同時檢測xrcc1、ercc、gstp1和gstm1基因多態(tài)性的引物與方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物檢測技術領域，尤其涉及一種同時檢測XRCC1、ERCC、GSTP1和 GSTM1基因多態(tài)性的引物與方法。
【背景技術】
[0002] 鉑類抗癌藥物，包括順鉑、卡鉑和奧沙利鉑等，是目前臨床應用中對多種癌癥具 有較高活性的抗癌藥物，主要通過引起細胞內DNA損傷來清除癌細胞。
[0003]X線修復交叉互補基團1 (XRCC1)，位于人類染色體19ql3. 2-13. 3,大小為33 kb。 切除修復交叉互補基因1 (ERCC1)，為人類DNA損傷修復基因，位于染色體19ql3. 2-13. 3。切 除修復交叉互補基因2 (ERCC2)，參與核苷酸切除修復和基因轉錄，在DNA損傷修復中起著 重要作用。谷胱甘肽S轉移酶Pl(GSTPl)，谷胱甘肽S轉移酶（GST)是體內最重要的II相代 謝酶，通過直接結合化學致癌物或通過與谷胱甘肽結合而發(fā)揮解毒功能，可降解外源性化 合物毒性。GSTM1純合缺失（GSTMl_Loss)可導致酶活性喪失或降低，從而增強機體對某些 毒物或致癌物的敏感性。
[0004] 現有研究數據顯示，XRCC1_R399Q R/R，R/Q和Q/Q基因型頻率分別約為55%，37%， 8% ;ERCC1_C118T C/C，C/T，T/T 基因型頻率分別約為 52. 6%，43. 1%，4. 2% ;ERCC2_L751Q K/ K，K/Q，Q/Q 基因型頻率分別約為 84. 92%，15. 08%，0% ;GSTP1_I105V Ile/Ile(I/I)，Ile/Val (I/V)，Val/Val (V/V)基因型頻率分別為57. 4%，35. 9%，6. 7%。此外，GSTM1基因多態(tài)性在 不同地區(qū)、不同種族的人群間有著不同的分布頻率，GSTMl_Loss基因型頻率在華人群體中 分布較高。
[0005] 因此，通過XRCC1/ERCC1/ERCC2/GSTP1/GSTM1基因多態(tài)性的檢測，有助于預測鉑 類藥物化療的預后，在幫助指導用藥和個性化治療方面具有重要意義。現有技術缺少一種 特異性好、靈敏度高、可實現多個位點同時檢測的XRCC1/ERCC1/ERCC2/GSTP1/GSTM1基因 多態(tài)性檢測引物及其方法。

【發(fā)明內容】

[0006] 為解決現有技術中存在的問題，本發(fā)明提供一種同時檢測XRCC1、ERCC、GSTP1 和GSTM1基因多態(tài)性的引物與方法，具有特異性好、靈敏度高、準確性好等優(yōu)點，實現了 XRCC1/ERCC1/ERCC2/GSTP1/GSTM1基因多態(tài)性的同時檢測。本發(fā)明同時檢測的位點包 括父1?〇：1_1?3990:。.1196厶>6(?.6111399厶作）（5陬4825487)，￡1?〇：1_(：1181' :。.3541'>(：(口. Asnll8=) (SNP ：rsll615), ERCC2_L751Q ：c. 2251A>C(p. Lys751Gln) (SNP ：rsl3181), GSTP1_ I105V :c. 313A>G(p. Ilel05Val) (SNP :rsl695)，GSTMl_Loss :GSTM1 基因缺失。
[0007] 本發(fā)明提供一種同時檢測XRCC1、ERCC、GSTP1和GSTM1基因多態(tài)性的引物，包括 PCR擴增引物和SNaPshot PCR引物；所述PCR擴增引物包括：針對XRCC1_R399Q的上游引物 5'-TCTGACTCCCCTCCAGAIT-3'（SEQ ID NO. 1)和下游引物5'-GCCCCTCAGATCACACCTA-3'（SEQ ID N0.2)，針對 ERCC1_C118T 的上游引物 5'-TCCAGAACACTGGGACATGA-3'（SEQ ID NO.3)和下游引物 5' -TCCCTATTGATGGCTTCTGC-3'（SEQ ID NO. 4)，針 對 ERCC2_L751Q 的上游引物 5'-GGCAAGACTCAGGAGTCACC-3'（SEQ ID N0.5) 和下游引物 5'-CCCTCTCCCTTTCCTCTGTT-3'（SEQ ID N0.6)，針對 GSTP1_ I105V 的上游引物 5' -ACCCCAGGGCTCTATGGGAA-3'（SEQ ID N0.7)和下游引物 5'-TGAGGGCACAAGAAGCCCCT-3'（SEQ ID N0.8)以及針對 GSTMl_Loss 的上游引物 5'-GA ACTCCCTGAAAAGCTAAAGC-3'（SEQ ID N0.9)和下游引物 5'-CTTGGGCTCAAATATACGGTGG-3' (SEQ ID NO. 10);所述 SNaPshot PCR 引物包括：針對 XRCC1_R399Q 的 SNaPshot PCR 引 物 5' -TTTTTTTTAGGGGCAATCCCGTACTGAAGTTCGTGCGCAA-3'（SEQ ID NO. 12)，針對 ERCC2_ L751Q 的 SNaPshot PCR 引物 5' -TTTTTTTAGCAGCTAGAATCAGAGGAGACGCTG-3' （SEQ ID NO. 13)，針對 GSTP1_I105V 的 SNaPshot PCR 引物 5' -TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGCGTGGAGGA CCTCCGCTGCAAATAC-3'（SEQ ID N0.14)以及針對 GSTMl_Loss 的 SNaPshot PCR 引物5'-TTTTCATCATAGACGAGAAAATCTACAA -3' （SEQ ID N0.15)。
[0008] 采用上述技術方案，本發(fā)明提供的同時檢測XRCC1、ERCC、GSTP1和GSTM1基因多態(tài) 性的引物，可以實現XRCC1/ERCC1/ERCC2/GSTP1/GSTM1基因多態(tài)性的特異性檢測，不會發(fā) 生交叉反應，準確性好。
[0009]優(yōu)選地，所述 PCR 擴增引物中，XRCC1_R399Q、ERCC1_C118T、ERCC2_L751Q、GSTP1_ I105V 和 GSTMl_Loss 的引物濃度比為 1 :1 :1 :1 :1 ;所述 SNaPshot PCR 引物中，XRCC1_ R399Q、ERCC1_C118T、ERCC2_L751Q、GSTP1_I105V和 GSTMl_Loss 的引物濃度比為 1 :1 :1 :1 : 1〇
[0010] 相應地，本發(fā)明還提供一種同時檢測XRCC1、ERCC、GSTP1和GSTM1基因多態(tài)性的方 法，包括如下步驟:A)提取DNA樣品；B)采用權利要求1或2中所述的PCR擴增引物進行多 重PCR擴增，對擴增產物進行純化；C)采用權利要求1或2中所述的SNaPshot PCR引物進 行SNaPshot PCR擴增，對擴增產物進行純化；D)毛細管電泳技術進行檢測，對檢測結果進 行分析，確定SNP位點及其基因型。
[0011] 優(yōu)選地，所述步驟A )中的DNA樣品為EDTA抗凝外周血的DNA樣品。
[0012] 優(yōu)選地，所述步驟B)中的多重PCR擴增反應條件包括：階段1 :98°C 3min ;階段2 : 98°(：1〇8;階段3:581€3〇8;階段4 :72°(：11^11;階段5:返回到階段2,29個循環(huán)；階段6 : 72°C 5min;階段 7:25。(：保溫。即，St印 1:98。C for 3minutes;St印 2:98。C for 10 seconds ；Step 3 :58° C for 30 seconds ；Step 4 ：72° C for 1 minute ；Step 5 ：Go to step 2,29 times ；Step 6 :72° C for 5 minutes ；Step 7 ：25° C forever。
[0013] 所述步驟C)中的SNaPshot PCR擴增反應條件包括：階段1 :96°C 10s ;階段2 : 55°C 5s;階段3:60°C 30s;階段4:返回到階段1，25個循環(huán)；階段5:4°C保溫。即，St印 1 ：96° C forlOseconds ；Step 2 ：55° C for 5 seconds ；Step 3 ：60° C for 30seconds ； Step 4 ：Go to step 1,25 times ；Step 5:4° C forever。
[0014] 優(yōu)選地，所述步驟D)中，采用GENEMAPPERID V4. 1軟件對檢測結果進行分析。
[0015] 此外，本發(fā)明還提供同時檢測XRCC1、ERCC、GSTP1和GSTM1基因多態(tài)性的引物在制 備檢測XRCC1、ERCC、GSTP1和GSTM1基因多態(tài)性試劑中的用途。
[0016] 與現有技術相比，本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明提供了一種同時檢測XRCC1、 ERCC、GSTP1和GSTM1基因多態(tài)性的引物，引物的特異性好，不會發(fā)生交叉反應，準確性好， 實現了 XRCC1/ERCC1/ERCC2/GSTP1/GSTM1基因多態(tài)性的同時檢測，提高了檢測效率。此外， 本發(fā)明還提供了一種同時檢測XRCC1、ERCC、GSTP1和GSTM1基因多態(tài)性的SNaPshot法，通 過使用特異性的PCR擴增引物和SNaPshot PCR引物，具有特異性好、靈敏度高、準確性好等 優(yōu)點，可以為鉑類藥物的臨床用藥提供指導。
【附圖說明】
[0017] 圖1本發(fā)明提供的XRCC1/ERCC1基因引物的擴增片段。
[0018] 圖2本發(fā)明提供的ERCC2/GSTP1/GSTM1基因引物的擴增片段。
[0019] 圖3 XRCC1/ERCC1基因引物擴增產物的部分測序圖。
[0020] 圖4 ERCC2/GSTP1/GSTM1基因引物擴增產物的部分測序圖。
[0021] 圖5樣品的XRCC1/ERCC1/ERCC2/GSTP1/GSTM1基因多態(tài)性檢測結果圖。
【具體實施方式】
[0022] 下面結合附圖和實施例對本發(fā)明做進一步詳細說明。
[0023] 實施例一引物 發(fā)明人針對XRCC1/ERCC1/ERCC2/GSTP1/GSTM1的基因多態(tài)性位點，設計了大量引物， 通過引物反應條件的優(yōu)化和比較，篩選出了特異性好、不會發(fā)生交叉反應且PCR反應條件 非常接近的引物。本發(fā)明提供的引物包括PCR擴增引物和SNaPshot PCR引物，PCR擴增引 物和SNaPshot PCR引物是相對應的。本發(fā)明提供的所有引物序列均通過UCSC數據庫比對， 無已知SNP位點。
[0024]
實施例二引物的特異性 將本發(fā)明提供的引物于UCSC中進行Blasting，XRCC1_R399Q引物擴增片 段位于 chrl9: 44055651-44055888，長度為 238bp ;ERCC1_C118T 引物擴增片段 位于 chrl9: 45923504-45923722，長度為 219bp ;ERCC2_L751Q 引物擴增片段位 于 chrl9: 45854837+45855007，長度為 171bp ;GSTP1_I105V 引物擴增片段位于 chrll: 67352602-67352777,長度為 176bp ;GSTMl_Loss 引物擴增片段位于 chrl: 110232920-110233138,長度為219bp ;結果如圖1至圖2所示，所有引物的擴增片段均覆蓋 了相應的檢測位點，無其它同源基因。
[0025] 使用表1中PCR擴