一種用于血清/血漿miRNA實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)的內(nèi)參的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種用于血清/血漿miRNA實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)的內(nèi)參，具體涉及一種 用于血清/血漿miRNA實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)的內(nèi)參miR-30e/a，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 長(zhǎng)度在21-23bp的單鏈miRNA分子，能夠以部分互補(bǔ)的方式革E1向結(jié)合于mRNA非翻 譯區(qū)，引導(dǎo)其降解或是抑制mRNA的翻譯，使靶基因發(fā)生轉(zhuǎn)錄后沉默。miRNA在眾多的生理和 病理進(jìn)程中均扮演重要調(diào)控作用，幾乎參與人類所有惡性腫瘤的病理過(guò)程。目前已證實(shí)，血 液中的miRNA在多種惡性腫瘤的診斷、治療及預(yù)后的評(píng)估中都有潛在的應(yīng)用價(jià)值，催生了 基于檢測(cè)miRNA種類及含量來(lái)對(duì)腫瘤進(jìn)行診斷和評(píng)估的新方式。一旦體液中的特定miRNAs 表達(dá)特征被廣泛接受，那么這種檢測(cè)miRNA的方法就為臨床提供了一種非侵入或是最低侵 入式的疾病相關(guān)生物標(biāo)記的檢測(cè)方式。并且血清學(xué)檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)一旦建立，即如同生化學(xué)檢 測(cè)那樣具備普遍性、強(qiáng)制性和客觀性的特點(diǎn)，會(huì)在最大限度上排除主觀因素的干擾，進(jìn)而提 高診斷效率。然而，同一miRNA表達(dá)特征在不同的研究中差異很大，這不僅表現(xiàn)在血漿和尿 液這樣不同來(lái)源的體液樣本中，而且表現(xiàn)在同樣以血液為研究樣本的不同研究中。例如，很 多報(bào)道中均顯示前列腺癌患者血清和血漿中miR-141的表達(dá)水平增高。但是也有少量報(bào)道 顯示同一 miRNA在患者血清中的表達(dá)降低，甚至無(wú)法檢出。還有報(bào)道指出該miRNA在前列 腺癌、膀胱癌和腎癌患者血清中的含量沒(méi)有差別。再如miR-16在前列腺癌組織中呈現(xiàn)低表 達(dá)狀態(tài)，但是在血清中卻無(wú)法鑒別患者和正常對(duì)照人群。出現(xiàn)以上相互矛盾的結(jié)果的原因， 固然有樣本來(lái)源、樣本處理等等方面的因素，但更重要的是不同的研究及商品化的試劑盒 應(yīng)用不同的定量參考體系所致。
[0003] 在鑒定和驗(yàn)證疾病相關(guān)的miRNA時(shí)，通常會(huì)使用兩種方法，一種是首先通過(guò)微陣 列或者下一代DNA測(cè)序技術(shù)確定候選的生物標(biāo)記，然后使用實(shí)時(shí)定量PCR的方法繼續(xù)鑒定 以確定該生物標(biāo)記的可靠性。在此過(guò)程中，標(biāo)準(zhǔn)化占有極為重要的地位，因?yàn)槠湟?，正確的 標(biāo)準(zhǔn)化可以移除系統(tǒng)性偏倚和實(shí)驗(yàn)性變異，其二，準(zhǔn)確的標(biāo)準(zhǔn)化能夠確保對(duì)不同樣本之間 生物性差異的檢測(cè)。對(duì)于評(píng)價(jià)miRNA在體外、體內(nèi)甚至是臨床試驗(yàn)過(guò)程中的治療性作用，標(biāo) 準(zhǔn)化尤其重要。有偏倚的標(biāo)準(zhǔn)化會(huì)使本來(lái)有意義的結(jié)果被誤讀，進(jìn)而出現(xiàn)錯(cuò)誤的結(jié)論。目 前，多種多樣的miRNA定量標(biāo)準(zhǔn)嚴(yán)重制約了各個(gè)研究結(jié)果橫向可比性。
[0004] 在微陣列的過(guò)程中，標(biāo)準(zhǔn)化通常會(huì)采用loess方法，該法假設(shè)過(guò)表達(dá)的miRNA種 類和絕對(duì)量與低表達(dá)的相同。而在下一代DNA測(cè)序過(guò)程中，標(biāo)準(zhǔn)化的方法假設(shè)不同樣本中 特定miRNA在總miRNA中的含量一致，因而特定miRNA相對(duì)表達(dá)量一般采用該miRNA的拷 貝值與文庫(kù)總的拷貝數(shù)進(jìn)行比較而得出。這種總體均數(shù)的方法及其他多標(biāo)準(zhǔn)合并應(yīng)用的模 式并不適用于較小規(guī)模的研究，尤其不適用于臨床的應(yīng)用性檢測(cè)，因?yàn)橐詥蝹€(gè)樣本或少量 基因?yàn)閷?duì)象的miRNA定量過(guò)程中，如果僅僅為了標(biāo)準(zhǔn)化而無(wú)奈選擇微陣列或下一代DNA測(cè) 序，這會(huì)造成嚴(yán)重的資源浪費(fèi)。所以，在科研和臨床實(shí)踐中，在實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)仍然是目 前miRNA定量研究和應(yīng)用的主流手段的背景下，一個(gè)合適的定量參考會(huì)極大促進(jìn)miRNA含 量檢測(cè)從科研到臨床應(yīng)用的適用性。目前，一個(gè)被廣為接受的miRNA特異的定量標(biāo)準(zhǔn)仍然 處在爭(zhēng)論中。爭(zhēng)論的焦點(diǎn)集中在現(xiàn)有參考標(biāo)準(zhǔn)的合理性和表達(dá)的穩(wěn)定性方面。
[0005] 目前以組織樣本為對(duì)象的miRNA定量研究多采用核糖體RNA (5S rRNA)和核仁小 RNA(small nucleolar RNA)如 RNU6，RNU43，RNU44,和 RNU48。另外，RNU43 可以單獨(dú)用來(lái) 作為參考標(biāo)準(zhǔn)，也可以同RNU1-4合并應(yīng)用作為定量參考，合并時(shí)可以增加其穩(wěn)定性。但是， 以上這些定量標(biāo)準(zhǔn)存在明顯的合理性問(wèn)題。核糖體RNA及小核仁RNA的功能與miRNA存在 明顯不同。三者并不屬于同一類型的RNA。不僅如此，核仁小RNA的長(zhǎng)度處于60-300nt之 間，與miRNA的19-23nt明顯不同，這種分子量上的差異可能會(huì)導(dǎo)致核仁小RNA對(duì)提取過(guò)程 和酶促化學(xué)反應(yīng)的反應(yīng)性不同于miRNA。另外更重要的是，核小和核仁小RNA主要分布于細(xì) 胞核中，而成熟的miRNA主要分布于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞所分泌的脂雙層小體中，二者的分布區(qū) 域有顯著不同。有鑒于此，核小和核仁小RNA直接拿來(lái)作為miRNA定量參考并不合適。
[0006] 除了內(nèi)源性的RNA定量參考，一些人工合成的非人源的miRNA也被用來(lái)作為插入 式定量參考。該方法是將等量的人工合成的非人源性miRNA在RNA提取的時(shí)候添加到不同 樣本中，在進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR時(shí)通過(guò)檢測(cè)該外源miRNA的含量而將miRNA樣本標(biāo)準(zhǔn)化。常 用的插入式定量參考有來(lái)自于秀麗線蟲(chóng)的cel-miR-39/43/54/238。該方法在樣本中缺乏常 規(guī)使用的定量時(shí)，尤其是在血液檢測(cè)中經(jīng)常使用。但是該方法存在的問(wèn)題也是顯而易見(jiàn)的， 首先，它存在的意義僅在于在RNA提取及后續(xù)檢測(cè)步驟中將技術(shù)性差異標(biāo)準(zhǔn)化和減少實(shí)驗(yàn) 的系統(tǒng)誤差。任何生物性差異及RNA提取前的系統(tǒng)及人工誤差都無(wú)法做到有效標(biāo)準(zhǔn)化。其 次，這種插入式定量參考在操作過(guò)程中又新添加的可能的人工誤差，這樣最直接的效應(yīng)是 導(dǎo)致結(jié)果的誤讀。另外，該定量參考在操作過(guò)程中極易造成難以消除的外源miRNA污染。
[0007] 缺乏有效的內(nèi)源性定量參考在一定程度上制約了miRNA的應(yīng)用。各個(gè)研究所采用 的不同標(biāo)準(zhǔn)一方面說(shuō)明目前迄需把這些具有miRNA定量潛能的候選標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)一步的精確驗(yàn) 證，另一方面提示某一類型的定量參考可能只會(huì)對(duì)某一特定系統(tǒng)發(fā)揮有效作用而無(wú)法移植 到其他系統(tǒng)中，這種情況會(huì)令尋找普遍適用的定量標(biāo)準(zhǔn)更加困難。
[0008] 目前，有研究顯示miR-191和miR-103在眾多的正常和腫瘤組織中均呈現(xiàn)明顯優(yōu) 于5S rRNA和RNU6B高度均一性表達(dá)，該結(jié)果也得到了進(jìn)一步的證實(shí)，該研究發(fā)現(xiàn)miR-103 在所有人類脂肪和不同背景的細(xì)胞中表達(dá)都最為穩(wěn)定。另外一些miRNA內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)有 miR-130b、miR-16、和miR-345。其中miR-16被經(jīng)常用來(lái)作為內(nèi)源性定量參考。但是，這些內(nèi) 源性參考也存在問(wèn)題。比如，有證據(jù)表明miR-191在前列腺癌組織里面表達(dá)下調(diào)。miR-103 在多藥耐藥的胃腺癌細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)。另有研究顯示，miR-16在紅細(xì)胞中的含量很高，一 旦采血是發(fā)生溶血，大量的miR-16就會(huì)被釋放，這樣在后續(xù)的血清學(xué)檢測(cè)中，miR-16便不 適合作為內(nèi)源性參考而使用。
[0009] 基于以上背景，本發(fā)明發(fā)明人分別取等量的來(lái)自于192個(gè)個(gè)體的血清miRNA制備 成文庫(kù)，利用下一代DNA測(cè)序平臺(tái)檢測(cè)了各個(gè)已知miRNA的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)其中miR-30a及 miR-30e在不同個(gè)體之間的表達(dá)最為穩(wěn)定。接下來(lái)本發(fā)明發(fā)明人應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR的方法， 確定miR-30a和miR-30e在幾個(gè)候選內(nèi)參里穩(wěn)定性最佳，且表達(dá)豐度高，從而鑒定出了適合 血清學(xué)檢測(cè)應(yīng)用的miRNA定量參考標(biāo)準(zhǔn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 針對(duì)目前在miRNA相對(duì)定量過(guò)程中存在參考性不足、異質(zhì)化、穩(wěn)定性不足及種 間污染等諸多問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種用于血清/血漿miRNA實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)的內(nèi)參 miR-30e或miR-30a，克服了現(xiàn)有內(nèi)源性和外源性內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)的缺點(diǎn)和誤區(qū)，提供了一種相對(duì) 簡(jiǎn)便、效果更佳的血清miRNA含量標(biāo)準(zhǔn)化的內(nèi)參。
[0011] 本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
[0012] 一種用于血清/血漿miRNA實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)的內(nèi)參，所述內(nèi)參為miR-30e或 miR-30a〇
[0013] 檢測(cè)所述的用于血清/血漿miRNA實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)的內(nèi)參的引物，擴(kuò)增miR-30e 的引物對(duì)序列為3￡0 10勵(lì)：1和5￡〇10勵(lì):2所示；擴(kuò)增1^1?-3(^的引物對(duì)序列為5￡0 10 NO:3 和 SEQ ID NO:2 所示。
[0014] 所述的用于血清/血漿miRNA實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)的內(nèi)參在制備血清/血漿miRNA 內(nèi)參檢測(cè)試劑盒中的應(yīng)用。
[0015] -種血清/血漿miRNA內(nèi)參檢測(cè)試劑盒，該試劑盒含有所述的miR-30e的引物或 者含有所述的miR-30a的引物。
[0016] 所述的用于血清/血漿miRNA實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)的內(nèi)參在制備鑒定前列腺癌預(yù)后 miRNA標(biāo)記分子試劑盒中的應(yīng)用。以及
[0017] 在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述的前列腺癌預(yù)后miRNA標(biāo)記分子為miR-375或 miR-1290〇
[0018] 所述的用于血清/血漿miRNA實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)的內(nèi)參的引物在制備鑒定前列腺 癌預(yù)后miRNA標(biāo)記分子試劑盒中的應(yīng)用。
[0019] 在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述的前列腺癌預(yù)后miRNA標(biāo)記分子為miR-375或 miR-1290〇
[0020] 本發(fā)明的技術(shù)方案由以下4個(gè)步驟組成，（1)血清/血漿制備；（2)miRNA提取； (3)1^尺嫩定量；（4)1^尺嫩逆轉(zhuǎn)錄；（5)實(shí)時(shí)定量？0? ;(6)1^1?-30&/11111?-3〇6表達(dá)穩(wěn)定性分析 (圖1)。各步驟之間有時(shí)間和技術(shù)上的承接關(guān)系。此技術(shù)上的序貫性不能更改。具體步驟 為：
[0021] (1)血清/血漿制備：取等量的來(lái)自于192個(gè)個(gè)體的血清/血漿；（2)miRNA提 ?。翰捎肣IAGEN公司生產(chǎn)的miRNeasy Serum miRNA提取試劑盒提取血清/血衆(zhòng)樣本中 的 miRNA; (3) miRNA 定量：用 Agilent Small RNA Chip 對(duì)從血清中抽提的 small RNA 進(jìn) 行檢測(cè)；（4)miRNA 逆轉(zhuǎn)錄：分別用 Life Technologies 的 TaqMatr? MicroRNA Re