基因分型的方法
【專利說明】
[0001] 本申請是中國專利申請201080061597. 0的分案申請。
技術(shù)領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明涉及基因分型的方法，特別涉及被分配給各基因型的ID序列，以及使用所 述ID序列的多重基因分型方法。
【背景技術(shù)】
[0003] 已開發(fā)的檢測感染性生物體的方法包括傳統(tǒng)的通過培養(yǎng)來鑒別病原體的物理和 化學(xué)特征的方法，以及檢測病原體的特定遺傳特征的方法。遺傳特征的檢測方法包括限制 性片段長度多態(tài)性（RFLP)分析、擴(kuò)增片段長度多態(tài)性（AFLP)分析、脈沖場凝膠電泳、任意 引物聚合酶鏈反應(yīng)（AP-PCR)技術(shù)，基于重復(fù)序列的PCR，核糖分型和比較核酸測序。這些 方法用于大多數(shù)診斷設(shè)置通常顯得過于緩慢、昂貴、不可重復(fù)，并且技術(shù)要求高。所有上述 方法一般都需要：使用繁瑣的凝膠電泳步驟、病原體在培養(yǎng)過程中的生長、其基因組的DNA 純化，以及樣本不包含多于一種類型的生物體。這些限制也存在于最近開發(fā)的采用高密度 微陣列的檢測方法（Salazar et al. ,Nucleic Acids Res. 24:5056-5057, 1996 ;Troesch et al. , J. Clin. Microbiol. 37:49-55, 1999 ；Lashkari et al. , Proc. Natil. Acad. Sci. U. S. A. 94:13057-13062, 1997)。與此同時(shí)，焦磷酸測序是一種基于"通過DNA合成測序"原 則的DNA測序方法，它不同于傳統(tǒng)的Sanger測序方法，而是依賴于檢測核苷酸插入過程中 釋放的焦磷酸。在焦磷酸測序法中，在聚合過程中順序地逐一添加四種脫氧核苷酸三磷酸 (dNTPs)。與通過酶促反應(yīng)被聚合的dNTPs結(jié)合的PPi發(fā)出光，并且發(fā)出的光根據(jù)順序地添 加的dNTPs的反應(yīng)順序而顯示出信號峰，峰顯示出與反應(yīng)的dNTPs的數(shù)目成比例的多或者 少的模式，這樣能夠確定病原體的核苷酸序列。近年來，已經(jīng)使用了對病原體特異序列的 PCR產(chǎn)物進(jìn)行焦磷酸測序，基于由此獲得的熱裂解譜圖（pyrogram)對臨床標(biāo)本中的病原細(xì) 菌或病毒進(jìn)行檢測的方法（Travasso, CM et al, J. Biosci.，33:73-80, 2008 ;Gharizadeh, B et al., Molecular and Cellular Probes, 20, 230-238, 2006 ；Hoffmann, C et al., Nucleic Acid Research，1-8, 2007)〇
[0004] 然而，在上述焦磷酸測序技術(shù)中，核苷酸測序是根據(jù)dNTPs的分配順序來進(jìn)行，并 且在模版中的不處于分配順序中的核苷酸不會(huì)參加反應(yīng)，因此不會(huì)形成信號峰。然而，當(dāng) 在所述分配順序中相同的核苷酸持續(xù)出現(xiàn)時(shí)，根據(jù)所發(fā)射出的光的強(qiáng)度而確定信號峰的高 度。因此，當(dāng)多種病原體存在于同一樣品中，不同病原體核苷酸的信號峰將出現(xiàn)重疊，因此， 這使通過解釋熱裂解譜圖來鑒定病原體變得困難。特別是隨著重復(fù)序列數(shù)目增加時(shí)，前面 序列的信號峰變得相對較低。因此，在多種病原體感染的情況下，根據(jù)每種病原體的感染程 度來檢測信號峰變得困難。
[0005] 因此，本發(fā)明付出大量的努力，使得能通過利用焦磷酸測序進(jìn)行基因分型獲得的 獨(dú)特且簡單的熱裂解譜圖來獲得所感興趣的基因型。結(jié)果，本發(fā)明發(fā)明者發(fā)現(xiàn)，當(dāng)ID序列 含有ID標(biāo)記、標(biāo)記物和終止標(biāo)記，同時(shí)所述ID序列獨(dú)立存在于需要進(jìn)行分型的特異性序列 之外時(shí)，將所述ID序列與該特異性序列接連并用于進(jìn)行焦磷酸測序，將獲得針對于每種基 因型的獨(dú)特且簡單的熱裂解譜圖，從而完成本發(fā)明。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種ID序列，所述ID序列可用于進(jìn)行焦磷酸測序，以便能通 過獨(dú)特、簡單的熱裂解譜圖確定感興趣的基因型。
[0007] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供使用所述ID序列的基因分型方法。
[0008] 本發(fā)明又另一個(gè)目的是提供使用所述ID序列對HPV基因分型的方法。
[0009] 本發(fā)明再另一目的是提供使用所述ID序列檢測KRAS基因突變的方法。
[0010] 本發(fā)明又一目的是提供使用所述ID序列檢測呼吸道病毒的方法。
[0011] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種用于基因分型的ID序列，其由A(ID-S)n-E組 成，其中ID是ID標(biāo)記，是選自A、T、C和G的單核苷酸；S是標(biāo)志物，其是與相鄰的ID標(biāo)記 連接，且不同于相鄰的ID標(biāo)記的核苷酸；E是終止標(biāo)記，其是不同于所述標(biāo)志物的核苷酸， 并且η是從1到32的自然數(shù)。
[0012] 本發(fā)明還提供一種用于基因分型的ID序列，由ID-S組成，其中ID是ID標(biāo)記，是 選自A、T、C和G的單核苷酸；并且S是標(biāo)志物，其是與相鄰的ID標(biāo)記連接，且不同于相鄰 的ID標(biāo)記的核苷酸。
[0013] 本發(fā)明也提供一種基因分型引物，包括與所述ID序列連接的用于基因分型的基 因特異性序列。
[0014] 本發(fā)明也提供一種基因分型的方法，其包括使用所述基因分型引物。
[0015] 本發(fā)明也提供一種用于HPV基因分型的方法，該方法的步驟包括：（a)根據(jù)每種 HPV病毒的基因型設(shè)計(jì)用于基因分型的ID序列，該ID序列由（ID-S)n-E組成，其中ID是 ID標(biāo)記，是選自A、T、C和G的單核苷酸；S是標(biāo)志物，其是與相鄰的ID標(biāo)記連接，且不同于 相鄰的ID標(biāo)記的核苷酸；E是終止標(biāo)記，其是不同于所述標(biāo)志物的核苷酸，并且η是從1到 32的自然數(shù)；(b)構(gòu)建基因分型引物，所述基因分型引物由焦磷酸測序引物序列、ID序列和 對應(yīng)于該ID序列的對病毒基因型特異的序列組成；（c)使用該基因分型引物，通過PCR擴(kuò) 增含有HPV病毒的樣品；以及（d)以擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物進(jìn)行焦磷酸測序來獲得一序列用作ID 序列，并根據(jù)該ID序列區(qū)分HPV的基因型。
[0016] 本發(fā)明也提供一種用于檢測KRAS基因突變的方法，該方法的步驟包括：(a)根據(jù) 各KRAS基因突變來設(shè)計(jì)用于基因分型的ID序列，該ID序列由（ID-S) n-E組成，其中ID是 ID標(biāo)記，是選自A、T、C和G的單核苷酸；S是標(biāo)志物，其是與相鄰的ID標(biāo)記連接，且不同于 相鄰的ID標(biāo)記的核苷酸；E是終止標(biāo)記，其是不同于所述標(biāo)志物的核苷酸，并且η是從1到 32的自然數(shù)；(b)構(gòu)建檢測引物，該檢測引物由焦磷酸測序引物序列、ID序列和對應(yīng)于該ID 序列的對KRAS基因突變特異的序列組成；（c)使用該檢測引物，通過PCR擴(kuò)增含有KRAS基 因的樣品；以及（d)以擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物進(jìn)行焦磷酸測序來獲得ID序列的熱裂解譜圖，并根 據(jù)該ID序列檢測KRAS基因突變。
[0017] 本發(fā)明也提供了一種用于檢測呼吸道病毒的方法，該方法的步驟包括：(a)根據(jù) 流行性感冒A病毒、流行性感冒B病毒、RSV(呼吸道合胞病毒）B、鼻病毒和冠狀病毒OC43 的基因型各設(shè)計(jì)用于基因分型的ID序列，該ID序列由（ID-S)n-E組成，其中ID是ID標(biāo)記， 是選自A、T、C和G的單核苷酸；S是標(biāo)志物，其是與相鄰的ID標(biāo)記連接，且不同于相鄰的ID 標(biāo)記的核苷酸；E是終止標(biāo)記，其是不同于所述標(biāo)志物的核苷酸，并且η是從1到32的自然 數(shù)；(b)構(gòu)建檢測引物，該檢測引物由焦磷酸測序引物序列、ID序列和對應(yīng)于該ID序列的 對呼吸道病毒基因特異的序列組成；（c)使用檢測引物，通過PCR擴(kuò)增含有呼吸道病毒的樣 品，該呼吸道病毒選自由流行性感冒A病毒、流行性感冒B病毒、呼吸道合胞病毒B、鼻病毒 和冠狀病毒0C43的組成的組；以及（d)以擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物進(jìn)行焦磷酸測序來獲得ID序列 的熱裂解譜圖，并根據(jù)該ID序列檢測呼吸道病毒。
[0018] 本發(fā)明也提供一種對樣品中的不同目的基因進(jìn)行基因分型的方法，包括：i)構(gòu)建 基因分型引物，其中所述引物包括與被分配給各基因型的ID序列相連的基因特異性序列， 其中每個(gè)ID序列由ID標(biāo)記、N個(gè)標(biāo)志物和終止標(biāo)記組成，其中ID標(biāo)記選自A、T、C和G的 核苷酸，N個(gè)標(biāo)志物是以相同順序排列并與相鄰的ID標(biāo)記不同的核苷酸，終止標(biāo)記是在最 后面的標(biāo)志物之后并與最后面的標(biāo)志物不同的核苷酸；其中N是2-32的自然數(shù)，以及其中 ID標(biāo)記可以位于標(biāo)志物前面并且是由與位于其后的標(biāo)志物不同的核苷酸組成的三種不同 核苷酸之一，或者ID標(biāo)記可以位于兩個(gè)標(biāo)志物之間并且是由與位于其兩側(cè)的標(biāo)志物不同 的核苷酸組成的三種不同核苷酸之一；ii)使用i)的基因分型引物，通過PCR擴(kuò)增目的基 因的模板，由此獲得PCR產(chǎn)物；iii)根據(jù)步驟i)設(shè)計(jì)的ID序列的順序分配dNTP，對步驟 ii)的PCR產(chǎn)物測序，所述ID序列的順序不包括用于終止標(biāo)記的dNTP ;和iv)根據(jù)ID標(biāo)記 的核苷酸和位置進(jìn)行基因分型。
【附圖說明】
[0019] 圖1示出焦磷酸測序過程，該過程根據(jù)分配順序進(jìn)行，然后得到熱裂解譜圖。
[0020] 圖2示出根據(jù)分析序列的熱裂解譜圖中的信號峰變化。
[0021] 圖3示出根據(jù)分析序列的熱裂解譜圖中的信號峰變化。
[0022] 圖4示出由于標(biāo)記物插入引起的熱裂解譜圖中的信號峰變化。
[0023] 圖5示出從兩個(gè)不同的分析序列的混合物獲得的熱裂解譜圖。
[0024] 圖6示出在分配順序中標(biāo)記物的存在或缺失獲得的熱裂解譜圖。
[0025] 圖7示出根據(jù)序列末端標(biāo)記物的改變，熱裂解譜圖模式的變化。
[0026] 圖8示出終止標(biāo)記的缺失獲得的熱裂解譜圖。
[0027] 圖9示出終止標(biāo)記的缺失獲得的熱裂解譜圖。
[0028] 圖10示出根據(jù)標(biāo)記物順序改變的分配順序改變。
[0029] 圖11示出根據(jù)分配順序來設(shè)計(jì)ID序列的方法。
[0030] 圖12示出設(shè)計(jì)分配順序的方法。
[0031] 圖13示出根據(jù)分配順序通過ID序列獲得的熱裂解譜圖。
[0032] 圖14示出確定分配順序后設(shè)計(jì)ID序列的方法。
[0033] 圖15示出根據(jù)分配順序通過ID序列獲得的熱裂解譜圖。
[0034] 圖16示出利用本發(fā)明ID序列進(jìn)行HPV基因分型的方法。
[0035] 圖17示出用于檢測KRAS突變的總體系。
[0036] 圖18示出使用本發(fā)明的ID序列檢測KRAS突變的方法。
[0037] 圖19示出通過使用本發(fā)明的ID序列對15種類型HPV進(jìn)行基因分型獲得的結(jié)果。
[0038] 圖20示出對兩種或更多種類型HPV進(jìn)行基因分型獲得的結(jié)果。
[0039] 圖21示出使用本發(fā)明的ID序列檢測KRAS突變的結(jié)果。
[0040] 圖22示出使用本發(fā)明的ID序列檢測多個(gè)KRAS突變的結(jié)果。
[0041] 圖23示出使用本發(fā)明的ID序列檢測結(jié)直腸癌組織中KRAS突變的結(jié)果。
[0042] 圖24示出使用本發(fā)明的ID序列檢測呼吸道病毒感染的方法。
[0043] 圖25示出使用本發(fā)明的ID序列檢測5種呼吸道病毒中的單個(gè)感染的結(jié)果。
[0044] 圖26示出使用本發(fā)明的ID序列檢測5種呼吸道病毒中的多個(gè)感染的結(jié)果。
[0045] 本發(fā)明的最佳實(shí)施方式
[0046] 通過下面的詳細(xì)描述和所附權(quán)利要求書，本發(fā)明的其他特征和實(shí)施方式將更加顯 而易見。
[0047] 一方面，本發(fā)明涉及用