斷腸草鑒別的引物及pcr方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，涉及中藥及中藥材鑒定領(lǐng)域，特別涉及一種能 夠特異鑒定斷腸草的PCR擴增方法及其特異引物。
【背景技術(shù)】
[0002] 斷腸草為馬前科植物鉤吻Gelsemium elegans (Gar化.el Qiamp) Benth.的莖藤。 又名胡蔓藤、野葛、水莽草、大茶葉、爛腸草，是一種劇毒草藥。有巧風(fēng)攻毒、消腫、止痛之功 效?？芍螡裾?、痛腫、風(fēng)濕瘍痛等。
[0003] 近年來由于誤服斷腸草而中毒的事故在各地不斷發(fā)生，對其也進行了許多研究， 證實斷腸草的根、莖、葉子的主要成分為鉤吻素子、鉤吻素寅、鉤吻素卯等。調(diào)查發(fā)現(xiàn)誤將斷 腸草為金銀花煮水當(dāng)涼茶喝而中毒的事件時有發(fā)生，在斷腸草中毒的78例臨床事件中，發(fā) 現(xiàn)43例為因誤將斷腸草為金銀花煮水當(dāng)涼茶喝而中毒，18例為將斷腸草根為其他草藥煮 水喝而中毒（李文升.急性斷腸草中毒78例臨床分析，醫(yī)學(xué)信息，2011,24巧）；5872)。因 此，建立一種用于鑒別鉤吻和金銀花的方法非常重要。
[0004] 黃偉雄等采用色譜的方法通過分析鉤吻堿成分對斷腸草中進行鑒定（黃偉雄， 李化生，范山湖，等.應(yīng)用TLC法鑒定斷腸草中鉤吻堿，華南預(yù)防醫(yī)學(xué)，2008,34(1) ;60)， 但該種方法比較繁瑣，不利于推廣。近年來發(fā)展的W分子生物學(xué)為基礎(chǔ)的檢測方法如DNA barcoding和位點特異性PCR等克服了藥材傳統(tǒng)鑒別方法準(zhǔn)確度不高、主觀性大等缺點。對 斷腸草與金銀花之間的分子鑒別還尚未見報道，本發(fā)明通過特異性PCR的方法實現(xiàn)了斷腸 草與金銀花的快速、準(zhǔn)確鑒別。在本發(fā)明被公布之前，尚未有任何公開或報道過本專利申請 中所提及的PCR方法及引物。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種斷腸草的PCR引物及其鑒定方法，該PCR鑒定方法操作 簡單、樣品量少，能快速、準(zhǔn)確的將斷腸草從其易混淆的金銀花樣品中鑒定出來，為斷腸草 鑒定提供了一種實用的技術(shù)。
[0006] 1、一種鑒定斷腸草的特異引物F1、巧，其序列為：
[0007] F1 ; 5，-TCTCCGCCCTCTGCTCTA-3，，
[0008] F2 ; 5，-GGAAGAAAGGAGTTTTTATGAGG-3，。
[0009] 2、一種斷腸草的PCR鑒定方法，其特征在于，包括下列步驟：
[0010] a)從所述材料中提取到DNA樣品；
[0011] b)用權(quán)利要求1所述的引物進行PCR反應(yīng)，擴增反應(yīng)體系包括；10 Xbuffer緩沖 液 2 y L，dNTPl. 6 y L，引物各 0. 5 y L，EX Tap 酶 0. 2 y L，DNA0. 5 y L，滅菌蒸觸水 14. 7 y L。 反應(yīng)條件：解鏈溫度95°C，時間5min，退火溫度57°C，時間30s，復(fù)性溫度72°C，時間為 lmin40s，35個循環(huán)后72°C延伸，時間為7min ;
[0012] C)電泳所述擴增產(chǎn)物，如果存在分子量約為3(K)bp的單一條帶，則確定所檢材料 為斷腸草。
【附圖說明】
[001引圖1 ;斷腸草、金銀花、山銀花及水銀花PCR鑒別結(jié)果
[0014] 1.斷腸草（廣西）；2.斷腸草（貴州、安徽藥市）；3.空白對照；4.金銀花（河 南）點金銀花（廣西）；6.金銀花（江蘇）；7.金銀花（北京）；8.山銀花（廣西）；9.山 銀花（云南）；1〇.山銀花（貴州）；11.水銀花（貴州）；M.DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；從上至下依次 為 2000bp、lOOObp、750bp、500bp、250bp、lOObp
【具體實施方式】
[00巧]1材料
[0016] 所用材料如表1所示，包括：
[0017] 表1樣品來源表
[0018]
【主權(quán)項】
1. 一種鑒定斷腸草的特異引物F1、F2,其序列為：Fl :5'-TCTCCGCCCTCTGCTCTA-3'，F(xiàn)2 : 5'-GGAAGAAAGGAGTTTTTATGAGG-3'。
2. -種斷腸草的PCR鑒定方法，其特征在于，包括下列步驟： a) 從所述材料中提取到DNA樣品； b) 用權(quán)利要求1所述的引物進行PCR反應(yīng)，擴增反應(yīng)體系包括：10Xbuffer緩沖液 2μ L，dNTPl. 6μ L，引物各 0· 5μ L，EX Tap 酶 0· 2μ L，DNAO. 5μ L，滅菌蒸餾水 14. 7μ L ;反應(yīng) 條件：解鏈溫度95°C，時間5min，退火溫度57°C，時間30s，復(fù)性溫度72°C，時間為lmin40s， 35個循環(huán)后72°C延伸，時間為7min ; c) 電泳所述擴增產(chǎn)物，如果存在分子量約為300bp的單一條帶，則確定所檢材料為斷 腸草。
【專利摘要】本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，涉及中藥及中藥材鑒定領(lǐng)域，特別涉及一種能夠特異鑒定斷腸草的PCR擴增方法及其特異引物。使用此方法鑒別斷腸草與金銀花，只通過簡單的DNA提取、PCR特異性擴增、電泳檢測即可完成對樣品的鑒別。具有操作簡單、特異性強、重復(fù)性好等優(yōu)點。主要用于斷腸草與金銀花之間的快速鑒定。
【IPC分類】C12Q1-68, C12N15-11
【公開號】CN104630326
【申請?zhí)枴緾N201310548155
【發(fā)明人】黃璐琦, 袁媛, 李旻輝, 崔占虎, 蔣超
【申請人】中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所
【公開日】2015年5月20日
【申請日】2013年11月8日