肖夫 申請人:諾瓦蒂斯公司