似的趨勢(shì)，但是相關(guān)性弱于(附圖1)。
[0021] 實(shí)施例3:調(diào)控靶基因活性分析 (一）實(shí)驗(yàn)方法 應(yīng)用引物組合應(yīng)用引物組合SEQ :N0. 17和SEQ :N0. 18、SEQ :N0. 19和SEQ :N0. 20以及SEQ :N0. 21和SEQ :N0. 22,分別擴(kuò)增~(SEQ :N0. 9)、~（SEQ :N0. 1) 和(^MffS^SEQiNO. 23)的全長(zhǎng)序列。擴(kuò)增時(shí)選用FastStart High Fidelity PCR system (Roche)，PCR體系為Buffer (with Mgcl2)2 ML，dNTP (2.5 剛）1.6 ML，上下游引物（10 剛）各2虬，。0嫩0.5虬，酶0.5虬，水11.4虬。？0?程序?yàn)?5。02111111 ;95。03〇8， 55-72°C 30s，72°C 30 s-3 min，35個(gè)循環(huán)；72°C 6 min，16°C hold。PCR產(chǎn)物分別經(jīng)過(guò)限制 性內(nèi)切酶組合Not I和Spe I、Sal I和Apa I、Not I和Spe I的消化后，搭載到pGreenll 0029 62-SK表達(dá)載體上，重組成表達(dá)載體仏和仏將最終 確認(rèn)正確構(gòu)建的表達(dá)載體電轉(zhuǎn)化入GV3101: :pSoup農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，挑選3個(gè)陽(yáng)性克 隆，用25%滅菌甘油保存，放于-80°C。
[0022] 將存放于_80°C的甘油菌劃線接種于含25 iig/ml慶大霉素、5 iig/ml四環(huán)素和 50 y g/ml卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)48h，刮取少量菌落涂布到新的相同LB固 體培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)12h。刮取生長(zhǎng)良好的菌落，用滲透液（10 mM MES，10 mM MgCl2，150 mM乙酰丁香酮，pH 5. 6)懸浮，將其0D6。。調(diào)整為0. 75左右。
[0023] 利用雙熒光素酶系統(tǒng)，分析不同轉(zhuǎn)錄因子與菊花花青苷合成基因啟動(dòng)子 間是否存在調(diào)控效應(yīng)。將含有不同重組表達(dá)載體的農(nóng)桿菌按照兩種方案進(jìn)行組合處理， _將含有pGreenll 0029 62-SK、仏或仏#/萬(wàn)6-SK的農(nóng)桿菌菌株分別 與含有況的農(nóng)桿菌菌株按照10:1比例混合；@將含有仏MZ份-SK或仏MZ似-SK 的農(nóng)桿菌菌株分別與含有或pGreenll 0029 62-SK的農(nóng)桿菌菌株按照1:1比例 混合，再按照10:1比例與含有況的農(nóng)桿菌菌株混合。農(nóng)桿菌菌株混合后，分別注 射到本氏煙草葉片中，每株煙草注射3片葉片。每個(gè)基因的3個(gè)陽(yáng)性克隆各重復(fù)一次上述 操作，構(gòu)成3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。
[0024] 注射后的煙草于16h :8h光暗周期、25°C、75%空氣濕度的條件下培養(yǎng)3天，應(yīng) 用 Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega， USA)和 Modulus Luminometer (Promega，USA)檢測(cè)葉片中兩種熒光素酶（LUC和REN)的比值，據(jù)此分析轉(zhuǎn)錄因子與目標(biāo)基 因啟動(dòng)子之間的調(diào)控效應(yīng)。
[0025] (二）實(shí)驗(yàn)結(jié)果 雙熒光素酶瞬時(shí)表達(dá)分析結(jié)果顯示，與pGreenll 0029 62-SK表達(dá)載體相似， (SEQ :N0. 9)和仏（SEQ :N0. 1)均無(wú)法調(diào)控菊花花青苷合成基因啟動(dòng)子活性 (附圖2)。仏#/及？（SEQ :N0. 23)可激活啟動(dòng)子的效應(yīng)，當(dāng)其與仏MM2協(xié)同表達(dá) 時(shí)，該激活效應(yīng)得到極顯著增強(qiáng)，可強(qiáng)烈增強(qiáng)啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性至40多倍（附圖2)， 而仏并無(wú)此功效。這一結(jié)果說(shuō)明，仏MM2可與仏#/及徹、同作用，參與菊花花青苷 的生物合成調(diào)控。
[0026] 實(shí)施例4:蛋白質(zhì)相互作用分析 (一）實(shí)驗(yàn)方法 首先構(gòu)建應(yīng)用于酵母雙雜交（Y2H)系統(tǒng)的重組表達(dá)載體仏 仏MM2HVD、仏仏#/萬(wàn)f AD和仏#/萬(wàn)f BD，所用引物組合分別為SEQ :N0. 24和 SEQ:N0. 25、SEQ:N0. 26 和 SEQ:N0. 27、SEQ:N0. 28 和 SEQ:N0. 29、SEQ:N0. 30 和 SEQ: NO. 31、SEQ:N0. 32 和 SEQ:N0. 33 以及 SEQ:N0. 34 和 SEQ:N0. 35。擴(kuò)增基因全長(zhǎng)時(shí)選 用 FastStart High Fidelity PCR system (Roche)，PCR 體系為 Buffer (with Mgcl2) 2 ML，dNTP (2.5 剛）1.6 ML，上下游引物（10 剛）各 2 ML，cDNA 0.5 ML，酶 0.5 ML，水 11. 4 ML。PCR 程序?yàn)?95°C 2 min;95°C 30 s，55-72°C 30s，72°C 30 s-3 min，35 個(gè)循環(huán)；72°C 6 min，16°C hold。PCR產(chǎn)物分別經(jīng)過(guò)限制性內(nèi)切酶組合Sac I和Xho I、EcoR I和BamH I、 EcoR I和BamH I的消化后，搭載到酵母雙雜交（Y2H)表達(dá)載體上，構(gòu)建重組表達(dá)載體。
[0027] 然后參照Y2H系統(tǒng)（Matchmaker? Gold Yeast Two-Hybrid System，Clontech，US) 說(shuō)明書，將仏和仏#/萬(wàn)f BD分別轉(zhuǎn)化入Y2HGo 1 d感受態(tài)內(nèi)，檢測(cè)其自 我激活特性。分析顯示，三個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的自我激活特性不同。仏和仏MM2的自我 激活特性較弱，AbA?和AbA 4°°即可分別抑制其自我激活。碰]自我激活特性則較強(qiáng)， AbA1M°亦不可抑制。因此，本發(fā)明以和為bait，分析兩種轉(zhuǎn)錄蛋白的相互 作用機(jī)理。
[0028] (二）實(shí)驗(yàn)結(jié)果 酵母雙雜交系統(tǒng)分析結(jié)果顯示，CmbHLH2(SEQ:N0. 1)可與CmMYB6(SEQ:N0. 23)相 互作用，形成轉(zhuǎn)錄蛋白復(fù)合體（附圖3)，而CmbHLHl (SEQ:N0. 9)無(wú)法與CmMYB6相互作用 (附圖3)。這一結(jié)果說(shuō)明，CmbHLH2可與CmMYB6協(xié)同互作形成轉(zhuǎn)錄蛋白復(fù)合體，以此增強(qiáng)各 自的功效，共同參與啟動(dòng)子活性的調(diào)控，進(jìn)而參與菊花花青苷生物合成的調(diào)控。
[0029] 實(shí)施例5:誘導(dǎo)花青苷積累分析 (一）實(shí)驗(yàn)方法 將分別含pGreenll 0029 62-SK、~M￡"7-SK、~或~#/萬(wàn)6-SK的GV3101: : pSoup農(nóng)桿菌菌株按照1:1比例組合成農(nóng)桿菌混合液，包括：<3〃M￡/Z/-SK+ pGreenll 0029 62-SK，心MM^-SK+ pGreenll 0029 62-SK、心SK 和 仏MM^-SK+仏SK。選取長(zhǎng)勢(shì)優(yōu)良普通煙草植株的3片嫩葉，以每片葉片中心葉 脈為分界線，用無(wú)針頭注射器在葉片左側(cè)注射仏M^W-SK+pGreenll 0029 62-SK或 仏MM2，-SK+ pGreenll 0029 62-SK混合液，右側(cè)注射相應(yīng)的仏仏ifiSfSK或 仏MZ似-SK+仏#/及混合液。注射部位為遠(yuǎn)離葉片中心葉脈的表皮細(xì)胞內(nèi)，每種農(nóng)桿菌 組合注射3株不同的普通煙草植株。煙草于16h :8h光暗周期、25°C、75%空氣濕度的條件下 培養(yǎng)8天，觀察葉片的注射部位有無(wú)花青苷的積累。每個(gè)基因的3個(gè)陽(yáng)性克隆各重復(fù)一次 上述操作，構(gòu)成3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。
[0030] (二）實(shí)驗(yàn)結(jié)果 分析結(jié)果顯示，注射仏MM2，-SK+仏ifiSfSK (SEQ:N0. 1 + SEQ:N0. 23)混合農(nóng)桿菌 的煙草葉片表皮細(xì)胞內(nèi)可顯著積累花青苷，使得葉片注射部位呈現(xiàn)明顯的紅色（附圖4)。而 注射仏M￡^-SK+仏#/萬(wàn)fSK(SEQ:N0. 9 + SEQ:N0. 23)混合農(nóng)桿菌的煙草葉片表皮細(xì)胞 內(nèi)無(wú)花青苷的積累（附圖4)。
[0031] 本發(fā)明利用RACE、實(shí)時(shí)定量PCR、雙熒光素酶系統(tǒng)技術(shù)、酵母雙雜交系統(tǒng)技術(shù)和煙 草瞬時(shí)表達(dá)技術(shù)，分離并鑒定出菊花仏似（SEQ :N0. 1)對(duì)花青苷生物合成具有轉(zhuǎn)錄調(diào) 控效應(yīng)，可應(yīng)用到植物顏色修飾的基因工程中。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一個(gè)參與花青苷生物合成調(diào)控的菊花祕(mì)^^轉(zhuǎn)錄因子，具有SEQ :N0. 1所示的核苷 酸序列。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一個(gè)參與花青苷生物合成調(diào)控的菊花錄因子在改變 植物色澤中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明提供一個(gè)參與花青苷生物合成調(diào)控的菊花<i>bHLH</i>轉(zhuǎn)錄因子（<i>CmbHLH2</i>），具有SEQ：NO.1所示的核苷酸序列。<i>CmbHLH2</i>與<i>CmMYB6</i>協(xié)同在煙草葉片中瞬時(shí)過(guò)量表達(dá)時(shí)，可強(qiáng)烈誘導(dǎo)花青苷的積累，使得原本綠色的葉片變成紅色。因此，通過(guò)轉(zhuǎn)基因的手段，使得<i>CmbHLH2</i>在植物中過(guò)量表達(dá)，或者抑制菊花植株中<i>CmbHLH2</i>的表達(dá)，即可分別獲得花青苷合成受到增強(qiáng)或者抑制的轉(zhuǎn)基因植株，其色澤會(huì)因花青苷合成的變化而變化。
【IPC分類】A01H5/00, C12N15/29, C07K14/415
【公開(kāi)號(hào)】CN105153288
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510606298
【發(fā)明人】殷學(xué)仁, 李方, 向理理, 劉曉芬, 陳昆松
【申請(qǐng)人】浙江大學(xué)
【公開(kāi)日】2015年12月16日
【申請(qǐng)日】2015年9月22日