棉花GbGUT1基因及其編碼蛋白和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體的，涉及一種棉花Gb⑶T1基因及其編碼蛋白和應(yīng) 用。
【背景技術(shù)】
[0002] 棉纖維品質(zhì)主要由棉纖維的發(fā)育情況所決定。棉纖維實(shí)質(zhì)上是種皮毛，是由位于 子房?jī)?nèi)的胚珠外被上的表皮細(xì)胞發(fā)育分化而成的一種單細(xì)胞結(jié)構(gòu)。從形態(tài)上講，棉纖維細(xì) 胞的發(fā)育過(guò)程是細(xì)胞超常伸長(zhǎng)和細(xì)胞壁超常加厚的過(guò)程。纖維發(fā)育過(guò)程主要經(jīng)歷纖維原始 細(xì)胞分化突起、纖維細(xì)胞伸長(zhǎng)（初生壁形成期）、次生壁合成和增厚以及脫水成熟4個(gè)階段， 是多種基因共同控制表達(dá)的復(fù)雜過(guò)程。伸長(zhǎng)期和次生壁加厚期是棉纖維品質(zhì)形成的關(guān)鍵時(shí) 期。初生細(xì)胞壁的合成是細(xì)胞伸長(zhǎng)期的重要活動(dòng)之一，與纖維長(zhǎng)度直接相關(guān)。伸長(zhǎng)階段還 伴隨著次生壁纖維素沉積的加速。在伸長(zhǎng)期結(jié)束之前，纖維細(xì)胞開(kāi)始次生細(xì)胞壁的合成，主 要是纖維素的淀積，纖維細(xì)胞次生壁的加厚決定纖維強(qiáng)力。
[0003] 棉纖維細(xì)胞壁主要包括纖維素和木葡聚糖、木聚糖、果膠多糖等非纖維素成分。在 棉纖維的次生壁中，除了含有纖維素外，還含非纖維素、蛋白和芳香烴等物質(zhì)，這就預(yù)示著 非纖維素在次生壁形成中也具有重要作用。雙子葉植物中的木聚糖主要為葡糖醛酸木聚 糖。木聚糖與次生壁形成有密切關(guān)系，甚至木聚糖合成酶的活性變化可以作為次生壁形成 的標(biāo)志之一。有研究表明葡糖醛酸在棉纖維從初生壁到次生壁轉(zhuǎn)換過(guò)程中，含量逐漸升高， 在次生壁開(kāi)始加厚時(shí)，含量最高，隨后開(kāi)始下降，這就表明葡糖醛酸轉(zhuǎn)移酶在次生壁加厚期 具有重要作用。因此需要對(duì)棉花葡糖醛酸轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行深入的研究，尋找棉花葡糖醛酸轉(zhuǎn)移 酶基因，從而為促進(jìn)棉纖維品質(zhì)提供新的研究方向和途徑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種棉花葡糖醛酸轉(zhuǎn)移酶基因及其 編碼蛋白和應(yīng)用，為棉纖維品質(zhì)改良基因工程提供新的候選基因和手段。
[0005] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種棉花Gb⑶T1基因，所述基因的開(kāi)放閱讀框 (0RF)序列長(zhǎng)度為1239bp，核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0006] 本發(fā)明所提供的棉花Gb⑶T1基因在纖維強(qiáng)力不同的棉種中表達(dá)量不同，Gb⑶T1 在棉纖維發(fā)育次生壁加厚期上調(diào)表達(dá)，在陸地棉中棉所8號(hào)中的表達(dá)高峰在開(kāi)花后30天 (30DPA, days post-anthesis)，在海島棉Pima90_53中的表達(dá)高峰在25DPA，說(shuō)明此基因與 纖維強(qiáng)力有關(guān)，在非纖維素多糖合成中發(fā)揮重要作用。
[0007] 本發(fā)明還提供了所述的棉花Gb⑶T1基因所編碼的蛋白，所述基因的開(kāi)放閱讀框 序列編碼412個(gè)氨基酸，氨基酸序列如SEQ ID N0. 2所示。
[0008] 本發(fā)明還提供了一種含有棉花Gb⑶T1基因的表達(dá)載體。
[0009] 可選的，所述表達(dá)載體為反義表達(dá)載體。
[0010] 可選的，所述表達(dá)載體為真核表達(dá)載體。
[0011] 例如，所述原核表達(dá)載體可以為將Gb⑶T1基因的核苷酸序列克隆進(jìn)pET-41a(+) 載體獲得的。
[0012] 本發(fā)明還提供了含有所述表達(dá)載體的宿主。
[0013] 可選的，所述宿主可以為大腸桿菌、模式生物（如擬南芥）、棉花等。
[0014] 例如，所述棉花可以為海島棉Pima90-53或中棉所8號(hào)。
[0015] 本發(fā)明還提供了所述棉花GbGUTl基因或所述表達(dá)載體在提高棉纖維品質(zhì)中的應(yīng) 用。
[0016] 本發(fā)明還提供了用于擴(kuò)增所述棉花Gb⑶T1基因的特異性引物對(duì)：
[0017] 上游引物：5' -CCATCCTTCTTCCGAGTGCTTCAG-3' ；
[0018]下游引物：5 ' -GGAGGCCTGGTGAGGCAGTGAAT-3 '。
[0019] 本發(fā)明所提供的棉花Gb⑶T1與棉纖維發(fā)育有重要關(guān)系，可以利用基因工程手段 進(jìn)一步轉(zhuǎn)化棉花，從而提高棉纖維品質(zhì)。轉(zhuǎn)反義GbGUTl的擬南芥的果膠含量、醛酸糖含量 和纖維素含量相比于野生型均顯著升高，而UGD酶活下降。表型也發(fā)生一系列變化，莖長(zhǎng)變 短，莖粗變細(xì)，莖桿強(qiáng)度變?nèi)酢?br>【附圖說(shuō)明】
[0020] 圖1為本發(fā)明棉花Gb⑶T1的ORF RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果，其中，M為DL 2000Marker，H 為空白對(duì)照，⑶T為GbCTTl的0RF擴(kuò)增產(chǎn)物；
[0021] 圖2為本發(fā)明棉花Gb⑶T1在陸地棉中棉所8號(hào)（CRI)和海島棉Pima90-53中纖 維發(fā)育不同時(shí)期的表達(dá)結(jié)果；
[0022] 圖3為轉(zhuǎn)Gb⑶T1的E. coli BL21(DE3)誘導(dǎo)前和誘導(dǎo)后目的融合蛋白表達(dá)的 SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果，箭頭所示為目的融合蛋白，其中，M:蛋白標(biāo)準(zhǔn)分子量，1 :BL21(DE3) plys空菌株未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的總蛋白，2 :pET-41a(+)空載體未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的總蛋白；3: Gb⑶Tl-pET-41a(+)未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的總蛋白；4 :BL21(DE3)plys空菌株經(jīng)IPTG誘導(dǎo)3h 后的總蛋白；5 :pET-41a⑴空載體經(jīng)IPTG誘導(dǎo)3h后的總蛋白；6 :Gb⑶Tl-pET-41a(+) 經(jīng)IPTG誘導(dǎo)3h后的總蛋白；7 :BL21(DE3)plys空菌株經(jīng)IPTG誘導(dǎo)6h后的總蛋白；8: pET-41a(+)空載體經(jīng)IPTG誘導(dǎo)6h后的總蛋白；9 :Gb⑶Tl-pET-41a(+)經(jīng)IPTG誘導(dǎo)6h后 的總蛋白；10 :BL21(DE3)plys空菌株經(jīng)IPTG誘導(dǎo)9h后的總蛋白；11 :pET-41a(+)空載體 經(jīng)IPTG誘導(dǎo)9h后的總蛋白；12 :Gb⑶Tl-pET-41a(+)經(jīng)IPTG誘導(dǎo)9h后的總蛋白；
[0023] 圖4為轉(zhuǎn)A-GUT(反義Gb⑶T1)擬南芥的后代篩選；其中，左圖為全局圖，右圖為局 部放大圖。
[0024]圖5為轉(zhuǎn)A-GUT (反義Gb⑶T1)擬南芥株系與野生型纖維素含量的比較圖，其中， col:野生型擬南芥對(duì)照，A-2、A-5和A-9:轉(zhuǎn)A-GUT擬南芥T3代不同株系；
[0025] 圖6為轉(zhuǎn)A-GUT (反義Gb⑶T1)擬南芥株系與野生型醛酸糖含量的比較圖，其中， col:野生型擬南芥對(duì)照，A-2、A-5和A-9:轉(zhuǎn)A-GUT擬南芥T3代不同株系；
[0026] 圖7為轉(zhuǎn)A-GUT(反義Gb⑶T1)擬南芥株系與野生型果膠含量的比較圖，其中， col:野生型擬南芥對(duì)照，A-2、A-5和A-9:轉(zhuǎn)A-GUT擬南芥T3代不同株系；
[0027] 圖8為轉(zhuǎn)A-GUT(反義Gb⑶T1)擬南芥株系與野生型U⑶酶活的比較圖，其中，col: 野生型擬南芥對(duì)照，A-2、A-5和A-9:轉(zhuǎn)A-GUT擬南芥T3代不同株系。
【具體實(shí)施方式】
[0028] 下面將通過(guò)【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。
[0029] 實(shí)施例1棉花Gb⑶T1的克隆
[0030] (1) Gb⑶T10RF 的獲得
[0031] 以cDNA-AFLP獲得的差異表達(dá)片段（TDF)為基礎(chǔ)進(jìn)行電子拼接，獲得一個(gè)1535bp 的cDNA序列，其中包括長(zhǎng)度為1239bp的0RF。
[0032] (2)設(shè)計(jì)Gb⑶T1的引物
[0033] 依據(jù)拼接序列設(shè)計(jì)特異性引物，GbGUTl的上、下游引物分別為：
[0034] 上游引物：5 ' -CCATCCTTCTTCCGAGTGCTTCAG-3 ' ；
[0035] 下游引物：5 ' -GGAGGCCTGGTGAGGCAGTGAAT-3 '。
[0036] (3)目的基因的擴(kuò)增
[0037] 利用設(shè)計(jì)的特異性引物以海島棉Pima90_53開(kāi)花后15天的棉纖維cDNA為模板進(jìn) 行PCR擴(kuò)增，獲得Gb⑶T1目的條帶（圖1)。
[0038] (4)陽(yáng)性克隆的獲得及基因序列分析
[0039] 將回收得到的Gb⑶T1的PCR產(chǎn)物與pGM-T連接，采用天根生化科技（北京）有限 公司的pGM-T克隆試劑盒克隆目的片段，連接產(chǎn)物采用熱激轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入大腸桿菌T0P10感 受態(tài)細(xì)胞（購(gòu)自天根生化科技有限公司），并篩選陽(yáng)性克隆，經(jīng)上海生工生物工程有限公司 測(cè)序，所測(cè)序列與預(yù)期結(jié)果一致，對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行BlastX，結(jié)果顯示GbGUTl含有GUT基因家 族的extosin保守結(jié)構(gòu)域Gb⑶T10RF序列如SEQ ID NO. 1所示，長(zhǎng)1239bp，編碼的氨基酸序 列為 SEQ ID N0. 2。
[0040] 實(shí)施例2棉花GbGUTl編碼蛋白的相似性分析和保守結(jié)構(gòu)域分析 [0041 ] 經(jīng)保守結(jié)構(gòu)域分析，Gb⑶T1編碼glucuronyltransferase，含有extosin保守結(jié)構(gòu) 域，屬于GT family 47家族蛋白。通過(guò)多重序列序列比對(duì)和同源進(jìn)化樹(shù)分析表明，Gb⑶T1 含有GT signature及保守氨基酸序列[FCLQPx (16) GCIPV]，和擬南芥Atlg27440 (At⑶T1)， Np⑶T1同源性最高，和AtFra8(At2g28110)同源性較高。但是，和棉花上已經(jīng)發(fā)表的相關(guān)基 因GhGlcATl及GhUGTl，GhUGT2同源性較低，聚類到不同的分支上，并且后三者不含有上述 的 motif。
[0042] 實(shí)施例3棉花Gb⑶T1的時(shí)空表達(dá)模式分析
[0043] 使用天根生化科技（北京）有限公司的RNAplant提取試劑盒提取陸地棉中棉所 8號(hào)和海島棉Pima90-53開(kāi)花當(dāng)天胚珠以及5、10、15、20、25、30、35、40DPA的纖維RNA。
[0044] 米用大連寶生物公司的 PrimeScript? RT reagent Kit With gDNA Eraser (Perfect Real Time)試劑盒合成以上9個(gè)時(shí)期的單鏈cDNA，濃度用Beckman DU800 分光光度計(jì)測(cè)定。對(duì)棉花Gb⑶T1在棉纖維發(fā)育不同時(shí)期的表達(dá)進(jìn)行Real-time PCR分析。 內(nèi)參選用EF1 a，其引物序列如下：
[0045] EF1 a F ： 5r -GCTGAGATGAACAAGAGGTCATTC-3r ；
[0046] EFlaR：5, -GGAATCAATAATCAAAACAGCACAG-3r 〇
[0047] 參見(jiàn)圖2,棉花Gb⑶T1在陸地棉中棉所8號(hào)和海島棉Pima90_53中纖維發(fā)育不同 時(shí)期的Real-time PCR結(jié)果顯示，Gb⑶T1均在纖維發(fā)育的次生壁加厚期表達(dá)。在中棉所8 號(hào)中Gb⑶T1的表達(dá)量高于Pima90-53。但是在Pima中Gb⑶T1在2OTPA出現(xiàn)表達(dá)高峰，而 在中棉所8號(hào)中，Gb⑶T1在30DPA出現(xiàn)表達(dá)高峰，稍晚于Pima90-53。該基因在不同棉花品 種中呈現(xiàn)出不同的表達(dá)模式，說(shuō)明此基因在兩個(gè)棉花品種中的作用可能有差異。
[0048] 實(shí)施例4Gb⑶T1原核表達(dá)載體的構(gòu)建及誘導(dǎo)表達(dá)
[0049] (1)原核表達(dá)載體的構(gòu)建和轉(zhuǎn)化子的獲得
[0050] 利用EcoRI和Hind III分別對(duì)實(shí)施例1中克隆得到的Gb⑶T1的0RF和原核表達(dá)載 體pET-41a(+)質(zhì)粒（本實(shí)驗(yàn)室保存）進(jìn)行雙酶切并回收目的片段。
[0051] 將表達(dá)載體與目的基因片段進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a，經(jīng)過(guò)PCR和酶切檢 測(cè)，篩選含重組質(zhì)粒的陽(yáng)性克隆，利用熱激法將含有陽(yáng)性克隆的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BL21(DE3)菌株 (購(gòu)自天根生化科技有限公司）中，并進(jìn)一步挑取陽(yáng)性克隆，經(jīng)質(zhì)粒提取、酶切檢測(cè)獲得含 有重組質(zhì)粒pET-41a(+)-GUTl的大腸桿菌工程菌株。
[0052] (2)重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與鑒定
[0053] 將含有以上各類型的重組質(zhì)粒和含有空質(zhì)粒（對(duì)照）的BL21 (DE3)菌株在28°C， IPTG終濃度為0. 8mmol/L的條件下誘導(dǎo)9h后，進(jìn)行SDS-PAGE垂直式凝膠電泳，其中分離膠 為12