專利名稱：一種用于檢測基因變異的pcr引物設(shè)計方法及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因變異的檢測方法及試劑盒領(lǐng)域，特別涉及一種用于檢測基因變異的PCR引物設(shè)計方法及試劑盒。
背景技術(shù)：
基因變異在生物體中時刻發(fā)生，有的變異是無意的，它不影響生物體正常生長，但是，總有一些變異后果非常嚴重，給人類的生存帶來挑戰(zhàn)?？茖W(xué)工作者發(fā)明了許多檢測基因變異的方法，具體包括PCR-限制性酶切分析、PCR-SSCP分析、PCR-測序分析、PCR-基因芯片分析、PCR-LDR、連接酶反應(yīng)LDR、PCR-HRM分析、ARMS-PCR等。其中最為常用方法為PCR-限制性酶切分析、PCR-測序分析、PCR-基因芯片分析、PCR-HRM分析、ARMS-PCR。PCR-限制性酶切分析是針對位點明確、且突變型與野生型在序列上至少存在一種酶切位點差異。PCR完成后，用該酶進行酶切后，測序鑒定。耗時、·繁瑣，但靈敏度高。對于有些樣品由于野生型和突變型之間無差異酶切位點，導(dǎo)致該方法不可用。PCR-測序分析是突變檢測的金標準方法，可發(fā)現(xiàn)未知變異位點。實驗周期久、靈敏度低(10%左右)。PCR-基因芯片分析是針對大量已知突變位點的有效方法，但是其靈敏度僅能做到59TlO%，且成本較高。PCR-HRM分析成本低、通量大，由于不能自動化分析結(jié)果，需實驗人員判讀，僅在科研中有所應(yīng)用。ARMS-PCR是目前開發(fā)基因變異最為常用技術(shù)，系統(tǒng)中包含通用引物和變異區(qū)域特異引物(以后簡稱“變異引物”)。通用引物可與野生型和突變型同時結(jié)合、變異引物與基因變異區(qū)域完全互補，與野生型僅在3端有I飛個堿基的差異，因此基因變異的檢測完全依賴于變異引物的設(shè)計好壞決定試劑盒的靈敏度和特異性(見圖I)。由于變異引物與野生型模板僅有廣3個堿基不互補，也存在一定幾率結(jié)合而發(fā)生錯誤弓I導(dǎo)的PCR合成，這種結(jié)合的概率很高，約為O. 19Tl%。一旦發(fā)生此類反應(yīng)，則結(jié)果和試劑盒的可靠性大大下降。影響此類反應(yīng)的因素主要是核酸提取殘留鹽離子、模板濃度過高兩個，這兩個因素在實際應(yīng)用中不是可控因素，因此無法在研究測試初期通過優(yōu)化反應(yīng)條件來降低。歐洲D(zhuǎn)xS基于ARMS-PCR/Scorpion系統(tǒng)開發(fā)的K_ras試劑已獲得CE認證，并在SFDA提出注冊申請。因此基于ARMS-PCR開發(fā)新的分子診斷試劑盒是一個較為可靠的方法。由于基因變異，面對復(fù)雜的基因變異，傳統(tǒng)的分子診斷方法顯得很無力，這是因為在此類基因變異樣品中，含有大量的野生型背景，從而為鑒別這些重要基因是否發(fā)生后果嚴重的變異帶來巨大麻煩。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種用于檢測基因變異的PCR引物設(shè)計方法及試劑盒，該方法易于設(shè)計、可控，該試劑盒靈敏度高、重復(fù)性好，穩(wěn)定可靠。本發(fā)明的一種用于檢測基因變異的PCR引物設(shè)計方法，包括在基因高度(基因序列相似性大于80%)同源和保守的區(qū)域設(shè)計正向PCR通用引物，所述正向PCR通用引物的5’端附加一段與基因變異區(qū)域野生型完全互補6 20個堿基的寡核苷酸；在變異基因的位置設(shè)計與變異基因完全互補的反向引物。所述的寡核苷酸與基因變異區(qū)域野生型完全互補的堿基數(shù)為8 15個。所述的寡核苷酸的退火溫度在37飛5°C之間。將所述的PCR引物設(shè)計方法與實時熒光PCR、PCR-ELISA, PCR-反向分子雜交或PCR-基因芯片技術(shù)聯(lián)合使用。一種用于檢測基因變異的試劑盒，包括dNTPs、Mg2+、Taq DNA聚合酶、Tris-KCl體系、引物和探針；所述的引物包括正向引物和反向引物；所述的正向引物包括正向PCR通用 引物和附加于通用引物的5’端的一段與基因變異區(qū)域野生型完全互補6 20個堿基的寡核苷酸；所述的反向引物設(shè)計在變異基因的位置，且與變異基因完全互補。所述的Taq DNA聚合酶的用量為O. 5 IU/測試；Mg2+的濃度為O. 5 I. 5mM ;所述的Tris-KCl體系中KCl濃度為3(T50mM，甘油的質(zhì)量濃度為10% ;引物和探針的用量為各IOP/測試。對于野生型的擴增，本發(fā)明中所述正向通用引物附加寡核苷酸優(yōu)于反向引物與野生型模板結(jié)合而阻止野生型擴增；對于突變型的擴增，由于所述正向通用引物附加寡核苷酸與之不完全配對，因此反向引物可以結(jié)合到突變基因模板上進行擴增。根據(jù)本發(fā)明的基因變異檢測PCR引物設(shè)計方法，通用引物可以引導(dǎo)一個DNA鏈合成，當此次合成DNA鏈時野生型時，“變性一退火”后，可發(fā)生自身引導(dǎo)合成的DNA鏈內(nèi)折疊，阻礙變異引物與野生型模板結(jié)合，稱之為阻遏ARMS-PCR系統(tǒng)。在此阻遏ARMS-PCR系統(tǒng)中，通用引物的5端附加一段與變異引物高度同源、但與變異基因的野生型完全互補的寡核苷酸序列(見圖2)，該序列在分子內(nèi)優(yōu)先與變異基因的野生型結(jié)合，從而抑制或阻礙了變異引物與野生型結(jié)合的幾率(見圖3)，解決了變異引物特異性問題，從而極大的提高了變異引物的靈敏度。具體而言,如圖2所不,本發(fā)明的通用引物分為A、B兩部分，B部分為正常的PCR引物，A部分為與變異引物C相互競爭結(jié)合位點的寡核苷酸序列。通用引物B段與野生型模板D段和突變型模板F段完全互補，是PCR合成的一個引導(dǎo)鏈；變異引物C與突變型模板G’完全互補，是PCR合成的另一個引導(dǎo)鏈。H與H’區(qū)是設(shè)計熒光探針和雜交探針的位置；E和E’是野生型發(fā)生基因變異的位置。G和G’是E和E’發(fā)生基因變異的新序列。在適當?shù)臈l件下，A部分與野生型E’結(jié)合效率高于變異引物C ;變異引物C更易于G’結(jié)合。特別是，反應(yīng)完成第I個循環(huán)后(如圖3所示)，通用引物合成的野生型DNA鏈在“變性一退火”過程中，會自動形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)，從而屏蔽掉變異引物的結(jié)合位點。此類分子內(nèi)折疊的效率通常比分子間結(jié)合效率高10倍以上，因此能取得較好的屏蔽效果。本發(fā)明公開的引物設(shè)計方法中引物設(shè)計參照通用的引物設(shè)計原則不允許引物間或/和引物內(nèi)3’端出現(xiàn)5個以上堿基互補；變異引物的長度在15bp 25bp之間，退火溫度(用軟件Primer Express 3· O計算)在42 60°C之間；優(yōu)選變異引物的長度在16bp 22bp之間，退火溫度(用軟件Primer Express 3. O計算)在48、2°C之間；通用引物B區(qū)的長度在15bp 25bp之間，退火溫度(用軟件Primer Express 3. O計算)在42 60°C之間；優(yōu)選通用引物B區(qū)的長度在16bp 20bp之間,退火溫度(用軟件Primer Express 3. O計算)在48 52°C之間；通用引物A區(qū)的長度在6 20bp之間,退火溫度(用軟件Primer Express 3. O計算)在37 55°C之間；可能發(fā)生變異的區(qū)域設(shè)計在通用引物A區(qū)的較中間的位置。本發(fā)明的基因變異的PCR弓丨物設(shè)計方法，其特點是在ARMS-PCR弓丨物設(shè)計中，在通用引物中附加一段與基因變異區(qū)域的野生型完全互補序列，該序列在PCR退火時，會優(yōu)于針對變異基因設(shè)計的變異基因檢測引物退火到野生型上，阻礙了變異引物與野生型基因的
彡口口 依據(jù)本發(fā)明的引物設(shè)計方法設(shè)計的引物，可用于實時熒光PCR、PCR_ELISA、PCR-反向分子雜交、PCR-基因芯片分析等實驗中。與其他方法聯(lián)用，可開發(fā)多種基因變異檢測試劑盒。根據(jù)上述方法，本發(fā)明可以與實時熒光PCR技術(shù)設(shè)計各種用于基因變異檢測PCR試劑盒，其中包括dNTPs、二價陽離子、耐熱DNA聚合酶、緩沖體系、引物、探針等常規(guī)試劑，其中耐熱DNA聚合酶使用量為O. 5 IU/測試、二價陽離子濃度在O. 5^1. 5mM、KCl濃度為 3(T50mM、引物和探針各IOP/測試、10%甘油。PCR循環(huán)參數(shù)中退火溫度要高于變異引物Tm值1(T15°C，保證變異引物的嚴謹性和封閉的效果。根據(jù)本發(fā)明提供的PCR引物設(shè)計方法，在大量野生型基因存在的情況下，可選擇性擴增變異基因的目的片段，從而實現(xiàn)變異基因的檢測。該方法解決了傳統(tǒng)測序方法靈敏度高不足、基因芯片方法非特異性雜交的問題，大大提高了變異基因的檢測靈敏度。本發(fā)明旨在大量野生型背景下，提供變異基因檢測引物的設(shè)計方法和試劑盒，在ARMS-PCR基礎(chǔ)上開發(fā)新一代檢測方法，與ARMS-PCR/Scorpion系統(tǒng)比較，本發(fā)明的優(yōu)點具體為I.野生型背景是突變型1000倍以上，仍然可以檢出突變型；2.本方法可與實時熒光PCR、PCR-ELISA、PCR_反向分子雜交、PCR-基因芯片分析等技術(shù)聯(lián)合，用于變異基因的檢測領(lǐng)域。有益效果(I)本發(fā)明的一種用于基因變異的PCR引物設(shè)計方法，其特點是易于設(shè)計、可控且擴增靈敏度高；(2)本發(fā)明得到的基因變異檢測試劑盒與傳統(tǒng)測序檢測基因變異比較，具有靈敏度高(100倍以上)、特異性強、時間短(3小時內(nèi)完成檢測)、操作步驟少的優(yōu)點。


圖I是通用ARMS-PCR工作原理；圖2是本發(fā)明中阻遏ARMS-PCR中弓丨物設(shè)計原理；圖3是阻遏ARMS-PCR工作原理；圖4為實施例I的擴增曲線；圖5為實施例I的擴增曲線；圖6為實施例I的擴增曲線；圖7為實施例I的擴增曲線；圖8為實施例I的擴增曲線；圖9為實施例2的擴增曲線。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實施例I一種鑒定K-ras密碼子12/13突變情況的方法
I.提取腫瘤患者組織基因組DNA ；2.進行PCR擴增，20 μ I PCR反應(yīng)體系如下待測腫瘤組織基因組DNA 5(Tl00ng，Taq 酶(5U/μ 1)0. 125 μ 1，上下游引物和探針(10 μ Μ)各 1μ I (引物 Krasl2-1A_F 5’ -TGTGGTAGTTGGAGCTA-3’、Krasl2_lT_F :5’ -TGTGGTAGTTGGAGCTT-3’、Krasl2_2A_F 5’ -GTGGTAGTTGGAGCTGA-3’、Krasl2_2T_F :5’ -GTGGTAGTTGGAGCTGT-3’、Krasl3_2A_F 5’-GTAGTTGGAGCTGGTGA-3’ 、Krasl213_R5，-AGCTGGTGGCGTATATTCGTCCACAAAATGATTC-3，，探針 Krasl213_P :5，-FAM-AAGAGTGCCTTGACGATACAGC-BHQ1-3’)，dNTP (2. 5mM) 2 μ 1，10XPCR 緩沖液(含 Mg2+) I. 5 μ 1，甘油10%，余下為無菌蒸餾水；PCR反應(yīng)條件為95°C變性5min，隨后95°C變性10sec，58°C退火延伸35sec，進行45個循環(huán)，最后37°C延伸Imin ;在58°C進行熒光信號收集。3. PCR結(jié)果分析(附圖4-8)a. CT〈40，判定為陽性(+ )；b. CT>40，判定為陰性(_)；實施例2一種鑒定K-ras密碼子61突變情況的方法I.提取腫瘤患者組織基因組DNA ;2.進行PCR擴增，20 μ I PCR反應(yīng)體系如下待測腫瘤組織基因組DNA 5(Tl00ng，Taq 酶(5υ/μ 1)0. 125μ 1，上下游引物和探針(10μΜ)各 1μ I (引物 Kras61_F 5’ -TTCTCGACACAGCAGGTCT-3’、Kras61-R :5’ -AGCAGGTCAAGAGGACCCACCTATAATGGAGAATATC-3’，探針 Kras61-P :5’ -FAM-CAGTGCAATGAGGGACCAGTAC-BHQI-3' )，dNTP (2. 5mM) 2 μ 1，10 XPCR緩沖液(含Mg2+) I. 5 μ 1，甘油10%，余下為無菌蒸餾水；PCR反應(yīng)條件為95°C變性5min，隨后95°C變性lOsec，58°C退火延伸35sec，進行45個循環(huán)，最后37°C延伸Imin ;在58°C進行熒光信號收集。3. PCR結(jié)果分析(附圖9)c. CT〈40，判定為陽性(+ )；d. CT>40，判定為陰性(_)。
權(quán)利要求
1.一種用于檢測基因變異的PCR引物設(shè)計方法，包括在基因同源和保守的區(qū)域設(shè)計正向PCR通用引物，所述正向PCR通用引物的5’端附加一段與基因變異區(qū)域野生型完全互補6 20個堿基的寡核苷酸；在變異基因的位置設(shè)計與變異基因完全互補的反向引物。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種用于檢測基因變異的PCR引物設(shè)計方法，其特征在于所述的寡核苷酸與基因變異區(qū)域野生型完全互補的堿基數(shù)為8 15個。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種用于檢測基因變異的PCR引物設(shè)計方法，其特征在于所述的寡核苷酸的退火溫度在37飛5°C之間。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種用于檢測基因變異的PCR引物設(shè)計方法，其特征在于將所述的PCR引物設(shè)計方法與實時熒光PCR、PCR-ELISA、PCR-反向分子雜交或PCR-基因芯片技術(shù)聯(lián)合使用。
5.一種用于檢測基因變異的試劑盒，包括dNTPs、Mg2+、Taq DNA聚合酶、Tris-KCl體系、引物和探針；所述的引物包括正向引物和反向引物，其特征在于所述的正向引物包括正向PCR通用引物和附加于通用引物的5’端的一段與基因變異區(qū)域野生型完全互補6 20個堿基的寡核苷酸；所述的反向引物設(shè)計在變異基因的位置，且與變異基因完全互補。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種用于檢測基因變異的試劑盒，其特征在于所述的TaqDNA聚合酶的用量為O. 5 IU/測試。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種用于檢測基因變異的試劑盒，其特征在于所述的Mg2+的濃度為O. 5^1. 5mM。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種用于檢測基因變異的試劑盒，其特征在于所述的Tris-KCl體系中KCl濃度為3(T50mM，甘油的質(zhì)量濃度為10%。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種用于檢測基因變異的試劑盒，其特征在于所述的引物和探針的用量為各IOP/測試。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于檢測基因變異的PCR引物設(shè)計方法及試劑盒，該引物設(shè)計方法包括在基因同源和保守的區(qū)域設(shè)計正向PCR通用引物，所述正向PCR通用引物的5’端附加一段與基因變異區(qū)域野生型完全互補6~20個堿基的寡核苷酸；在變異基因的位置設(shè)計與變異基因完全互補的反向引物；所述的試劑盒，包括dNTPs、Mg2+、Taq DNA聚合酶、Tris-KCl體系、引物和探針。本發(fā)明的引物設(shè)計方法易于設(shè)計、可控且擴增靈敏度高；本發(fā)明的試劑盒靈敏度高、特異性強、時間短、使用操作步驟少。
文檔編號C12Q1/68GK102912031SQ201210448690
公開日2013年2月6日 申請日期2012年11月9日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月9日
發(fā)明者樓敬偉, 李丙亮, 謝彩霞 申請人:上海寶藤生物醫(yī)藥科技有限公司