專利名稱：基于Taqman-ARMS技術(shù)檢測(cè)基因突變分型的方法和試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種基于Taqman-ARMS技術(shù)檢基因突變位分型的方法。
背景技術(shù)：
目前普遍應(yīng)用的基因突變檢測(cè)方法為限制小片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析法(RFLP法)和DNA直接測(cè)序等。RFLP法是將PCR與限制性酶切相結(jié)合的方法，但是該方法存在以下缺點(diǎn)RFLP實(shí)驗(yàn)操作繁瑣，檢測(cè)周期長(zhǎng)，成本高昂，存在第一輪酶切不完全導(dǎo)致的假陽(yáng)性，非閉管操作，易于污染，難以滿足臨床檢測(cè)要求。DNA直接測(cè)序?yàn)橥蛔儥z測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)。該方法存在以下缺點(diǎn)檢測(cè)周期較長(zhǎng)，花費(fèi)昂貴，非閉管操作，難以避免交叉污染，通量不高。DNA直接測(cè)序的靈敏度較低，雜合突變、膠壓縮、GC富集區(qū)的存在等問(wèn)題使得很難通過(guò)一次測(cè)序獲得精 確的數(shù)據(jù)，需要多次重復(fù)測(cè)序才可能避免假陽(yáng)性等，因此直接測(cè)序方法難適用于臨床檢測(cè)。因此，急需開(kāi)發(fā)一種快速、準(zhǔn)確、操作簡(jiǎn)便和避免交叉污染的基因突變檢測(cè)技術(shù)，滿足基因突變分型的時(shí)效性要求。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明的目的之一在于提供基于Taqman-ARMS技術(shù)檢測(cè)基因突變分型的方法，解決了現(xiàn)有技術(shù)中進(jìn)行基因突變分型程序繁瑣、費(fèi)用昂貴、費(fèi)時(shí)、易污染和靈敏度低等問(wèn)題。為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，技術(shù)方案為
基于Taqman-ARMS技術(shù)檢測(cè)基因突變分型的方法，包括以下步驟
(1)根據(jù)目的基因的突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)ARMS引物，所述ARMS引物的上游引物或下游引物的3’末端為突變位點(diǎn)，并將位于突變位點(diǎn)上游第1-3位核苷酸中的任一位錯(cuò)義突變；
(2)根據(jù)所述突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)Taqman-MGB探針,所述Taqman-MGB探針特異識(shí)別ARMS引物的擴(kuò)增產(chǎn)物正義鏈突變位點(diǎn)的Taqman探針,所述探針的3’端結(jié)合有小溝結(jié)合分子；
(3)提取模版DNA，利用步驟(I)所得引物對(duì)和步驟(2)所得探針對(duì)模板DNA進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)。優(yōu)選的，將所述突變位點(diǎn)上游第I位核苷酸中的錯(cuò)義突變。優(yōu)選的，所述步驟(I)中，所述突變位點(diǎn)為EGFR基因2573位錯(cuò)義突變，所述ARMS引物為SEQ ID No 3和SEQ ID No 5所示的核苷酸序列。優(yōu)選的,所述步驟(2)中，所述Taqman-MGB探針為SEQ ID No :9所示的核苷酸序列。本發(fā)明目的之二在于提供上述檢測(cè)方法使用的試劑盒，其使用方便，靈敏度高，技術(shù)方案為
所述試劑盒包括檢測(cè)目的基因的突變位點(diǎn)的ARMS引物和Taqman-MGB探針，所述ARMS引物的上游引物或下游引物的3’末端為突變位點(diǎn)，并將位于突變位點(diǎn)上游第1-3位核苷酸中的任一位錯(cuò)義突變；
所述Taqman-MGB探針為特異識(shí)別ARMS引物的擴(kuò)增產(chǎn)物正義鏈突變位點(diǎn)的Taqman探針，所述探針的3’端結(jié)合有小溝結(jié)合分子。優(yōu)選的，所述ARMS弓丨物為SEQ ID No 3和SEQ ID No 5所示的核苷酸序列。優(yōu)選的，所述Taqman-MGB探針為SEQ ID No 9所示的核苷酸序列。優(yōu)選的，所述試劑盒由PCR緩沖液、dNTPs、引物對(duì)、Taqman-MGB探針、MgCl2、
TaqDNA聚合酶和模板DNA組成，各組分反應(yīng)時(shí)終濃度為
權(quán)利要求
1.基于Taqman-ARMS技術(shù)檢測(cè)基因突變分型的方法，其特征在于，包括以下步驟 (1)根據(jù)目的基因的突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)ARMS引物，所述ARMS引物的上游引物或下游引物的3’末端為突變位點(diǎn)，并將位于突變位點(diǎn)上游第1-3位核苷酸中的任一位錯(cuò)義突變； (2)根據(jù)所述突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)Taqman-MGB探針,所述Taqman-MGB探針特異識(shí)別ARMS引物的擴(kuò)增產(chǎn)物正義鏈突變位點(diǎn)的Taqman探針,所述探針的3’端結(jié)合有小溝結(jié)合分子； (3)提取模版DNA，利用步驟(I)所得引物對(duì)和步驟(2)所得探針對(duì)模板DNA進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述基于Taqman-ARMS技術(shù)檢測(cè)基因突變分型的方法，其特征在于將所述突變位點(diǎn)上游第I位核苷酸中的錯(cuò)義突變。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述基于Taqman-ARMS技術(shù)檢測(cè)基因突變分型的方法，其特征在于所述步驟(I)中，所述突變位點(diǎn)為EGFR基因2573位錯(cuò)義突變，所述ARMS引物為SEQ ID No:3和SEQ ID No 5所示的核苷酸序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述基于Taqman-ARMS技術(shù)檢測(cè)基因突變分型的方法，其特征在于所述步驟(2)中，所述Taqman-MGB探針為SEQ ID No 9所示的核苷酸序列。
5.權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述方法使用的試劑盒，其特征在于所述試劑盒包括檢測(cè)目的基因的突變位點(diǎn)的ARMS引物和Taqman-MGB探針，所述ARMS引物的上游引物或下游引物的3’末端為突變位點(diǎn)，并將位于突變位點(diǎn)上游第1-3位核苷酸中的任一位錯(cuò)義突變； 所述Taqman-MGB探針為特異識(shí)別ARMS引物的擴(kuò)增產(chǎn)物正義鏈突變位點(diǎn)的Taqman探針，所述探針的3’端結(jié)合有小溝結(jié)合分子。
6.根據(jù)權(quán)利權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于所述ARMS引物為SEQID No:3和SEQ ID No :5所示的核苷酸序列。
7.根據(jù)權(quán)利權(quán)利要求6所述的試劑盒,其特征在于所述Taqman-MGB探針的核苷酸序列如SEQ ID No 9所示。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒由PCR緩沖液、dNTPs、引物對(duì)、Taqman-MGB探針、MgCl2、TaqDNA聚合酶和模板DNA組成，各組分反應(yīng)時(shí)終濃度為 PCR緩沖液終濃度0. 5 2. 5 X ; dNTPs0. I 0. 75mM ； 弓I物對(duì)上、下游引物終濃度分別為150 350nM ； 模板 DNA0. 01 10ng/ii L ; TaqDNA 聚合酶0. 01 I. OU/ ii L ; MgCl2終濃度為I. 5 3. 5mM ; Taqman-MGB探針終濃度為50 200nM。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的試劑盒，其特征在于所述PCR緩沖液、dNTPs、引物對(duì)、Taqman-MGB探針、MgCl2、TaqDNA聚合酶和模板DNA終濃度組成為 PCR緩沖液終濃度I X ； dNTPs0.25mM ； 引物對(duì)上、下游引物終濃度分別為250nM ； 模板 DNA0. 05 I. 5ng/ u L ； TaqDNA 聚合酶0. 01 I. OU/ ii L ;MgCl2終濃度為2. O 2. 5mM ;Taqman-MGB探針終濃度為50nM?！?br> 全文摘要
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，公開(kāi)了基于Taqman-ARMS技術(shù)檢測(cè)基因突變分型的方法；該方法結(jié)合了ARMS突變富集和Taqman-MGB特異性熒光檢測(cè)兩種技術(shù)，利用ARMS引物對(duì)突變靶序列進(jìn)行特異性PCR擴(kuò)增，Taqman-MGB探針對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行特異性位點(diǎn)檢測(cè)，在Real-timePCR基礎(chǔ)上鑒定特定突變，此種方法與直接測(cè)序、芯片檢測(cè)等突變檢測(cè)技術(shù)比較，本發(fā)明用于檢測(cè)基因突變具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡(jiǎn)單快速、通量高等優(yōu)勢(shì)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102776291SQ201210291849
公開(kāi)日2012年11月14日 申請(qǐng)日期2012年8月16日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月16日
發(fā)明者王弢, 秦勇 申請(qǐng)人:蘇州工業(yè)園區(qū)為真生物醫(yī)藥科技有限公司