一種鑒別結縷草品種的引物及結縷草品種的鑒別方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物鑒定領域，具體涉及一種鑒別結縷草品種的引物及結縷草品種的 鑒別方法。
【背景技術】
[0002] 中國是世界上結縷草資源最為豐富的國家，同時，結縷草也是我國唯一一個出口 種子的草坪草種。農業(yè)行業(yè)標準《草品種審定技術規(guī)程》指出，育成品種應同時具備特異性 (distinctness)、一致性（uniformity)和穩(wěn)定性（stability)(簡稱三性或"DUS")。因此， 草品種審定前，除了需要完成統(tǒng)一安排的區(qū)域試驗外，新草品種還應通過"三性"測試。目 前，對新草品種的"三性"測試和鑒定的方法通常采用外觀形態(tài)特征描述法。測試結果容易 受環(huán)境因素的影響，且周期較長。且隨著育種材料遺傳基礎的日益狹窄及選育品種數(shù)目的 日益增多，品種間的差異越來越小，單純依靠傳統(tǒng)的植物學性狀已經難以將它們準確鑒別。
[0003] SSR即簡單序列重復，亦稱微衛(wèi)星，是近年來發(fā)展起來建立在PCR基礎上的第二代 分析標記。微衛(wèi)星在原核生物和真核生物基因組中隨機分布，而且該標記呈共顯性，符合孟 德爾遺傳模式。SSR標記自開發(fā)以來，已在多種植物的遺傳多樣性、指紋圖譜、純度鑒定、資 源親緣關系分析、連鎖圖譜構建、基因定位等研究領域得到廣泛應用。相比于AFLP、RAH)等 分子標記技術，SSR具有易于操作，高度重復性和可靠性，顯示出較強的多態(tài)性等優(yōu)點。
[0004] 因此有必要通過SSR分子標記手段，構建結縷草現(xiàn)有品種的DNA標準指紋圖譜，為 結縷草新品種的鑒定提供一種可靠、快捷的分子遺傳學手段。

【發(fā)明內容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于克服傳統(tǒng)鑒別技術中存在的上述缺陷，提供一種可靠、快捷的 結縷草品種鑒定方法。
[0006] 為了達到以上目的，本發(fā)明提供了一種鑒別結縷草品種的引物，其特征在于，包括 正向引物：5 ' -ITGAITCAGITGGTGAAACA-3 ' ；和反向引物：5 ' -GACTTAITITCGACGAACTACC-3 '。
[0007] 其中，所述結縷草品種包括膠東青結縷草、蘭引III號、青島結縷草、華南結縷草、蘇 植1號和上海結縷草中的至少一種。
[0008] 在本發(fā)明中，所述結縷草品種還可以包括本領域已知和未知的其它結縷草品種。
[0009] 本發(fā)明還提供了一種結縷草品種的鑒別方法，包括以待測樣品基因組DNA為模板 DNA，利用本發(fā)明所提供的引物進行PCR擴增。
[0010] 本發(fā)明所提供的鑒別方法包括，首先利用所述引物對已知品種的結縷草標準品的 基因組DNA進行PCR擴增，獲得PCR產物，根據(jù)所述PCR產物建立不同品種的結縷草標準品 的SSR標準指紋圖譜。
[0011] 當進行結縷草品種鑒別時，利用所述引物對待鑒別的結縷草基因組DNA進行PCR 擴增，獲得擴增結果，將所述擴增結果與各結縷草標準品的SSR標準指紋圖譜進行比對，從 而進行品種鑒別。
[0012] 在本發(fā)明的一種實施方式中給出了膠東青結縷草、蘭引III號、青島結縷草、華南結 縷草、蘇植1號和上海結縷草的SSR標準指紋圖譜（如圖2所示）。
[0013] 在本發(fā)明所提供的鑒別方法中，所述PCR擴增體系為：43. 0 y 1 PCR Supermix(Invitrogen)，1 y 1上游引物，1 y 1下游引物以及1. 0 y 1的模板DNA，共46 y 1體 系。
[0014] 其中，PCR擴增程序為：95°C預變性5min ;94°C變性20s，58°C退火lmin，72°C延伸 30s，共 14 個循環(huán)；94°C變性 20s，55°C退火 lmin，72°C延伸 30s，共 28 個循環(huán)；72°C lOmin 后獲得PCR產物。
[0015] 其中，所述結縷草基因組DNA優(yōu)選為提取自結縷草葉片。
[0016] 在本發(fā)明的一種優(yōu)選的實施方式中，發(fā)明人對提取基因組DNA的CTAB法進行了改 進，獲得了一種適合于結縷草的基因組DNA提取方法，具體的，可以包括以下步驟：
[0017] 稱取新鮮葉片組織，置于液氮預冷的研缽內，加入液氮，快速研磨至粉末狀，研磨 后的植物粉末放入離心管中，置于液氮中；每個樣品加入DNA混合提取液（每lOmlDNA提 取液加入0. 〇57g亞硫酸氫鈉）核裂解液和十二烷基肌氨酸鈉，用渦旋振蕩器將管內溶液 及植物粉末混合均勻；將樣品置于65°C水浴鍋中45min，水浴過程中每隔10-20min混勻一 次，操作盡可能溫和；取出離心管，置于冰上冷卻，待離心管中混合液至15_25°C后，每管加 入24:1的氯仿：異戊醇混合液，用輕柔的動作上下混勻，當樣品充分混合后，12000rpm離心 lOmin ;離心結束后，吸取上清液于已滅菌的1. 5ml離心管中，加入預冷的異丙醇，在離心管 壁和蓋子上做好標記。輕輕地上下顛倒混勻，當樣品充分混合后放在-20°C中靜置lOmin后 放入離心機，13000rpm離心6min ;離心后棄上清液，所得沉淀用70%乙醇沖洗兩次，放入通 風櫥中風干。待管中0嫩完全干燥，加入50-100 ^1(1(11120、1^1尺似86，在37°(：水浴鍋中 水浴，充分溶解獲得結縷草的基因組DNA。
[0018] 其中，DNA提取液配方優(yōu)選為：稱取D-山梨醇6. 375g、Tris-basel. 21g、 EDTA-Na20. 168g，用無菌水定容至100ml，pH范圍調至7. 5-8. 25之間，4°C保存。
[0019] 核裂解液配方優(yōu)選為：稱取 Tris-base 2. 42g、EDTA-Na2l. 86g、氯化鈉 11. 69g、 CTAB 2g，用無菌水定容至100ml，pH范圍調節(jié)至7. 5-8. 0之間，高溫高壓滅菌。
[0020] 5 %十二烷基肌氨酸鈉配方優(yōu)選為：稱取5g十二烷基肌氨酸鈉，無菌水定容至 100ml，用濾紙過濾，室溫保存。
[0021] 本發(fā)明還提供了含有所述引物的試劑盒。所述試劑盒中還包括PCR反應試劑。
[0022] 本發(fā)明還提供了所述引物或所述試劑盒在鑒別結縷草品種中的應用。
[0023] 本發(fā)明所提供的引物和方法將SSR分子標記技術引入DUS測試，利用DNA指紋技 術構建結縷草品種真?zhèn)蔚认嚓P鑒定的檢測體系，可以用于建立已知結縷草品種的DNA指紋 圖譜數(shù)據(jù)庫，從而對待鑒定品種與標準品種DNA指紋圖譜和數(shù)據(jù)進行自動比較和判別，進 行新結縷草品種的遺傳學鑒定，成為新結縷草品種身份確認和品種鑒定的發(fā)展方向，相對 于結縷草品種現(xiàn)行的"三性"測試和鑒定的方法（外觀形態(tài)特征描述法），測試結果不受環(huán) 境因素的影響，操作方便快捷，測定周期明顯縮短，且測定結果更為準確可靠。一方面為品 種鑒定提供了最為可靠快捷的方法；另一方面有效地解決同種異名、同名不同質和疑似、近 似品種的管理問題。該技術對于加強我國草品種管理，提升草品種審定工作質量具有極其 重要的意義。而且可為牧草良種繁育認定體系建立和強化種市場監(jiān)管提供科學、高效的技 術支撐。
【附圖說明】
[0024] 圖1為六個結縷草品種PCR擴增結果圖，其中，M marker ;1:上海結縷草；2 :蘇植 1號結縷草3 :華南結縷草；4 :青島結縷草；5 :蘭引III號結縷草；6 :膠東青結縷草。
[0025] 圖2為六個結縷草品種的SSR標準指紋圖譜，其中，1:上海結縷草；2 :蘇植1號結 縷草3 :華南結縷草；4 :青島結縷草；5 :蘭引III號結縷草；6 :膠東青結縷草。
【具體實施方式】
[0026] 下面將通過【具體實施方式】對本發(fā)明進行詳細說明。
[0027] 實施例1
[0028] 1)結縷草基因組DNA的提取：
[0029] 樣品數(shù)目：每個品種樣品以25株群體為一個混合樣。
[0030] 2)試劑配制方法：
[0031] DNA 提取液配方：稱取