基地，真空冷凍干燥后發(fā)粉碎得煙葉粉末干品〇. 8kg，乙醇 (10LX3)回流提取3次，每次2h，減壓回收溶劑得浸膏19g，浸膏浮于水中，依次用石油醚、 二氯甲烷萃取，得到煙葉石油醚萃取部位（4. 2g)、二氯甲烷萃取部位（3. 2g)。取二氯甲烷 萃取部位（3. 2g)用100-200目硅膠拌樣，采用硅膠柱色譜，石油醚-丙酮混合溶劑(體積比 為10:0-0:10)梯度洗脫，得到8個(gè)洗脫流份（Fr.A-H)。取Fr.C(石油醚-丙酮8:1)洗脫 流份，濃縮后用300-400目硅膠拌樣，采用硅膠柱色譜，二氯甲烷-甲醇混合溶劑(體積比為 100:1，80:1，60:1，40:1)梯度洗脫，得到4個(gè)洗脫流份（Fr.C1-C4)，取Fr.C3 (二氯甲烷：甲 醇60:1)洗脫流份，經(jīng)高效液相制備色譜分離，得到化合物NicotiaditerpeneA。
[0018] 本發(fā)明對(duì)NicotiaditerpeneA應(yīng)用胃癌細(xì)胞株（AGS)、人肝癌細(xì)胞株（HepG2)、人 乳腺癌細(xì)胞株（MCF-7)、人口腔表皮樣癌細(xì)胞株（KB)和人肺腺癌細(xì)胞株(A549)，表明其均 具有一定的抗腫瘤活性。
[0019] 取對(duì)數(shù)期的腫瘤細(xì)胞，加入適量胰酶消化液配成單細(xì)胞懸液，接種于96孔板，培 養(yǎng)箱培養(yǎng)直細(xì)胞單層鋪滿孔底，以二甲基亞砜稀釋化合物至不同濃度，每孔加入5y1，化合 物濃度分別為〇. 6,1. 2, 2. 5, 5. 0,10. 0, 20. 0,40. 0,80. 0yg/ml。并設(shè)空白對(duì)照組，每濃度 設(shè)3個(gè)復(fù)孔。腫瘤細(xì)胞在37°C，5%C02條件下培養(yǎng)48h，棄去含藥培養(yǎng)基，用PBS清洗3遍， 每孔加入50y1XTT溶液，將96孔板置于37°C，5%C02條件下培養(yǎng)4h后，酶標(biāo)儀490m波長 下測(cè)定吸光度值A(chǔ)。根據(jù)以下公式計(jì)算藥物的IC5。。
[0020]lgIC50=Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4)，其中Xm:lg(最大劑量）；I:lg(最大劑量 / 相鄰 劑量）；p:陽性反應(yīng)之和；pm :最大陽性反應(yīng)率；pn最小陽性反應(yīng)率。試驗(yàn)結(jié)果見表2。
[0021] 表2NicotiaditerpeneA對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用（單位yg/ml)
上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，NicotiaditerpeneA對(duì)各腫瘤細(xì)胞株均有一定的抑制作用，提示NicotiaditerpeneA可以作為抗腫瘤藥物進(jìn)行深入研究。
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【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種開環(huán)西松烷二萜類化合物，其特征在于：是由煙草中分離純化而得到，具有如 下結(jié)構(gòu)：2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的開環(huán)西松烷二萜類化合物，其特征在于：該化合物命名為 NicotiaditerpeneA，為白色針狀結(jié)晶。3. -種如權(quán)利要求1所述的開環(huán)西松烷二萜類化合物的分離制備方法，其特征在于： 該方法包括如下步驟： 新鮮煙葉樣品真空冷凍干燥，粉碎； 乙醇回流提取粉碎后的煙葉樣品，濃縮提取液，得到浸膏； 將步驟（2)中所得浸膏浮于水中，依次用石油醚、二氯甲烷萃?。? 將步驟（3)中所得的二氯甲烷萃取物濃縮并上樣至硅膠柱色譜，以石油醚：丙酮的體 積比為10 :0-0:10的混合溶劑進(jìn)行梯度洗脫，按照所使用的不同梯度的洗脫液收集流份； 將步驟（4)中由石油醚：丙酮體積比為8:1的混合溶劑洗脫下來的流份上樣硅膠柱色 譜，用二氯甲烷：甲醇為100:1-40:1的混合溶劑梯度洗脫； 將步驟（5)中由二氯甲烷：甲醇體積比為60:1的混合溶劑洗脫下來的流份應(yīng)用制備型 高效液相色譜儀，以甲醇：水為89:11的流動(dòng)相洗脫，得到目標(biāo)化合物即開環(huán)西松烷二萜類 化合物。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的分離制備方法，其特征在于：步驟（4)中所使用的混合溶劑中 石油醚：丙酮的體積比例依次為10:0，10:1，8:1，6:1，5:1，3:1，2:1和0:10。5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的分離制備方法，其特征在于：步驟（5)中所使用的混合溶劑中 二氯甲烷：甲醇的體積比例依次為：1〇〇:1，80:1，60:1和40:1。6. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的分離制備方法，其特征在于：步驟（6)中所使用的制備型高效 液相流動(dòng)相流速為2mL/min，檢測(cè)波長為210nm。7. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的分離制備方法，其特征在于：步驟（4)中所述的硅膠柱色譜為 粒徑100-200目的硅膠色譜柱。8. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的分離制備方法，其特征在于：步驟（5)中所述的硅膠柱色譜為 粒徑300-400目的硅膠色譜柱。9. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的分離制備方法，其特征在于：步驟（6)中與制備型高效液相色 譜儀配套使用的色譜柱為C18高效液相半制備色譜柱，規(guī)格為250X10_，粒徑為5ym。10. -種如權(quán)利要求1中所述的開環(huán)西松烷二萜類化合物在抗腫瘤方面的應(yīng)用，其特 征在于：所述開環(huán)西松烷二萜類化合物對(duì)對(duì)胃癌細(xì)胞株（AGS)、人肝癌細(xì)胞株（HepG2)、人 乳腺癌細(xì)胞株(MCF-7 )、人口腔表皮樣癌細(xì)胞株（KB)和人肺腺癌細(xì)胞株（A549 )均具有一定 的抑制作用。
【專利摘要】一種開環(huán)西松烷二萜類化合物及其分離制備方法和應(yīng)用，特征是：該化合物是由煙草中分離純化而得到，具有如下結(jié)構(gòu)：？命名為Nicotiaditerpene？A，是從煙葉中分離的開環(huán)西松烷二萜類化合物，經(jīng)多種現(xiàn)代色譜光譜分析，特別是應(yīng)用二維核磁共振譜對(duì)化合物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行綜合解析，確定了該化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)及立體構(gòu)型。經(jīng)文獻(xiàn)檢索，該化合物為一新化合物。本發(fā)明還發(fā)現(xiàn)該化合物對(duì)多種腫瘤細(xì)胞均有抑制作用。本發(fā)明充分利用煙草資源優(yōu)勢(shì)，深入研究開發(fā)，分離出具有獨(dú)特化學(xué)結(jié)構(gòu)的西松烷二萜類化合物，為開展西松烷二萜類成分相關(guān)研究及應(yīng)用奠定堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)，并為研制新的抗腫瘤藥物提供新的思路。
【IPC分類】A61P35/00, C07C45/78, C07C49/24
【公開號(hào)】CN105130775
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510401248
【發(fā)明人】鄭慶霞, 翟妞, 周會(huì)娜, 魏攀, 王燃, 劉萍萍, 金立鋒, 孟慶華, 陳霞, 陳千思, 楊軍, 林福呈
【申請(qǐng)人】中國煙草總公司鄭州煙草研究院
【公開日】2015年12月9日
【申請(qǐng)日】2015年7月10日