具有肥胖癥的預(yù)防和治療作用的化合物的篩選方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及篩選具有肥胖癥的預(yù)防和治療作用的化合物的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 肥胖引起脂肪組織的過量蓄積，提高糖尿病、循環(huán)器官系疾病、抑郁癥等各種健康 上的風(fēng)險（參照非專利文獻1)。該問題在現(xiàn)代社會中產(chǎn)生非常大的經(jīng)濟和社會損失。對脂 肪細胞代謝的分子機制進行了廣泛研究（參照非專利文獻2和3)。
[0003] 滑膜蛋白是作為由來自于風(fēng)濕病患者的滑膜細胞過表達的膜蛋白而發(fā)現(xiàn)的蛋白 (參照專利文獻1)。而且，通過使用了轉(zhuǎn)基因動物的研究，表明了滑膜蛋白是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié) 炎的發(fā)作所必須的分子。
[0004] 通過蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測系統(tǒng)，暗不出滑13旲蛋白具有環(huán)指（RINGfinger)基序。該基序 在對蛋白的泛素化發(fā)揮重要作用的E3泛素連接酶這樣的酶中被大量發(fā)現(xiàn)。而且證明了，滑 膜蛋白具有作為E3泛素連接酶的特征之一的自泛素化活性（參照專利文獻1)。
[0005] 現(xiàn)有技術(shù)文獻
[0006] 專利文獻
[0007] 專利文獻1 :國際公開第02/052007號發(fā)明
[0008] 非專利文獻
[0009] 非專利文獻I:Wickelgren,I. (1998) ? Obesity:how big aproblem? Science280, 1364-1367.
[0010]非專利文獻2:Lefterova, M. I. , and Lazar, M. A. (2009) ? New developments in adipogenesis. Trends Endocrinol Metab 20, 107-114.
[0011]非專利文獻3:Rosen, E. D. , and MacDougald, 0? A. (2006) ? Adipocyte differentiation from the inside out. Nat Rev Mol Cell Biol 7,885-896.

【發(fā)明內(nèi)容】

[0012] 發(fā)明所要解決的問題
[0013] 人們期望開發(fā)出篩選具有肥胖癥的預(yù)防和治療作用的物質(zhì)或候選化合物的方法。
[0014] 用于解決問題的方法
[0015] 本發(fā)明人獲得了如果使用滑膜蛋白基因的條件性基因剔除小鼠或稱敲除小鼠，破 壞滑膜蛋白基因，則引起對象的體重減少和脂肪細胞的分化誘導(dǎo)抑制這樣的基于實施例的 見解。因此，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，通過篩選抑制滑膜蛋白的表達、或抑制滑膜蛋白的活性的化合 物，能夠篩選具有脂肪細胞分化誘導(dǎo)調(diào)節(jié)作用、脂肪組織量調(diào)節(jié)作用和體重調(diào)節(jié)作用的化 合物，從而完成了本發(fā)明。
[0016] 本發(fā)明的第1方面涉及具有抗肥胖作用的物質(zhì)的篩選方法。該方法包括下述工 序：使被驗物質(zhì)與滑膜蛋白基因表達細胞接觸的工序，以及確認由被驗物質(zhì)產(chǎn)生的對滑膜 蛋白基因表達的影響或?qū)さ鞍椎牡鞍谆钚缘挠绊懙墓ば?。對滑膜蛋白基因表達的影響 的例子是對滑膜蛋白mRNA量的影響、對滑膜蛋白的蛋白的自泛素化的影響。所謂具有抗肥 胖作用的物質(zhì)的篩選方法，為尋找具有抗肥胖作用的物質(zhì)的候選方法。
[0017] 第1方面的優(yōu)選形態(tài)是，抗肥胖作用為脂肪組織量減少作用或脂肪細胞分化誘導(dǎo) 抑制作用。即，該形態(tài)中，可以篩選具有脂肪組織量減少作用或脂肪細胞分化誘導(dǎo)抑制作用 的化合物。
[0018] 本發(fā)明的第2方面涉及抗肥胖藥。該抗肥胖藥包含滑膜蛋白的SiRNA、滑膜蛋白的 誘捕核酸或滑膜蛋白的反義核酸作為有效成分。該抗肥胖藥具有例如脂肪組織量減少作用 或脂肪細胞分化誘導(dǎo)抑制作用。
[0019] 本發(fā)明的第2方面所具有的形態(tài)是，有效成分為滑膜蛋白的SiRNA的形態(tài)?；?膜蛋白的siRNA的例子為具有選自序列號2~6中的一堿基序列、與這些堿基序列互補 的堿基序列、或從任一這些堿基序列取代、插入、缺失或附加了 1個或2個堿基的堿基 序列的RNA。具有序列號2~4所不的喊基序列的RNA為滑I旲蛋白的siRNA，如Izumi T,etal. ,ArthritisRheum. 2009 ；60 (I) : 63-72. ,YamasakiS,etal. ,EMBOJ. 2007 ； 26(1):113-22.中使用實驗而公開地那樣是公知的。具有序列號5和6所示的堿基序列的 RNA為滑膜蛋白的siRNA，如W02005/074988號發(fā)明中使用實驗而公開地那樣是公知的。
[0020] 序列號 2 :5 ' -GCUGUGACAGAUGCCAUCA-3 '
[0021]序列號3 :5' -GGUGUUCUUUGGGCAACUG-3'
[0022]序列號4 :5' -GGUUCUGCUGUACAUGGCC-3'
[0023]序列號5 :5' -CGUUCCUGGUACGCCGUCA-3'
[0024]序列號 6 :5 ' -GUUUTGGUGACUGGUGCUA-3'
[0025] "具有從任一這些堿基序列取代、插入、缺失或附加了 1個或2個堿基的堿基序列 的RNA"，為具有從選自序列號2~6中的一堿基序列和與這些堿基序列互補的堿基序列任 一堿基序列，取代、插入、缺失或附加了 1個或2個堿基的堿基序列的RNA。取代、插入、缺失 或附加可以發(fā)生任1種，也可以發(fā)生2種以上。
[0026] 本發(fā)明的第2方面所具有的形態(tài)是，有效成分為具有序列號7所示的堿基序列或 從序列號7所示的堿基序列取代、插入、缺失或附加了 1個或2個堿基的堿基序列的滑膜 蛋白的誘捕核酸。具有序列號7所示的堿基序列的核酸為滑膜蛋白的誘捕核酸，例如，如 TsuchimochiK，etal.，MolCellBiol. 2005 ;25 (16) :7344-56?中使用實施例而顯示地那 樣是公知的。
[0027]序列號 7:5 ' -AUGGUGACUGGUGCUAAGA-3 '
[0028] 本發(fā)明的第2方面所具有的形態(tài)是，有效成分為滑膜蛋白的反義核酸。
[0029] 發(fā)明的效果
[0030] 通過本發(fā)明，可以提供具有肥胖癥的預(yù)防和治療作用的化合物的篩選方法。
【附圖說明】
[0031] 圖IA是滑膜蛋白條件性基因剔除小鼠（syvnlcKO)的制作所使用的基因標(biāo)靶載 體的設(shè)計圖。外顯子表示黑色的箱，黑色箭頭表示新霉素（Neo)，白底箭頭表示白喉毒素基 因亞基A。白底三角形表示IoxP部位，黑圓點表示FRT部位。通過在內(nèi)源性滑膜蛋白基因 座與標(biāo)靶載體之間進行同源基因重組，可獲得與外顯子2~12的上游和下游相鄰地導(dǎo)入了 loxP，進一步與新霉素盒的上游和下游相鄰地導(dǎo)入了FRT的染色體。"FloxAllele"中，顯 示除去新霉素后的、導(dǎo)入了IoxP的等位基因。缺損等位基因表示通過他莫昔芬（Tam)被誘 導(dǎo)的、經(jīng)由Cre重組酶而被除去的物質(zhì)。
[0032] 圖IB是將他莫昔芬處理后的來自于（CAG)-Cre-ER;syvnr/+小鼠、（CAG)-Cre-ER; SyvnlfW+小鼠和（CAG)-Cre-ER;syvnlfWfl°x小鼠的基因組DNA進行了PCR解析而得的照 片。野生型等位基因作為70bp的片段（下側(cè)的譜帶）被檢測到，目的等位基因作為IOObp 的片段（上側(cè)的譜帶）被檢測到。
[0033] 圖IC是將他莫昔芬處理后的來自于syvnlfWfl°x小鼠（syvnlWT)和 (CAG)-Cre-ER;syvnlfWfl°x小鼠（syvnlcKO)的脂肪細胞進行了實時PCR解析而得的圖。
[0034] 圖ID是來自于syvnlWTmice和syvnlcKOmice的尾部蛋白的、使用了抗滑膜 蛋白抗體的蛋白印跡。
[0035] 圖IE是表示新生后的滑膜蛋白條件性基因剔除小鼠的生存比例的圖。
[0036] 圖2A是表示新生后的滑膜蛋白條件性基因剔除小鼠的體重變化的圖。
[0037] 圖2B是表示滑膜蛋白基因剔除小鼠（雄和雌）的食物攝取量的圖。
[0038] 圖2C是表示新生后的滑膜蛋白條件性基因剔除小鼠的皮下脂肪的狀態(tài)的照片。 白色箭頭表示皮下脂肪。
[0039] 圖2D是表示syvnlWT(左側(cè)）和syvnlcKO(右側(cè)）的附睪脂肪組織的照片。
[0040] 圖2E是表示新生后的滑膜蛋白條件性基因剔除小鼠的內(nèi)臟脂肪的脂肪滴的狀態(tài) 的顯微鏡照片。黑色箭頭表示脂肪滴。倍率是400倍。
[0041] 圖2F是表示新生后的滑膜蛋白條件性基因剔除小鼠的附睪（上圖）和皮下脂肪 (下圖）的脂肪滴的狀態(tài)的顯微鏡照片。黑色箭頭表示脂肪滴。倍率為400倍。
[0042] 圖3A是表不syvnlcKO:ob/ob小鼠中的由新生后的滑H旲蛋白基因剔除引起的體 重變化的圖。
[0043] 圖3B是表不syvnlcKO:ob/ob小鼠中的由新生后的滑H旲蛋白基因剔除引起的皮 下脂肪的狀態(tài)的照片。黑箭頭表示皮下脂肪。
[0044] 圖3C是表不syvnlcKO:db/db小鼠中的由新生后的滑I旲蛋白基因剔除引起的體 重變化的圖。
[0045] 圖3D是表不syvnlcKO:db/db小鼠中的由新生后的滑I旲蛋白基因剔除引起的皮 下脂肪的狀態(tài)的照片。黑箭頭表示皮下脂肪。
[0046] 圖4是表示滑膜蛋白基因抑制對3T3-L1細胞株的脂肪細胞分化誘導(dǎo)的影響的照 片。〇：分化了的脂肪細胞，□:非正常脂肪細胞的脂肪滴。
[0047] 圖5A是表示可以制作脂肪特異性滑膜蛋白基因剔除小鼠的PCR的結(jié)果。通過 以常規(guī)方法的凝膠電泳分離出從aP2_Cre;Syvnlfl°x/fl°x (脂肪特異性基因剔除）小鼠和 SyvnlfWfl°x小鼠（對照）的WAT和BAT所離析出的基因組DNA進行了擴增的PCR產(chǎn)物。
[0048] 圖5B是表示脂肪特異性滑膜蛋白基因剔除小鼠的生存率的圖。是進行了 aP2-Cre;SyvnlfWfl°M、鼠和對照小鼠（SyvnlfWfl°x和SyvnlfW+小鼠）生存分析而得的 圖，Kaplan-Meier曲線表示相對于日齡的生存率。
[0049] 圖5C是表示脂肪特異性滑膜蛋白基因剔除小鼠的體重變化的圖。從出生后第3天 開始測定體重。AdiposeKO:aP2-Cre;Syvnlfl°x/fl°x(脂肪特異性基因剔除）小鼠。Contorol: Syvnlfl〇x/fl〇x和Syvnlfl〇x/+小鼠。Adiposeheterozygous:aP2-Cre;SyvnlfW+小鼠。結(jié)果 以平均土SD表示。*P〈0. 01 :aP2-Cre;SyvnlfWfl°x小鼠與其它小鼠的比較通過ANOVA的 posthoc檢驗（Tukey-Kramer法）來進行。
[0050] 圖是出生后第19天的對照小鼠與aP2-Cre;SyVnlfWfl°x(脂肪特異性基因剔 除）小鼠的照片。
[0051] 圖5E是圖f5D的小鼠的腹部的皮下脂肪照片。白色箭頭表示皮下脂肪。
[0052] 圖5F是圖的小鼠的附睪照片。
[0053] 圖5G是圖的小鼠的背部的皮下脂肪照片。aP2_Cre;Syvnlfl°x/fl°x小鼠的WAT 的減少（BAT不減少）