固定脂肪酶的磁性氧化石墨復(fù)合物載體的制備方法及其固定脂肪酶的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及到一種固定化脂肪酶的載體的制備方法及其固定脂肪酶的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]現(xiàn)代生物技術(shù)在化學(xué)領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用，其中的酶催化反應(yīng)高效，專一，但是也有一定的缺點(diǎn)，比如游離的脂肪酶做為催化劑使用時存在操作穩(wěn)定性差、熱穩(wěn)定性差、容易受到有機(jī)溶劑影響而變性失活、難于分離回收再利用等缺點(diǎn)。這一缺點(diǎn)可以通過將酶固定于載體來克服，這樣不僅可以保留酶原有的活性及高度選擇性，而且還會提高酶處理效率、延長酶的使用壽命和降低處理成本，因此制備優(yōu)良的固定化酶載體是當(dāng)今社會的研究熱點(diǎn)。其中利用磁性載體固定脂肪酶的技術(shù)也較多，如在2011年8月第8期的高分子學(xué)報的文章《單分散磁性納米粒子固定化豬胰脂肪酶的研究》公開了一種固定化豬胰脂肪酶的方法，該方法是先用溶熱法制備了 Fe3O4磁性納米粒子，再用γ -氨基丙基三乙氧基硅烷對Fe3O4磁性納米粒子進(jìn)行表面改性，然后用戊二醛偶聯(lián)法制得了固定化豬胰脂肪酶。該方法使用單一的磁球作為載體，負(fù)載的酶量少；而使用戊二醛作為交聯(lián)劑，戊二醛的濃度要嚴(yán)格控制，濃度過大會使酶的構(gòu)象發(fā)生改變，從而導(dǎo)致酶變性失活。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明是要解決現(xiàn)有的利用磁性載體固定脂肪酶的方法的酶固定量低、容易導(dǎo)致酶變性的技術(shù)問題，而提供固定脂肪酶的磁性氧化石墨復(fù)合物載體的制備方法及其固定脂肪酶的方法。
[0004]本發(fā)明的固定脂肪酶的磁性氧化石墨復(fù)合物載體的制備方法按以下步驟進(jìn)行:
[0005]—、采用溶劑熱法制備Fe3O4納米粒子；
[0006]二、采用stober法在Fe3O4納米粒子外面包裹一層介孔娃，得到具有核殼結(jié)構(gòu)的磁性介孔硅，記為Fe304@MCM-41 ；
[0007]三、采用hummers法制備氧化石墨；
[0008]四、按Fe304@MCM_41的質(zhì)量與氧化石墨的質(zhì)量比為1: (100?150)的比例稱取步驟二制備的Fe304@MCM-41、量取步驟三制備的氧化石墨分散液，先把Fe304@MCM-41分散到無水乙醇中，再加入氧化石墨分散液，混合液攪拌I?2h，然后滴加3-氯丙基三乙氧基硅烷(CPS)，升溫至120?130°C，攪拌回流10?12h，最后用無水乙醇洗滌干凈，冷凍干燥，得到固定脂肪酶的磁性氧化石墨復(fù)合物載體，記為CPS/G0-Fe304@MCM-41。
[0009]利用上述的磁性氧化石墨復(fù)合物載體固定脂肪酶的方法，按以下步驟進(jìn)行:
[0010]—、稱取固定脂肪酶的磁性氧化石墨復(fù)合物載體CPS/G0-Fe304@MCM-41、pH為7.5的0.05M的磷酸鹽(PBS)緩沖液、脂肪酶，其中CPS/G0-Fe304@MCM-41的質(zhì)量與pH為7.5的0.05M的磷酸鹽(PBS)緩沖液的體積的比為Ig: (30?50)ml ；CPS/G0-Fe304iMCM-41與脂肪酶的質(zhì)量比為10:(0.36?I);
[0011]二、將pH為7.5的0.05M的磷酸鹽(PBS)緩沖液分成兩份，向一份中加入CPS/G0-Fe304@MCM-41，攪拌I?12h，得到載體溶液；向另一份中加入脂肪酶振蕩直至完全溶解，得到酶溶液；將酶溶液加入到載體溶液中，放在恒溫振蕩器中在25?50°C、150rpm的條件下恒溫振蕩2?12h，然后用磁分離進(jìn)行收集，將收集到的固相物用PBS緩沖液洗滌干凈，冷凍干燥，得到磁性氧化石墨復(fù)合物固定化脂肪酶。
[0012]本發(fā)明提供了一種操作簡便、環(huán)保具有工業(yè)化前景的固定脂肪酶的磁性氧化石墨復(fù)合物載體的制備方法及其固定脂肪酶的方法，磁性氧化石墨復(fù)合物載體以氧化石墨為“襯底”，通過共價結(jié)合的方式接枝磁性介孔硅，采用氯硅烷偶聯(lián)劑(3-氯丙基三乙氧基硅烷)共價固定在氧化石墨表面。脂肪酶可以通過共價結(jié)合的方式固定在載體上。
[0013]氧化石墨表面附有的大量羧基，通過共價結(jié)合的方式在表面接枝功能基團(tuán)氯硅烷，再將酶固定在磁性氧化石墨復(fù)合納米粒子表面，氧化石墨烯具有比表面積大、生物兼容性好以及良好的機(jī)械穩(wěn)定性的優(yōu)點(diǎn)，既能加載大量的酶，又能夠較好的保存酶原有的催化活性，提高重復(fù)使用性。
[0014]氯硅烷偶聯(lián)劑能夠有效減小空間阻礙，從而能夠使更多的酶與載體材料結(jié)合。氧化石墨作為“襯底”與磁性介孔硅結(jié)合提供了較大的比表面積，載體表面豐富的基團(tuán)能結(jié)合更多的硅烷偶聯(lián)劑，使硅烷偶聯(lián)劑的接枝率達(dá)到10%。相比于其他方式固定化酶，以共價鍵方式結(jié)合的酶更加牢固，不易從載體上脫落。氧化石墨優(yōu)良的機(jī)械穩(wěn)定性使得固定化酶的重復(fù)性增強(qiáng)了。
[0015]由于復(fù)合物有磁性，在外加磁場力的作用下，還能夠很方便地回收再利用。
[0016]通過紫外可見光譜分析換算得到固定化效率高達(dá)98 %。采用國標(biāo)滴定法檢測固定化酶活性。當(dāng)磁性氧化石墨復(fù)合物固定化脂肪酶濃度為3.6mg/mL，pH為7.5，溫度為40°C時，固定化相對酶活達(dá)到初始濃度的97%。在30°C儲存56天及循環(huán)使用10次后，固定化相對酶活分別達(dá)到初始濃度的85%，87%。CPS/G0-Fe304@MCM-41作為載體利于酶的回收，再利用，符合綠色化學(xué)的發(fā)展趨勢，具有良好的工業(yè)前景。
[0017]本發(fā)明的磁性氧化石墨復(fù)合物固定化脂肪酶可用于酶催化反應(yīng)中。
【附圖說明】
[0018]圖1試驗I制備的固定脂肪酶的磁性氧化石墨復(fù)合物載體的透射電鏡照片；
[0019]圖2試驗I制備的固定脂肪酶的磁性氧化石墨復(fù)合物載體的XPS譜圖；
[0020]圖3試驗I制備的固定脂肪酶的磁性氧化石墨復(fù)合物載體中Fe2p高分辨率掃描XPS譜圖；
[0021]圖4試驗I制備的固定脂肪酶的磁性氧化石墨復(fù)合物載體中氧化石墨(GO)的CIs高分辨率掃描XPS譜圖；
[0022]圖5試驗I制備的固定脂肪酶的磁性氧化石墨復(fù)合物載體紅外光譜圖；
[0023]圖6試驗I制備的固定脂肪酶的磁性氧化石墨復(fù)合物載體的熱重分析圖。
【具體實施方式】
[0024]【具體實施方式】一:本實施方式的固定脂肪酶的磁性氧化石墨復(fù)合物載體的制備方法按以下步驟進(jìn)行:
[0025]一、采用溶劑熱法制備Fe3O4納米粒子；
[0026]二、采用stober法在Fe3O4納米粒子外面包裹一層介孔娃，得到具有核殼結(jié)構(gòu)的磁性介孔硅，記為Fe304@MCM-41 ；
[0027]三、采用hummers法制備氧化石墨；
[0028]四、按Fe304@MCM_41的質(zhì)量與氧化石墨的質(zhì)量比為1: (100?150)的比例稱取步驟二制備的Fe304@MCM-41、量取步驟三制備的氧化石墨分散液，先把Fe304@MCM-41分散到無水乙醇中，再加入氧化石墨分散液，混合液攪拌I?2h，然后滴加3-氯丙基三乙氧基硅烷(CPS)，升溫至120?130°C，攪拌回流10?12h，最后用無水乙醇洗滌干凈，冷凍干燥，得到固定脂肪酶的磁性氧化石墨復(fù)合物載體，記為CPS/G0-Fe304@MCM-41。
[0029]【具體實施方式】二:本實施方式與【具體實施方式】一不同的是=Fe3O4納米粒子的制備方法如下:按六水合三氯化鐵(FeCl3.6H20)與硝酸鈉的質(zhì)量比為1: (2?3)將六水合三氯化鐵與硝酸鈉溶解在乙二醇中，然后轉(zhuǎn)移到反應(yīng)釜中，升溫至190?200°C并保持19?20h，然后降至常溫，將得到的沉淀物分別用無水乙醇和丙酮洗滌干凈，最后用磁鐵收集，將收集的黑色產(chǎn)物在50?60°C條件下真空干燥，得到Fe3O4納米粒子；其它與【具體實施方式】一相同。
[0030]【具體實施方式】三:本實施