專利名稱：一種hpv檢測(cè)及分型方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生命科學(xué)和生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種通過DNA條碼技術(shù)和焦磷酸測(cè) 序技術(shù)檢測(cè)生物樣品中的HPV，并對(duì)其進(jìn)行分型。
背景技術(shù)：
人乳頭瘤病毒是一種小型DNA病毒，基因組DNA為環(huán)狀，大小約8000bp。目前根 據(jù)其基因組結(jié)構(gòu)的差異分為100多種亞型[12]，。1974年Zur Hausen提出HPV感染與宮頸 癌有密切關(guān)系，1995年WHO和IARC將HPV確定為宮頸癌的病因[3]。不同亞型HPV的致病 機(jī)制和致癌危險(xiǎn)性各不相同，根據(jù)HPV流行病學(xué)分類，其中15個(gè)亞型HPV為高危型，3個(gè)亞 型為可能高危型，12個(gè)亞型為低危型[4’5]。低危險(xiǎn)型HPV包括HPV6、11、42、43、44等，常引 起外生殖器濕疣等良性病變包括宮頸上皮內(nèi)低度病變(CIN I)，高危險(xiǎn)型HPV包括HPV16、 18、 31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68丄 8304等亞型，與宮頸癌及宮頸上皮內(nèi)高度病變 (CIN II/III)的發(fā)生相關(guān)，尤其是HPV16和18型。HPV感染是宮頸癌發(fā)生的主要病因，持 續(xù)高危型HPV的感染是癌前病變和浸潤性宮頸癌發(fā)展的必要因素。由于各亞型HPV致病力 及感染后的預(yù)后有很大差異，因此臨床上有必要建立一種簡便、快速、靈敏、特異的分型檢 測(cè)方法。對(duì)HPV的檢測(cè)主要通過分子生物學(xué)方法來進(jìn)行。雜交捕獲(hybrid capture, HC-II)是目前唯一經(jīng)美國FDA批準(zhǔn)應(yīng)用于臨床的HPV檢測(cè)方法，但是只能區(qū)分高危和低危， 不能具體分型，并且使用時(shí)需要其配套儀器——基因信號(hào)擴(kuò)大儀，價(jià)格昂貴，檢測(cè)成本高。 臨床目前使用的導(dǎo)流雜交法則由于技術(shù)上的缺陷導(dǎo)致假陰性和假陽性偏高，此外熒光實(shí)時(shí) PCR技術(shù)對(duì)HPV進(jìn)行分型檢測(cè)也不能準(zhǔn)確區(qū)分HPV亞型，并且可能存在假陽性，通量低，不 能同時(shí)檢測(cè)多個(gè)亞型；SzuhaiK等[6]應(yīng)用SybrGreen和分子信標(biāo)定量PCR的方法對(duì)HPV進(jìn) 行分型檢測(cè)，特異性很好，而且可以對(duì)樣本的HPV進(jìn)行相對(duì)定量，但是他們僅能區(qū)分出7個(gè) HPV 亞型(HPV-06, -11，-16，-18，-31，-33，-45)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足臨床需要。因此開發(fā)一種能準(zhǔn)確快速檢測(cè)并可以對(duì)HPV進(jìn)行基因分型的方法，對(duì)于生殖道腫 瘤的篩查，預(yù)防宮頸癌的發(fā)生顯得尤為必要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種快速，準(zhǔn)確，高通量的HPV檢測(cè)及 分型方法。一種HPV檢測(cè)及分型方法，其特征在于包括以下步驟(a)用HPV裂解液對(duì)生物樣品中的HPV進(jìn)行裂解，分離提取核酸；(b)用以下特異性引物從步驟(a)所得核酸中擴(kuò)增HPVLl核酸片段Gl :5，-CARGGACATAAYAATGGYATTTGCTG-3，(SEQ ID No. 1)G2 5' -CARGGACATAAYAATGGYATTTGTTG-3，(SEQ ID No. 2)G3 5' -GAAAAAYAAACTGYAAATCATAYTCCTC-3，(SEQ ID No. 3)
G4:5，-GAAAAAYAAACTGYAAATCATAYTCTTC-3，(SEQ ID No. 4)其中G3/G4為生物素標(biāo)記引物；(c)對(duì)步驟(b)獲得的HPVLl核酸片段進(jìn)行焦磷酸測(cè)序反應(yīng)，焦磷酸測(cè)序引物選自 以下任意一種或幾種HPV6s 5' -AACTACATCTTCCACATACAC-3，(SEQ ID No. 5)HPVlls 5' -GTCTAAATCTGCTACATACAC-3，(SEQ ID No. 6)HPV16s 5' -ATTATGTGCTGCCATATCTACTT-3，(SEQ ID No . 7)HPV18s 5' -ACAGTCTCCTGTACCTGGG-3，(SEQ ID No. 8)HPV31s 5' -CCAATATGTCTGTTTGTGCTGC-3，(SEQ ID No. 9)HPV33s :5，-GTACTAATATGACTTTATGC-3，(SEQ ID No. 10)HPV35s :5，-GTGTTCTGCTGTGTCTTCTAGT-3，(SEQ ID No. 11)HPV39s :5，-TATAGAGTCTTCCATACCT-3，(SEQ ID No. 12)HPV40s :5，-CCCCACACCAACCCCATATAA—3，(SEQ ID No. 13)HPV42s :5，-CATGACTTTGTGTGCCACTG-3，(SEQ ID No. 14)HPV43s :5，-CGTTATGTGCCTCTACTGACC-3，(SEQ ID No. 15)HPV44s :5，-CTACACAGTCCCCTCC-3，(SEQ ID No. 16)HPV45s :5，-CTCTACACAAAATCCTGTG-3，(SEQ ID No. 17)HPV51s :5，-CTGCTGCGGTTTCC-3，(SEQ ID No. 18)HPV52s :5，-TTTATGTGCTGAGGTTAAAAAG-3，(SEQ ID No. 19)HPV53s 5' -CGCAACCACACAGTCTATG-3，(SEQ ID No. 20)HPV54s 5' -ACAGCATCCACGCAGG-3，(SEQ ID No. 21)HPV56s 5' -CAGAACAGTTAAGTAAATATGAT-3，(SEQ ID No. 22)HPV58s 5' -CACTGAAGTAACTAAGG-3，(SEQ ID No. 23)HPV59s 5' -TTCTACTACTTCTTCTATTCCTAA-3，(SEQ ID No. 24)HPV66s 5' -TAATGCAGCTAAAAGC-3，(SEQ ID No. 25)HPV68as 5' -TTTGTCTACTACTACTGAATCA-3，(SEQ ID No. 26)HPV70s 5' -AACGGCCATACCTGCTGTATAT-3，(SEQ ID No. 27)HPV73s 5' -TAGGTACACAGGCTAGTAG-3，(SEQ ID No. 28)HPV83s 5' -GCTACACAGGCTAATGAATACACA-3，(SEQ ID No. 29)HPVmm4s 5' -CACTGCTGTTACTCAATCTG-3，(SEQ ID No. 30)HPVCP8304s 5' -GCTACATCTGCTGCT-3，(SEQ ID No. 31)(d)將焦磷酸測(cè)序讀出的序列與HPV型別序列進(jìn)行比對(duì)，判斷HPV分型結(jié)果。進(jìn)一步地，步驟(a)中所述的HPV裂解液成分為20mmol/L Tris. HCL pH8. 0， 0. 5% Triton(曲拉通)-X-100，10% chelex(螫合樹脂)-100。步驟(d)所述的HPV型別序列包括HPV6 5' -CAATTCTGATTATAAAGAGTACATGCG-3，(SEQ ID No. 32)HPV 11 :5，-TAATTCAGATTATAAGGAATA-3，(SEQ ID No. 33)HPV16 5' -CAGAAACTACATATAAAAATACTAACTT-3，(SEQ ID No. 34)HPV 18:5，-CCTATGATGCTACCAAATTTAA-3，(SEQ ID No. 35)
HPV31 :5，-AATTGCAAACAGTGATACTACATTT-3，(SEQ ID No. 36)HPV33 :5，-ACACAAGTAACTAGTG-3，(SEQ ID No. 37)HPV35 5' -GACAGTACATATAAAAA-3，(SEQ ID No. 38)HPV39 5' -TCTACATATGATCCTT-3，(SEQ ID No. 39)HPV40 5' -TAACAGTAATTTCAAGGAATATTTGCGT-3，(SEQ ID No. 40)HPV42 5' -CAACATCTGGTGATACATATACA-3，(SEQ ID No. 41)HPV43 5' -CTACTGTGCCCAGTACATATGACAA-3，(SEQ ID No. 42)HPV44 5' -GTCTACATATACTAGTGAACAATATAA-3，(SEQ ID No. 43)HPV45 5' -CCAAGTACATATGACCCTA-3，(SEQ ID No. 44)HPV51 CCAACATTTACTCCAAGTAACTTTAAGCAAT-3' (SEQ ID No. 45)HPV52 5' -GAAAGCACATATAAAAATGAAAATTTTAA-3，(SEQ ID No. 46)HPV53 5' -CAGTCTATGTCTAC-3，(SEQ ID No. 47)HPV54 5' -ATAGCTATATCTG-3，(SEQ ID No. 48)HPV56 5' -GCACGAAAAATTAATCAGTACCTT-3，(SEQ ID No. 49)HPV58 5' -AAGGTACATATAAAAATGATAATTTTAAGG-3，(SEQ ID No. 50)HPV59 5' -TGTATACACACCTACCAGTTTTAAA-3，(SEQ ID No. 51)HPV66 5' -ACATTAACTAAATATGATGCCC-3，(SEQ ID No. 52)HPV68a :5，-GCTGTACCAAATATTTATGATCCTAATAAATTT -3，(SEQ IDNo. 53)HPV70 5' -AGCCCTACAAAGTTTAAGGAATATACTAG-3，(SEQ ID No. 54)HPV73 5' -CTCTACTACAACGTATGCCAACTCTAA-3，(SEQ ID No. 55)HPVmm4 5' -TGCACAAACATTTACTCCAGCAAA-3，(SEQ ID No. 56)HPV83 5' -GCCTCTAACTTTAAGGAATACCTCCGC-3，(SEQ ID No. 57)HPVCP8304 5' -GCAGAATACAAGGCCTCTAACTTTAA-3，(SEQ ID No. 58)。本發(fā)明利用DNA條碼技術(shù)和焦磷酸測(cè)序技術(shù)，對(duì)生物樣本中的HPV進(jìn)行檢測(cè)、分 型，可用于評(píng)估生殖道癌癥及相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展并對(duì)其進(jìn)行預(yù)后指導(dǎo)。本發(fā)明本發(fā)明操 作簡便、通量高、特異性好、靈敏度高、準(zhǔn)確性較高、檢測(cè)速度快、檢測(cè)成本低，具有廣闊的應(yīng) 用前景。


圖1是使用本發(fā)明方法對(duì)一個(gè)待測(cè)樣品進(jìn)行檢測(cè)的焦磷酸測(cè)序2是使用本發(fā)明方法對(duì)另一個(gè)待測(cè)樣品進(jìn)行檢測(cè)的焦磷酸測(cè)序3是使用本發(fā)明方法對(duì)第三個(gè)待測(cè)樣品進(jìn)行檢測(cè)的焦磷酸測(cè)序4是使用本發(fā)明方法對(duì)第四個(gè)待測(cè)樣品進(jìn)行檢測(cè)的焦磷酸測(cè)序圖
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 HPV基因片段的擴(kuò)增取宮頸分泌物保存液Iml，13000rpm離心10分鐘，棄上清后以HPV裂解液 (20mmol/L Tris. HCL pH8. 0,0. 5% Triton-X-100,10 % chelex-100) 20 μ 1 懸浮沉淀物，100°C煮10分鐘，13000rpm離心10分鐘后取2 μ 1作為HPV基因擴(kuò)增模板，擴(kuò)增體系如下 引物 Gl G4 (SEQ ID No. 1 SEQ ID No. 4)分別取 3 μ 1，10mmol/L dNTPs 4 μ l,25mmol/ L MgCl2 16 μ 1，10XPCR緩沖液2 μ 1，總體積200 μ 1，分4管擴(kuò)增；擴(kuò)增程序如下94°C預(yù) 變性 2min，40 個(gè)循環(huán)(94°C 20s, 50°C 30s, 72°C lmin)。實(shí)施例2 單鏈模板的制備將前述擴(kuò)增所得PCR產(chǎn)物，每樣品按照50 μ 1加入3 μ 1鏈霉親和素包被的磁珠在 室溫下孵育10分鐘。與磁珠結(jié)合后的PCR產(chǎn)物分別在75%乙醇，0. 2mol/L的NaOH溶液及 Tris洗脫液中各孵育10秒，充分反應(yīng)后變性得到單鏈DNA。將與磁珠結(jié)合后的單鏈釋放懸浮 于 45 μ 1 退火緩沖液中(IOOmM Tris-acetate pH7. 75,20mM Mg-acetate，含 IOpmol 混合測(cè)序 引物SEQ ID No. 5 SEQ ID No. 31)。在80°C下孵育2分鐘，然后在室溫下放置5分鐘。實(shí)施例3焦磷酸測(cè)序反應(yīng)測(cè)序反應(yīng)在28°C下自動(dòng)在PYROMARK ID (Qiagen公司)儀器的SQA模式下進(jìn)行檢 測(cè)，引物鏈隨著不同dNTP(加入順序C — T — G — A — C — T — G — A — C — T — G — A) 的加入而延伸，隨著酶促的反應(yīng)的進(jìn)行，CCD攝像機(jī)檢測(cè)到發(fā)出的光信號(hào)，測(cè)序圖譜如圖1 所示。測(cè)得的序列為CAGAAACTAC，與SEQ IDNo. 34部分重疊，判斷為HPV-16型。實(shí)施例4HPV基因片段的擴(kuò)增、單鏈模板的制備、焦磷酸測(cè)序反應(yīng)同實(shí)施例1 3，對(duì)另一待 測(cè)樣品進(jìn)行檢測(cè)。焦磷酸測(cè)序圖如圖2所示，測(cè)得的序列為CCGAAACGAAAACTGACT，按照測(cè) 序反應(yīng)時(shí)單核苷酸添加順序C — T — G — A及SEQ ID No. 32-58判斷為HPV-16/HPV_35混
合感染。實(shí)施例5HPV基因片段的擴(kuò)增、單鏈模板的制備、焦磷酸測(cè)序反應(yīng)同實(shí)施例1 3，對(duì)第三個(gè) 待測(cè)樣品進(jìn)行檢測(cè)。焦磷酸測(cè)序圖如圖3所示，測(cè)得的序列為GGAACCTGATGACTAAA，按照測(cè) 序反應(yīng)時(shí)單核苷酸添加順序C — T — G — A及SEQ ID No. 32-58判斷為HPV-35/HPV-68混 合感染。實(shí)施例6HPV基因片段的擴(kuò)增、單鏈模板的制備、焦磷酸測(cè)序反應(yīng)同實(shí)施例1 3，對(duì)第四個(gè) 待測(cè)樣品進(jìn)行檢測(cè)。焦磷酸測(cè)序圖如圖4所示，測(cè)得的序列為TTATCTGAACTGACT，按照測(cè)序 反應(yīng)時(shí)單核苷酸添加順序C — T — G — A及SEQ ID No. 32-58判斷為HPV-66/HPV-53混合 感染。序列表<110>杭州艾迪康醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心有限公司<120> 一種HPV檢測(cè)及分型方法<130><160>58<170>PatentIn version 3. 3<210>1
<211>26<212>DNA<213>人工序列<400>1carggacata ayaatggyat ttgctg 26<210>2<211>26
<212>DNA<213>人工序列<400>2carggacata ayaatggyat ttgttg 26<210>3<211>28<212>DNA<213>人工序列<400>3gaaaaayaaa ctgyaaatca taytcctc 28<210>4<211>28<212>DNA<213>人工序列<400>4gaaaaayaaa ctgyaaatca taytcttc 28<210>5<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>5aactacatct tccacataca c21<210>6<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>6gtctaaatct gctacataca c21<210>7<211>23<212>DNA<213>人工序列
<400>7attatgtgct gccatatcta ctt 23<210>8<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>8 acagtctcct gtacctggg19<210>9<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>9ccaatatgtc tgtttgtgct gc 22<210>10<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>10gtactaatat gactttatgc20<210>11<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>11gtgttctgct gtgtcttcta gt 22<210>12<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>12tatagagtct tccatacct19<210>13<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>13ccccacacca accccatata a 21<210>14
<211>20<212>DNA<213>人工序列 <400>14catgactttg tgtgccactg20<210>15<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>15cgttatgtgc ctctactgac c 21<210>16<211>16<212>DNA<213>人工序列<400>16ctacacagtc ccctcc16<210>17<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>17ctctacacaa aatcctgtg19<210>18<211>14<212>DNA<213>人工序列<400>18ctgctgcggt ttcc14<210>19<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>19tttatgtgct gaggttaaaa ag 22<210>20<211>19<212>DNA<213>人工序列
<400>20cgcaaccaca cagtctatg19<210>21<211>16<212>DNA<213>人工序列<400>21
acagcatcca cgcagg16<210>22<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>22cagaacagtt aagtaaatat gat 23<210>23<211>17<212>DNA<213>人工序列<400>23cactgaagta actaagg17<210>24<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>24ttctactact tcttctattc ctaa 24<210>25<211>16<212>DNA<213>人工序列<400>25taatgcagct aaaagc16<210>26<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>26tttgtctact actactgaat ca 22<210>27
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<211>33<212>DNA
<213>Human papillomavirus type 68<400>53gctgtaccaa atatttatga tcctaataaa ttt 33<210>54<211>29<212>DNA<213>Human papillomavirus type 70<400>54agccctacaa agtttaagga atatactag 29<210>55<211>27<212>DNA<213>Human papillomavirus type 73<400>55ctctactaca acgtatgcca actctaa27<210>56<211>24<212>DNA<213>Human papillomavirus mm<400>56tgcacaaaca tttactccag C 3.3.3.ZzI:<210>57<211>27<212>DNA<213>Human papillomavirus type 83<400>57gcctctaact ttaaggaata cctccgc27<210>58<211>26<212>DNA<213>Human papillomavirus CP8304<400>58gcagaataca aggcctctaa ctttaa2權(quán)利要求
一種HPV檢測(cè)及分型方法，其特征在于包括以下步驟(a)用HPV裂解液對(duì)生物樣品中的HPV進(jìn)行裂解，分離提取核酸；(b)用以下特異性引物從步驟(a)所得核酸中擴(kuò)增HPVL1核酸片段G15’-CARGGACAIAAYAATGGYATTTGCTG-3’(SEQ ID No.1)G25’-CARGGACATAAYAATGGYATTTGTTG-3’(SEQ ID No.2)G35’-GAAAAAYAAACTGYAAATCATAYTCCTC-3’(SEQ ID No.3)G45’-GAAAAAYAAACTGYAAATCATAYTCTTC-3’(SEQ ID No.4)其中G3/G4為生物素標(biāo)記引物；(c)對(duì)步驟(b)獲得的HPVL1核酸片段進(jìn)行焦磷酸測(cè)序反應(yīng)，焦磷酸測(cè)序引物選自以下任意一種或幾種HPV6s5’-AACTACATCTTCCACATACAC-3’(SEQ ID No.5)HPV11s5’-GTCTAAATCTGCTACATACAC-3’(SEQ ID No.6)HPV16s5’-ATTATGTGCTGCCATATCTACTT-3’(SEQ ID No.7)HPV18s5’-ACAGTCTCCTGTACCTGGG-3’(SEQ ID No.8)HPV31s5’-CCAATATGTCTGTTTGTGCTGC-3’(SEQ ID No.9)HPV33s5’-GTACTAATATGACTTTATGC-3’(SEQ ID No.10)HPV35s5’-GTGTTCTGCTGTGTCTTCTAGT-3’(SEQ ID No.11)HPV39s5’-TATAGAGTCTTCCATACCT-3’(SEQ ID No.12)HPV40s5’-CCCCACACCAACCCCATATAA-3’(SEQ ID No.13)HPV42s5’-CATGACTTTGTGTGCCACTG-3’(SEQ ID No.14)HPV43s5’-CGTTATGTGCCTCTACTGACC-3’(SEQ ID No.15)HPV44s5’-CTACACAGTCCCCTCC-3’(SEQ ID No.16)HPV45s5’-CTCTACACAAAATCCTGTG-3’(SEQ ID No.17)HPV51s5’-CTGCTGCGGTTTCC-3’(SEQ ID No.18)HPV52s5’-TTTATGTGCTGAGGTTAAAAAG-3’(SEQ ID No.19)HPV53s5’-CGCAACCACACAGTCTATG-3’(SEQ ID No.20)HPV54s5’-ACAGCATCCACGCAGG-3’(SEQ ID No.21)HPV56s5’-CAGAACAGTTAAGTAAATATGAT-3’(SEQ ID No.22)HPV58s5’-CACTGAAGTAACTAAGG-3’(SEQ ID No.23)HPV59s5’-TTCTACTACTTCTTCTATTCCTAA-3’(SEQ ID No.24)HPV66s5’-TAATGCAGCTAAAAGC-3’(SEQ ID No.25)HPV68as5’-TTTGTCTACTACTACTGAATCA-3’(SEQ ID No.26)HPV70s5’-AACGGCCATACCTGCTGTAIAT-3’(SEQ ID No.27)HPV73s5’-TAGGTACACAGGCTAGTAG-3’(SEQ ID No.28)HPV83s5’-GCTACACAGGCTAATGAAIACACA-3’(SEQ ID No.29)HPVmm4s5’-CACTGCTGTTACTCAATCTG-3’(SEQ ID No.30)HPVCP8304s5’-GCTACATCTGCTGCT-3’(SEQ ID No.31)(d)將焦磷酸測(cè)序讀出的序列與HPV型別序列進(jìn)行比對(duì)，判斷HPV分型結(jié)果。
2.如權(quán)利要求1所述的HPV分型方法，其特征在于步驟(a)中所述的HPV裂解液成分為20mmol/L Tris. HCL pH8. 0,0. 5% Triton-X-100,10% chelex-100。
3.如權(quán)利要求1所述的HPV分型方法，其特征在于步驟(d)所述的HPV型別序列包括HPV6 5' -CAATTCTGATTATAAAGAGTACATGCG-3’ (SEQ ID No. 32)HPV11 :5，-TAATTCAGATTATAAGGAATA-3’ (SEQ ID No. 33)HPV16 5' -CAGAAACTACATATAAAAATACTAACTT-3，(SEQ ID No. 34)HPV18 5' -CCTATGATGCTACCAAATTTAA-3’ (SEQ ID No. 35)HPV31 5' -AATTGCAAACAGTGATACTACATTT-3，(SEQ ID No. 36)HPV33 5' -ACACAAGTAACTAGTG-3’ (SEQ ID No. 37)HPV35 5' -GACAGTACATATAAAAA-3，(SEQ ID No. 38)HPV39 5' -TCTACATATGATCCTT-3，(SEQ ID No. 39)HPV40 5' -IAACAGTAATTTCAAGGAATATTTGCGT-3，(SEQ ID No. 40)HPV42 5' -CAACATCTGGTGATACATATACA-3' (SEQ ID No. 41)HPV43 5' -CTACTGTGCCCAGTACATATGACAA-3’ (SEQ ID No. 42)HPV44 5' -GTCTACALATACTAGTGAACAATATAA-3’ (SEQ ID No. 43)HPV45 5' -CCAAGTACATATGACCCTA-3，(SEQ ID No. 44)HPV51 5' -CCAACATTTACTCCAAGTAACTTTAAGCAAT-3，(SEQ ID No. 45)HPV52 5' -GAAAGCACATATAAAAATGAAAATTTTAA-3’ (SEQ ID No. 46)HPV53 5' -CAGTCTATGTCTAC-3’ (SEQ ID No. 47)HPV54 5' -AIAGCTATATCTG-3，(SEQ ID No. 48)HPV56 5' -GCACGAAAAATTAATCAGTACCTT-3，(SEQ ID No. 49)HPV58 5' -AAGGIACATATAAAAATGATAATTTTAAGG-3’ (SEQ ID No. 50)HPV59 5' -TGTATACACACCTACCAGTTTTAAA-3’ (SEQ ID No. 51)HPV66 5' -ACATTAACTAAATATGATGCCC-3，(SEQ ID No. 52)HPV68a :5’ -GCTGTACCAAATATTTATGATCCTAATAAATTT-3，(SEQ IDNo. 53)HPV70 5' -AGCCCTACAAAGTTTAAGGAATATACTAG-3’ (SEQ ID No. 54)HPV73 5' -CTCTACTACAACGTATGCCAACTCTAA-3，(SEQ ID No. 55)HPVmm4 5' -TGCACAAACATTTACTCCAGCAAA-3，(SEQ ID No. 56)HPV83 5' -GCCTCTAACTTTAAGGAATACCTCCGC-3，(SEQ ID No. 57)HPVCP8304 :5’ -GCAGAATACAAGGCCTCTAACTTTAA-3’ (SEQ ID No. 58)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種HPV檢測(cè)及分型方法，包括步驟用HPV裂解液對(duì)生物樣品中的HPV進(jìn)行裂解，分離提取核酸；用SEQ ID No.1～SEQ ID No.4特異性引物從上述步驟所得核酸中擴(kuò)增HPVL1核酸片段；對(duì)獲得的HPVL1核酸片段進(jìn)行焦磷酸測(cè)序反應(yīng)，焦磷酸測(cè)序引物選自SEQ ID No.5～SEQ ID No.31任意一種或幾種；將焦磷酸測(cè)序讀出的序列與HPV型別序列進(jìn)行比對(duì)，判斷HPV分型結(jié)果。本發(fā)明利用DNA條碼技術(shù)和焦磷酸測(cè)序技術(shù)，對(duì)生物樣本中的HPV進(jìn)行檢測(cè)、分型，可用于評(píng)估生殖道癌癥及相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展并對(duì)其進(jìn)行預(yù)后指導(dǎo)。本發(fā)明操作簡便、通量高、特異性好、靈敏度高、準(zhǔn)確性較高、檢測(cè)速度快、檢測(cè)成本低，具有廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12Q1/70GK101871014SQ20091015698
公開日2010年10月27日 申請(qǐng)日期2009年12月24日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月24日
發(fā)明者方國偉, 鄒媛, 郭興中, 郭堯 申請(qǐng)人:杭州艾迪康醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心有限公司