使用hla標(biāo)志物測(cè)定母體血液中的胎兒dna的分?jǐn)?shù)的方法
【專利說(shuō)明】使用HLA標(biāo)志物測(cè)定母體血液中的胎兒DNA的分?jǐn)?shù)的方法
[0001] 1997年在母體血液中發(fā)現(xiàn)無(wú)細(xì)胞胎兒DNA已經(jīng)開(kāi)啟了非侵襲性產(chǎn)前診斷和篩 選的新領(lǐng)域。循環(huán)胎兒DNA的用途包括化組基因分型W及篩選非整倍性和單基因疾 病，綜述于Jiang,P.,等K但FetalQuant: deducing fractional fetal DNA concentration from massively parallel sequencing of DNA in maternal plasma， Bioin化rmatics28:2883。此類診斷應(yīng)用需要母體循環(huán)中存在的總DNA內(nèi)的胎兒DNA的 分?jǐn)?shù)（也被稱為"胎兒分?jǐn)?shù)"）的知識(shí)。對(duì)于一些應(yīng)用，運(yùn)將是僅僅質(zhì)量控制問(wèn)題。例如， 由CLIA實(shí)驗(yàn)室提供的一些目前的商業(yè)非侵襲性產(chǎn)前診斷（NIPD)測(cè)試表明，如果母體血漿 中的DNA的<4%是胎兒的，則測(cè)試結(jié)果將是無(wú)法得出結(jié)論的，所W不運(yùn)行測(cè)試。對(duì)于其他應(yīng) 用，諸如非整倍性和隱性等位基因的拷貝數(shù)的檢測(cè)，胎兒分?jǐn)?shù)的精確測(cè)定是必需的。
[0002] 目前定量母體血漿中的胎兒DNA的方法設(shè)及檢測(cè)Y染色體基因座（例如，SRY 或DYS14,美國(guó)專利號(hào)6, 258, 540);檢測(cè)胎兒表觀遺傳標(biāo)志物（例如，基因乳腺絲抑蛋白、 RASSF1A和沈RPINB2的甲基化模式，綜述于H址n,S.，等人，（2011) acids as potential markers for preeclampsia,Placenta, 32:sl7);或希望發(fā)現(xiàn)可 區(qū)分母本DNA與胎兒DNA的有信息的單核巧酸多態(tài)性（SNP)，而祀向大量的染色體基因座 (美國(guó)申請(qǐng)系列號(hào)12/644, 388)?；赮-染色體的方法的明顯缺點(diǎn)是其不適用于女性胎兒。 由于缺乏可重復(fù)性，表觀遺傳方法是不佳的。使用多個(gè)SNP的方法（例如，Jiang,等人，同 上）在整個(gè)基因組尋找有信息的SNP中需要復(fù)雜數(shù)學(xué)分析。測(cè)定胎兒分?jǐn)?shù)的更可預(yù)測(cè)且精 確的方式是期望的。
[000引發(fā)明概述 本發(fā)明是測(cè)定樣品中胎兒核酸的分?jǐn)?shù)的方法，其包括：定量檢測(cè)所述樣品中的至少一 種非母本HLA等位基因；定量檢測(cè)所述樣品中在相同基因座的至少一種母本HLA等位基因； 使用上述檢測(cè)的量，測(cè)定所述樣品中胎兒核酸的分?jǐn)?shù)。在一些實(shí)施方案中，所述測(cè)定步驟包 括計(jì)算步驟中測(cè)定的所述非母本HLA等位基因的量與所有HLA等位基因的量的總和的比率 的2倍。在一些實(shí)施方案中，所述至少一種非母本和母本HLA等位基因選自HLA-A、HLA-B、 HLA-C、DRB1、DRB3、DRB4、DRB5、DQA1、D地 1、DPA1 和DPB1 等位基因、或HLA-A，外顯子 2 和 3;HLA-B，外顯子2和3;HLA-C，外顯子2和3;DQA1，外顯子2;D地1，外顯子2和3;DPA1， 外顯子2 ;DPB1，外顯子2 ;DRB1，外顯子2 ;DRB3,外顯子2 ;DRB4,外顯子2 ;和DRB5,外顯子 2或來(lái)自所述HLA基因的內(nèi)含子序列或來(lái)自所述基因的外顯子和內(nèi)含子序列的組合。在一 些實(shí)施方案中，所述HLA等位基因通過(guò)包括W下的方法定量檢測(cè)：測(cè)序，具體而言克隆測(cè)序 和任選包括克隆擴(kuò)增的步驟。在一些實(shí)施方案中，所述克隆擴(kuò)增步驟用正向引物和反向引 物進(jìn)行，各引物包含銜接序列和HLA-雜交序列。在一些實(shí)施方案中，所述方法包括在測(cè)序 之前的目標(biāo)富集步驟，例如，通過(guò)至少一輪基因組DNA擴(kuò)增或通過(guò)目標(biāo)捕獲。在一些實(shí)施方 案中，所述HLA等位基因通過(guò)包括W下的方法定量檢測(cè)：用正向引物和反向引物擴(kuò)增，W獲 得HLA擴(kuò)增子；進(jìn)行克隆測(cè)序W測(cè)定HLA擴(kuò)增子的序列；鑒定在相同基因座的至少一種 母本HLA等位基因和至少一種非母本HLA等位基因；比較母本和非母本HLA序列克隆的 數(shù)目，從而測(cè)定所述樣品中胎兒核酸的分?jǐn)?shù)。在一些實(shí)施方案中，所述鑒定步驟包括W下 計(jì)算步驟：將在所述HLA基因座的序列與HLA序列數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比較；將所述序列分選至對(duì) 應(yīng)于已知HLA等位基因的多個(gè)箱化ins);將一個(gè)或兩個(gè)多數(shù)序列鑒定為母本等位基因； 將一個(gè)或兩個(gè)最代表的少數(shù)序列鑒定為非母本等位基因。在一些實(shí)施方案中，所述比較步 驟包括計(jì)算所述鑒定步驟中鑒定的在相同基因座的所述非母本HLA等位基因與HLA等位 基因的總數(shù)的比率的兩倍。在一些實(shí)施方案中，測(cè)定HLA擴(kuò)增子的序列包括邊合成邊測(cè)序 (sequencingbysynthesis)。在一些實(shí)施方案中，在兩個(gè)、S個(gè)或更多個(gè)基因座（例如， DPBUD地1和DRB1)檢測(cè)在相同基因座的所述非母本HLA等位基因和所述母本HLA等位基 因。在一些實(shí)施方案中，在相同反應(yīng)體積中通過(guò)多重PCR同時(shí)擴(kuò)增在兩個(gè)、S個(gè)或更多個(gè)基 因座的所述非母本和母本HLA等位基因。在一些實(shí)施方案中，所述HLA等位基因通過(guò)包括 數(shù)字PCR的方法定量檢測(cè)。在一些實(shí)施方案中，所述HLA等位基因通過(guò)包括W下的方法定 量檢測(cè)：將所述樣品分成多個(gè)反應(yīng)體積，各自包含零至近似五個(gè)拷貝的目標(biāo)HLA等位基因； 測(cè)定各反應(yīng)體積中目標(biāo)HLA等位基因的存在；將含有所述非母本HLA等位基因的反應(yīng)體積 的數(shù)目與含有在相同基因座的母本HLA等位基因的反應(yīng)體積的數(shù)目進(jìn)行比較，從而測(cè)定所 述樣品中胎兒核酸的分?jǐn)?shù)。在本實(shí)施方案的變型中，所述測(cè)定包括通過(guò)數(shù)字PCR擴(kuò)增。在 一些實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包括獨(dú)立獲得在至少一個(gè)HLA基因座的父母一方或雙方 的基因型信息。
[0004] 在又另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明是檢測(cè)胎兒中的染色體異常的方法，其包括：提供 來(lái)自懷有所述胎兒的母親的血液樣品；通過(guò)包括W下的方法測(cè)定所述樣品中的胎兒核酸的 分?jǐn)?shù)：定量檢測(cè)所述樣品中的至少一種非母本HLA等位基因，定量檢測(cè)所述樣品中在相同 基因座的至少一種母本HLA等位基因，比較所述母本和非母本HLA等位基因的量，從而測(cè)定 所述樣品中胎兒核酸的濃度；定量檢測(cè)所述樣品中的來(lái)自懷疑異常的至少一個(gè)染色體的基 因座；確定先前步驟中檢測(cè)的染色體基因座是否W相對(duì)于第二步驟中測(cè)定的胎兒DNA的濃 度的異常量存在，從而檢測(cè)染色體異常。在該實(shí)施方案的變型中，所述至少一種非母本HLA 等位基因選自HLA-A、HLA-B、HLA-C、DRB1、DRB3、DRB4、DRB5、DQA1、D地1、DPA1 和DPB1 等 位基因，包括HLA-A，外顯子2和3 ;HLA-B，外顯子2和3 ;HLA-C，外顯子2和3 ;DQA1，外顯 子2 ;D地1，外顯子2和3 ;DPA1，外顯子2 ;DPB1，外顯子2 ;DRB1，外顯子2 ;DRB3,外顯子2 ; DRB4,外顯子2 ;和DRB5,外顯子2或來(lái)自所述基因的外顯子和內(nèi)含子序列的組合。在該實(shí) 施方案的變型中，在兩個(gè)、S個(gè)或更多個(gè)基因座（例如，來(lái)自基因DPBUD地1和DRB1)檢測(cè) 在相同基因座的所述非母本HLA等位基因和所述母本HLA等位基因。在一些實(shí)施方案中， 所述HLA等位基因通過(guò)包括W下的方法定量檢測(cè)：測(cè)序，具體而言克隆測(cè)序和任選包括克 隆擴(kuò)增的步驟。在一些實(shí)施方案中，所述克隆擴(kuò)增步驟用正向引物和反向引物進(jìn)行，各引物 包含銜接序列和HLA-雜交序列。在一些實(shí)施方案中，所述方法包括在測(cè)序之前的目標(biāo)富集 步驟，例如，通過(guò)至少一輪基因組DNA擴(kuò)增或通過(guò)目標(biāo)捕獲。在一些實(shí)施方案中，所述HLA 等位基因通過(guò)包括W下的方法定量檢測(cè)：用正向引物和反向引物擴(kuò)增，W獲得HLA擴(kuò)增子； 進(jìn)行克隆測(cè)序W測(cè)定HLA擴(kuò)增子的序列；鑒定在相同基因座的至少一種母本HLA等位基因 和至少一種非母本HLA等位基因；比較母本和非母本HLA序列克隆的數(shù)目，從而測(cè)定所述樣 品中胎兒核酸的分?jǐn)?shù)。在一些實(shí)施方案中，所述鑒定步驟包括W下計(jì)算步驟：將在所述HLA 基因座的序列與HLA序列數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比較；將所述序列分選至對(duì)應(yīng)于已知HLA等位基因的 多個(gè)箱化ins);將一個(gè)或兩個(gè)多數(shù)序列鑒定為母本等位基因；將一個(gè)或兩個(gè)最代表的少數(shù) 序列鑒定為非母本等位基因。在一些實(shí)施方案中，所述比較步驟包括計(jì)算所述鑒定步驟中 鑒定的在相同基因座的所述非母本HLA等位基因與HLA等位基因的總數(shù)的比率的兩倍。在 一些實(shí)施方案中，測(cè)定HLA擴(kuò)增子的序列包括邊合成邊測(cè)序。在一些實(shí)施方案中，在兩個(gè)、 S個(gè)或更多個(gè)基因座（例如，DPB1、D地1和DRB1)檢測(cè)在相同基因座的所述非母本HLA等 位基因和所述母本HLA等位基因。在一些實(shí)施方案中，在相同反應(yīng)體積中通過(guò)多重PCR同 時(shí)擴(kuò)增在兩個(gè)、=個(gè)或更多個(gè)基因座的所述非母本和母本HLA等位基因。在一些實(shí)施方案 中，所述HLA等位基因通過(guò)包括數(shù)字PCR的方法定量檢測(cè)。在一些實(shí)施方案中，所述HLA等 位基因通過(guò)包括W下的方法定量檢測(cè)：將所述樣品分成多個(gè)反應(yīng)體積，各自包含零至近似 五個(gè)拷貝的目標(biāo)HLA等位基因；測(cè)定各反應(yīng)體積中目標(biāo)HLA等位基因的存在；將含有所述 非母本HLA等位基因的反應(yīng)體積的數(shù)目與含有在相同基因座的母本HLA等位基因的反應(yīng)體 積的數(shù)目進(jìn)行比較，從而測(cè)定所述樣品中胎兒核酸的分?jǐn)?shù)。在本實(shí)施方案的變型中，所述測(cè) 定包括通過(guò)數(shù)字PCR擴(kuò)增。在一些實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包括獨(dú)立獲得在至少一個(gè) HLA基因座的父母一方或雙方的基因型信息。
[0005] 在又另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明是通過(guò)確定患者血液中的胎兒分?jǐn)?shù)是否超過(guò)闊值 水平而確定懷孕患者是否具有或可能發(fā)展先兆子痛的方法，其中通過(guò)包括W下的方法來(lái)測(cè) 定所述胎兒分?jǐn)?shù)：提供來(lái)自患者的血液樣品；定量檢測(cè)所述樣品中的至少一種非母本HLA 等位基因；定量檢測(cè)所述樣品中在相同基因座的至少一種母本HLA等位基因；比較所述母 本和非母本HLA等位基因的量，從而測(cè)定所述樣品中的胎兒分?jǐn)?shù)。在該實(shí)施方案的變型中， 所述至少一種非母本HLA等位基因選自HLA-A、HLA-B、HLA-C、DRB1、DRB3、DRB4、DRB5、DQA1、 D地UDPA1和DPB1等位基因，例如，HLA-A，外顯子2和3 ;HLA-B，外顯子2和3 ;HLA-C，外顯 子2和3 ;DQA1，外顯子2 ;D地1，外顯子2和3 ;DPA1，外顯子2 ;DPB1，外顯子2 ;DRB1，外顯子 2 ;DRB3,外顯子2 ;DRB4,外顯子2 ;和DRB5,外顯子2或來(lái)自所述基因的外顯子和內(nèi)含子序 列的組合。在一些實(shí)施方案中，所述HLA等位基因通過(guò)包括W下的方法定量檢測(cè)：測(cè)序，具 體而言克隆測(cè)序和任選包括克隆擴(kuò)增的步驟。在一些實(shí)施方案中，所述克隆擴(kuò)增步驟用正 向引物和反向引物進(jìn)行，各引物包含銜接序列和HLA-雜交序列。在一些實(shí)施方案中，所述 方法包括在測(cè)序之前的目標(biāo)富集步驟，例如，通過(guò)至少一輪基因組DNA擴(kuò)增或通過(guò)目標(biāo)捕 獲。在一些實(shí)施方案中，所述HLA等位基因通過(guò)包括W下的方法定量檢測(cè)：用正向引物和反 向引物擴(kuò)增，W獲得HLA擴(kuò)增子；進(jìn)行克隆測(cè)序W測(cè)定HLA擴(kuò)增子的序列；鑒定在相同基因 座的至少一種母本HLA等位基因和至少一種非母本HLA等位基因；比較母本和非母本HLA 序列克隆的數(shù)目，從而測(cè)定所述樣品中胎兒核酸的分?jǐn)?shù)。在一些實(shí)施方案中，所述鑒定步驟 包括W下計(jì)算步驟：將在所述HLA基因座的序列與HLA序列數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比較；將所述序列 分選至對(duì)應(yīng)于已知HLA等位基因的多個(gè)箱化ins);將一個(gè)或兩個(gè)多數(shù)序列鑒定為母本等位 基因；將一個(gè)或兩個(gè)最代表的少數(shù)序列鑒定為非母本等位基因。在一些實(shí)施方案中，所述比 較步驟包括計(jì)算所述鑒定步驟中鑒定的在相同基因座的所述非母本HLA等位基因與HLA等 位基因的總數(shù)的比率的兩倍。在一些實(shí)施方案中，測(cè)定HLA擴(kuò)增子的序列包括邊合成邊測(cè) 序。在一些實(shí)施方案中，在兩個(gè)、S個(gè)或更多個(gè)基因座（例如，DPB1、D地1和DRB1)檢測(cè)在 相同基因座的所述非母本HLA等位基因和所述母本HLA等位基因。在一些實(shí)施方案中，在 相同反應(yīng)體積中通過(guò)多重PCR同時(shí)擴(kuò)增在兩個(gè)、S個(gè)或更多個(gè)基因座的所述非母本和母本 HLA等位基因。在一些實(shí)施方案中，所述HLA等位基因通過(guò)包括數(shù)字PCR的方法定量檢測(cè)。 在一些實(shí)施方案中，所述HLA等位基因通過(guò)包括W下的方法定量檢測(cè)：將所述樣品分成多 個(gè)反應(yīng)體積，各自包含零至近似五個(gè)拷貝的目標(biāo)HLA等位基因；測(cè)定各反應(yīng)體積中目標(biāo)HLA 等位基因的存在；將含有所述非母本HLA等位基因的反應(yīng)體積的數(shù)目與含有在相同基因座 的母本HLA等位基因的反應(yīng)體積的數(shù)目進(jìn)行比較，從而測(cè)定所述樣品中胎兒核酸的分?jǐn)?shù)。 在本實(shí)施方案的變型中，所述測(cè)定包括通過(guò)數(shù)字PCR擴(kuò)增。在一些實(shí)施方案中，所述方法進(jìn) 一步包括獨(dú)立獲得在至少一個(gè)HLA基因座的父母一方或雙方的基因型信息。
[0006] 在本實(shí)施方案的又另一個(gè)變型中，本發(fā)明是通過(guò)經(jīng)由上文所述的方