一種as-pcr技術(shù)引物設(shè)計方法、基因突變檢測方法及試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，尤其涉及一種AS-PCR技術(shù)引物設(shè)計方法、基因突變 檢測方法及試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 基因突變（gene mutation)是由于DNA分子中發(fā)生堿基對的增添、缺失或替換，而 引起的基因結(jié)構(gòu)的改變。野生型基因通過突變成為突變型基因。從分子生物學(xué)的角度，惡 性腫瘤可視為基因的疾病，是因某些染色體上的DNA損傷致使基因突變的結(jié)果，導(dǎo)致細(xì)胞 的生長失控、缺乏分化而異常增生，并可侵犯正常組織和器官，最終可散布全身。腫瘤是由 基因突變而導(dǎo)致異常增生的單個細(xì)胞，這種異常增生細(xì)胞克隆出來的后裔所形成。在腫瘤 進(jìn)展過程中，腫瘤細(xì)胞群中常有另外的基因突變發(fā)生，授予細(xì)胞選擇性優(yōu)勢，例如更快速的 生長，或具有侵犯和轉(zhuǎn)移的特性，使它們在腫瘤細(xì)胞群中占據(jù)優(yōu)勢（成為顯性），該過程稱 為克降性選擇。通過克隆性選擇，腫瘤變得更快速生長和增加惡性表型。
[0003] 目前體細(xì)胞突變的檢測方法主要有DNA測序法、等位基因特異 PCR(Allele-specific PCR，AS-PCR)和等位基因特異擴(kuò)增（ASA，Allele-specific enzymatic amplification)等技術(shù)方法，其中 AS-PCR 又稱作 ARMS (Amplification refractory mutation system)。DNA測序法是進(jìn)行突變檢測的可靠方法，也是使用最多的 方法。然而測序法對取材和技術(shù)要求比較高，更重要的是，由于測序方法本身的限制，靈敏 度不高，只能對含量大于20%的突變基因進(jìn)行檢測。AS-PCR的原理是根據(jù)3'端錯配原則， 在進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)時，若3'端堿基對形成錯配，鏈延伸反應(yīng)就會因3'，5'二磷酸二酯鍵形 成的障礙而受阻。在AS-PCR中，PCR的引物之一或者兩個引物被設(shè)計成在序列變異的位點(diǎn) 處退火，使其能夠區(qū)分同一基因的不同等位基因，這些等位基因類型包括堿基的替換、插入 和缺失。AS-PCR利用了 DNA聚合酶的保真度：相比于3'端最后一個堿基正確匹配引物而 言，3'端最后一個堿基錯配的引物在延伸效率上大大降低（通常為1/100至1/100, 000)。3' 端最后一個堿基錯配的引物由此導(dǎo)致延伸困難，PCR擴(kuò)增減少，因此很容易通過檢測區(qū)分突 變。因此，只有模板鏈?zhǔn)翘囟ǖ牡任换驎r，才會檢測出特異的擴(kuò)增產(chǎn)物。在AS-PCR (ARMS) 的反應(yīng)體系中，引物上標(biāo)記2個不同熒光素,或加入熒光探針等方法都是以實(shí)時熒光PCR為 基礎(chǔ)的基因分型方法?？蓹z測出樣品中含量低至〇. 1-1.0%的突變基因。目前，該方法已成 為國際上腫瘤個體化分子檢測最重要、最先進(jìn)的技術(shù)之一，其在臨床應(yīng)用中的優(yōu)勢已被業(yè) 內(nèi)專家廣泛認(rèn)可。目前，全球只有兩家企業(yè)擁有ARMS技術(shù)和相應(yīng)產(chǎn)品，分別是廈門艾德生 物醫(yī)藥科技有限公司擁有自主知識產(chǎn)權(quán)的環(huán)形引物雙擴(kuò)增技術(shù)（ADx-ARMS)和英國DxS公 司的蝎形探針擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)（scorpionARMS)技術(shù)。
[0004] 在具體使用過程中，研究人員發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)有技術(shù)中AS-PCR方法的主要限制因素是， 若突變的位點(diǎn)為弱錯配堿基序列，該方法的特異性將受到影響。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的一個目的是提供一種有效降低因突變位點(diǎn)強(qiáng)弱錯 配而導(dǎo)致的每個突變位點(diǎn)的AS-PCR引物特異性的差異性的AS-PCR引物設(shè)計方法。
[0006] 本發(fā)明的AS-PCR技術(shù)引物設(shè)計方法，包括以下步驟：
[0007] 1)針對包含待測等位基因突變區(qū)域的靶序列設(shè)計AS-PCR引物；
[0008] 2)針對AS-PCR引物設(shè)計競爭阻斷引物，所述競爭阻斷引物為與AS-PCR引物反向 互補(bǔ)的寡核苷酸。
[0009] 進(jìn)一步的，所述競爭阻斷引物與所述AS-PCR引物的長度一致。
[0010] 進(jìn)一步的，所述AS-PCR引物的：V末端第2和/或第3個堿基處引入與靶序列錯 配的堿基。
[0011] 當(dāng)競爭阻斷引物濃度在過量的情況下，會與靶序列（模板DNA)形成競爭作用，等 位基因 AS-PCR引物會與過量的競爭阻斷引物（competitive blocker)結(jié)合形成二聚體而 被封閉，但在退火條件下，該二聚體變得不穩(wěn)定開始解離，AS-PCR引物會與競爭阻斷引物 分開，然后與3'末端匹配的模板DNA完全結(jié)合并在酶的作用下繼續(xù)擴(kuò)增。眾所周知的是， AS-PCR引物包括上游引物和下游引物，其中一條引物的3'端最后一個堿基與突變堿基互 補(bǔ)，在AS-PCR中，PCR的引物之一被設(shè)計成在序列變異的位點(diǎn)處退火，因此，競爭阻斷引物 通常設(shè)計為一條，與AS-PCR引物中包含突變堿基的一條反向互補(bǔ)。
[0012] 本發(fā)明還提供一種AS-PCR基因突變檢測方法，包括以下步驟：
[0013] 1)針對包含待測等位基因突變區(qū)域的靶序列設(shè)計AS-PCR引物；
[0014] 2)針對AS-PCR引物設(shè)計競爭阻斷引物，所述競爭阻斷引物為與AS-PCR引物反向 互補(bǔ)的寡核苷酸；
[0015] 3)使用步驟1)和2)設(shè)計的AS-PCR引物和競爭阻斷引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
[0016] 4)分析步驟3)的擴(kuò)增結(jié)果確定基因突變信息。
[0017] 進(jìn)一步的，步驟3)中，PCR擴(kuò)增時所述競爭阻斷引物的濃度為AS-PCR引物濃度的 2-8 倍。
[0018] 本發(fā)明還提供一種AS-PCR基因突變檢測試劑盒，包括AS-PCR引物、競爭阻斷引 物、TaqMan探針、內(nèi)控引物、內(nèi)控探針、聚合酶、dNTP和緩沖液，其中，所述AS-PCR引物為針 對包含待測等位基因突變區(qū)域的靶序列設(shè)計而成，所述競爭阻斷引物為針對AS-PCR引物 設(shè)計而成，并且所述競爭阻斷引物為與AS-PCR引物反向互補(bǔ)的寡核苷酸。
[0019] 本發(fā)明的另一個目的是提供一種采用上述方法和試劑盒來檢測癌癥相關(guān)基因突 變的試劑盒。在許多腫瘤中κ-ras基因的突變率較高，在白血病、肺癌、直腸癌和胰腺癌等 癌癥中，k-ras突變均很常見，近年來研究顯示K-ras基因活性物與細(xì)胞增殖、凋亡之間關(guān) 系密切。突變K-ras基因使本應(yīng)正常死亡的細(xì)胞的生存期延長，K-ras基因過度表達(dá)還能 增加抗藥物和紫外光誘導(dǎo)的凋亡，可能的機(jī)制是K-ras基因增強(qiáng)了細(xì)胞分解過氧化氫的能 力從而抑制凋亡。K-ras基因能夠根據(jù)激活信號的強(qiáng)度和質(zhì)量、細(xì)胞類型和代謝環(huán)境誘導(dǎo)細(xì) 胞抗凋亡通道，因此對K-ras基因突變的檢測將有助于控制腫瘤細(xì)胞生長和凋亡制定出有 效的治療方案。K-ras突變結(jié)直腸癌和非小細(xì)胞肺癌中突變率分別可達(dá)30?60%和21? 28%。同時在上述兩種腫瘤中約80?90%的K-ras基因突變發(fā)生在突變熱點(diǎn)2號外顯子 12、13密碼子上?！?9年NCCN非小細(xì)胞肺癌臨床實(shí)踐指南》明確指出：當(dāng)K-ras基因如果 發(fā)生了突變，則不建議病人使用特羅凱（Tarceva/厄洛替尼/Erlotinib)進(jìn)行分子靶向治 療。除此以外，有研究結(jié)果表示，12號密碼子的突變使得甘氨酸突變?yōu)閿X氨酸的K-ras基因 (G12V)與大腸癌病人總生存數(shù)下降相關(guān)，G12V突變體與聯(lián)合其他突變體和野生型的K-ras 相比表現(xiàn)出明顯的更差的總生存率，而除G12V以外的其他突變則觀察到明顯的對總生存 數(shù)有保護(hù)作用。大量的分析表明G12V突變增加了復(fù)發(fā)和死亡的風(fēng)險。研究表明是由于G12V 與GTP緊密結(jié)合產(chǎn)生長期的有致癌潛能的信號所致，而G12D (甘氨酸突變?yōu)樘於彼幔┡c GTP的低親和力使得G12D逃脫了致癌的GTP結(jié)合狀態(tài)。綜上所述檢測K-ras基因突變的情 況不僅僅有助于腫瘤的早期診斷及預(yù)防，也有利于腫瘤患者的臨床治療。準(zhǔn)確且迅速的診 斷出K-ras基因有無12、13號密碼子突變對腫瘤的早期診斷及預(yù)后有著重要的意義。
[0020] 本發(fā)明還提供一種檢測K-ras基因突變的試劑盒，包括AS-PCR引物、競爭阻斷引 物、TaqMan探針、內(nèi)控引物、內(nèi)控探針、聚合酶、dNTP和緩沖液，其中，所述AS-PCR引物為針 對包含K-ras基因突變區(qū)域的靶序列設(shè)計而成，所述競爭阻斷引物為針對AS-PCR引物設(shè)計 而成，并且所述競爭阻斷引物為與AS-PCR引物反向互補(bǔ)的寡核苷酸。
[0021] 進(jìn)一步的，所述AS-PCR引物為針對包含K-ras基因2號外顯子的12密碼子和/ 或13密碼子突變的靶序列設(shè)計而成，其中，12密碼子突變包括GGT>GAT突變、GGT>GCT突 變、GGT>GTT突變、GGT>AGT突變、GGT>CGT突變和GGT>TGT突變中的一種或幾種，13密碼子 突變包括GGOGAC突變。
[0022] 進(jìn)一步的，
[0023] 1)根據(jù)KRAS基因2號外顯子12密碼子的GGT>GAT突變而設(shè)計的AS-PCR引物及 競爭阻斷引物分別為包含SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO: 3的AS-PCR引物和包含SEQ ID NO: 2 的競爭阻斷引物；
[0024] 2)根據(jù)KRAS基因 2號外顯子12密碼子的GGT>GCT突變而設(shè)計的AS-PCR引物及競 爭阻斷引物分別為包含SEQ ID NO:9和SEQ ID NO: 3的AS-PCR引物和包含SEQ ID NO: 10 的競爭阻斷引物；
[0025] 3)根據(jù)KRAS基因 2號外顯子12密碼子的GGT>GTT突變而設(shè)計的AS-PCR引物及競 爭阻斷引物分別為包含SEQ ID NO: 11和SEQ ID NO: 3的AS-PCR引物和包含SEQ ID NO: 12 的競爭阻斷引物；
[0026] 4)根據(jù)KRAS基因2號外顯子12密碼子的GGT>AGT突變而設(shè)計的AS-PCR引物及競 爭阻斷引物分別為包含SEQ ID