蛋白配體和基因同時(shí)檢測(cè)試劑盒及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種核酸和蛋白同時(shí)檢測(cè)方法和檢測(cè)試劑盒的應(yīng)用方法，尤其是涉及 一種通過(guò)核酸信標(biāo)配基將蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)換成核酸信號(hào)完成蛋白和基因檢測(cè)統(tǒng)一，再利用實(shí)時(shí) 定量-PCR進(jìn)行同時(shí)檢測(cè)的方法，屬于蛋白核酸檢測(cè)領(lǐng)域，具體的說(shuō)是蛋白配體和基因同時(shí) 檢測(cè)試劑盒及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 早期蛋白質(zhì)檢測(cè)是以抗體同特定待檢物蛋白質(zhì)的低解離常數(shù)和一定的特異性為 基礎(chǔ)實(shí)現(xiàn)的檢測(cè)技術(shù)，該檢測(cè)技術(shù)中抗體捕捉方法是簡(jiǎn)易、方便的篩選方法。以抗體捕捉法 為例，是用抗原包被于固相支持物，然后用抗體去結(jié)合抗原，洗板去掉未結(jié)合的抗體，最后 用和結(jié)合抗體特異識(shí)別的標(biāo)記分子去檢測(cè)結(jié)合抗體，許多抗體捕捉法是利用間接法來(lái)檢測(cè) 抗體。例如，檢測(cè)抗體是鼠抗體，檢測(cè)分子可能是帶檢測(cè)標(biāo)記的兔抗鼠抗體。傳統(tǒng)的檢測(cè)標(biāo) 記包括放射性同位素，染料和作用于底物產(chǎn)生可檢測(cè)分子如色原的酶。
[0003] 隨著基因技術(shù)應(yīng)用的快速發(fā)展，在抗原抗體檢測(cè)方面已有較多的基因檢測(cè)技術(shù)。 抗原捕捉檢測(cè)法是檢測(cè)樣品中有無(wú)抗原。首先抗體先結(jié)合到支持物上，然后抗原加入和抗 體反應(yīng)形成復(fù)合物，最后檢測(cè)復(fù)合物，也可以抗原抗體先反應(yīng)形成復(fù)合物后，再結(jié)合到固相 支持物上，然后檢測(cè)復(fù)合物。檢測(cè)方法中ELISA是廣為人知的免疫檢測(cè)法，還有抗體檢測(cè)法 等。
[0004] 實(shí)時(shí)定量PCR是更先進(jìn)的PCR技術(shù)，已用于核酸分析。在實(shí)時(shí)PCR中，PCR擴(kuò)增 DNA是在非線性標(biāo)記雙熒光雜交探針存在條件下進(jìn)行，其中一種熒光染料用作報(bào)告分子，它 的發(fā)射光譜被第二種熒光染料淬滅。實(shí)時(shí)PCR在鏈延伸時(shí)，利用Taq多聚酶5'核酸活性切 割雜交探針，結(jié)果使報(bào)告熒光染料從淬滅染料中釋放出來(lái)，致報(bào)告分子發(fā)射峰值增加。整個(gè) 反應(yīng)實(shí)時(shí)監(jiān)控。逆轉(zhuǎn)錄-PCR也可應(yīng)用。系列檢測(cè)系統(tǒng)用96孔熱循環(huán)儀可連續(xù)檢測(cè)每孔 中PCR反應(yīng)時(shí)的熒光譜，因此，可排除復(fù)制子試驗(yàn)室污染。
[0005] 核酸與蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)相互作用是普遍現(xiàn)象。核酸能折疊形成二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié) 構(gòu)，這對(duì)其與蛋白質(zhì)相互結(jié)合作用非常重要。通過(guò)使核苷酸序列多樣化而使體外檢測(cè)核酸 蛋白質(zhì)相互作用方法成熟。SELEX技術(shù)被用來(lái)分離所選靶目標(biāo)的核苷酸配體，這些配體被稱 為配基或適配體，意即核酸可以形成一定結(jié)構(gòu)并適配入靶分子的口袋，SELEX技術(shù)就是利用 該原理篩選靶分子配基的方法。
[0006] 盡管上述進(jìn)步顯著，但診斷方法仍需提高靈敏度，減少人工操作，改進(jìn)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)以 快速分析樣品中靶標(biāo)的存在與否及對(duì)其定量。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明提出一種通過(guò)實(shí)時(shí)定量-PCR擴(kuò)增核酸信標(biāo)和基因核酸分子，實(shí)施對(duì)配體 和基因同時(shí)檢測(cè)的技術(shù)方法，對(duì)細(xì)胞、微生物、基因和蛋白質(zhì)等組學(xué)的研究具有重要意義。
[0008] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所述的蛋白配體和基因同時(shí)檢測(cè)試劑盒，其特征在于：所 述試劑盒中主要包括：所述試劑盒中主要包括：（I)待測(cè)樣品、占:捕捉瓊脂磁珠試劑、議: 洗滌液、檢測(cè)試劑、核酸提取試劑、檢測(cè)體系； 所述待測(cè)樣品含有被檢測(cè)蛋白配體和基因； 所述(§捕捉瓊脂磁珠試劑是瓊脂磁珠-捕捉靶分子抗體復(fù)合物； 所述(|)洗滌液是 〇· OlM PBS+0.0 5M MgCl2+0. 01Tween-20 ; 所述g.:.檢測(cè)試劑是〇. OlM核酸信標(biāo)配基檢測(cè)分子+0.0 lM PBS+0. 05M 1%(：12的混合溶 液； 所述核酸提取試劑是體積比為含飽和酚：氯仿：異戊醇（25 :24 :1); 所述(§)檢測(cè)體系為含有靶分子核酸信標(biāo)配基和基因的Taqman探針和引物的常規(guī)檢測(cè) 試劑。
[0009] 本發(fā)明所述的蛋白配體和基因同時(shí)檢測(cè)試劑盒的應(yīng)用，其特征在于：包括下述步 驟： (1) 將(!)捕捉瓊脂磁珠試劑加入到Il待測(cè)樣品；在37r，45min孵育，使瓊脂磁珠-捕 捉靶分子抗體復(fù)合物與待測(cè)樣品中的靶分子結(jié)合，然后利用磁性分離分離出磁珠與清液并 分別吸出，然后用洗滌液洗滌磁珠3次，3min/次，形成待測(cè)復(fù)合物待用； (2) 再在上述步驟（1)中形成的待測(cè)復(fù)合物中加入檢測(cè)試劑，該泛:檢測(cè)試劑中的核 酸信標(biāo)配基與靶分子結(jié)合形成捕捉瓊脂磁珠-靶分子-核酸信標(biāo)配基結(jié)構(gòu)，將未結(jié)合形成 捕捉瓊脂磁珠-靶分子-核酸信標(biāo)配基結(jié)構(gòu)的分子洗掉，用洗滌液洗滌3次，3min/次，得到 磁珠液待用； (3) 將完成上述步驟的磁珠液中加入步驟（1)分離吸出的清液，再利用(§)核酸提取試 劑提取核酸； (4) 將步驟（3)提取出的核酸進(jìn)行擴(kuò)增基因常規(guī)檢測(cè)； (5) 進(jìn)行常規(guī)檢測(cè)。
[0010] 所述φ待測(cè)樣品為血清、尿液、細(xì)胞液、菌液或內(nèi)分泌液需靶分子和基因同時(shí)檢 測(cè)的生物樣本中的一種。
[0011] 所述?特測(cè)樣品中的蛋白配體為病原體、細(xì)菌、病毒、細(xì)胞生物體分子，以及蛋白 質(zhì)以外的任何配體分子的任意一種；基因是病原體、細(xì)菌、病毒、細(xì)胞生物體內(nèi)的基因序列。
[0012] 所述:'?捕捉瓊脂磁珠試劑指在瓊脂磁珠上鏈接抗體、抗原和核酸配基，具有捕捉 靶分子，將靶分子結(jié)合形成磁珠復(fù)合物；在多靶分子和基因檢測(cè)時(shí)，捕捉瓊脂磁珠可以是多 種特異性靶分子捕捉磁珠的混合，也可以是具有多種靶分子捕捉能力的單一磁珠；被檢測(cè) 基因可以是某一生物體單一基因，也可以是多種生物體的多基因。
[0013] 所述核酸信標(biāo)配基序列由蛋白配基、人為標(biāo)記序列組成；核酸信標(biāo)配基是在《新型 配體檢測(cè)方法》CN1521272專利中已獲保護(hù)，是單鏈配基和雙鏈信標(biāo)組成；所述的核酸信標(biāo) 配基連接在靶分子上，其中的信標(biāo)序列是人為修飾DNA或RNA序列作為信號(hào)分子，通過(guò)對(duì)信 號(hào)修飾序列的PCR擴(kuò)增，實(shí)現(xiàn)對(duì)靶分子的檢測(cè)；該修飾DNA或RNA序列具有一對(duì)引物和中間 的人為標(biāo)記序列，針對(duì)被檢測(cè)的靶分子和檢測(cè)目的的要求這一對(duì)引物可以相同也可以不相 同，中間的標(biāo)記序列是靶分子的標(biāo)記；如：在多種樣品同時(shí)檢測(cè)時(shí)一對(duì)相同引物可以使多 種樣品檢測(cè)數(shù)據(jù)更切合實(shí)際，標(biāo)記序列則是和檢測(cè)靶分子一一對(duì)應(yīng)。
[0014] 所述擴(kuò)增基因常規(guī)檢測(cè)為：實(shí)時(shí)定量-PCR檢測(cè)、恒溫基因擴(kuò)增檢測(cè)和微陣列檢測(cè) 中的一種。
[0015] 所述瓊脂磁珠是順磁Fe3O4微粒外包裹瓊脂的球形微粒，捕捉瓊脂磁珠是瓊脂磁 珠上的瓊脂活化帶有羧基連接捕捉抗體，形成瓊脂磁珠-抗體復(fù)合物，經(jīng)過(guò)封閉形成的瓊 脂磁珠。
[0016] 所述實(shí)時(shí)定量-PCR檢測(cè)是單一和多重實(shí)時(shí)定量PCR，是對(duì)靶分子復(fù)合物的檢測(cè)方 法；檢測(cè)方法還可以采用標(biāo)記在檢測(cè)分子上的自化學(xué)發(fā)光物質(zhì)、光量子、酶、熒光和同位素 中的一種或多種進(jìn)行檢測(cè)。
[0017] 所述通過(guò)對(duì)DNA或RNA修飾序列的變換來(lái)達(dá)到數(shù)據(jù)的效正和有效的消除污染。
[0018] 所述通過(guò)用實(shí)時(shí)定量-PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)或寡核苷酸芯片檢測(cè)來(lái)數(shù)據(jù)采集 和處理。
[0019] 所述通過(guò)用實(shí)時(shí)定量-PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)來(lái)數(shù)據(jù)采集和處理，其整個(gè)過(guò)程 都在PCR管內(nèi)一次性完成，無(wú)須將產(chǎn)物轉(zhuǎn)換地方，進(jìn)行提純、檢測(cè)等步驟，并且PCR產(chǎn)物可在 PCR管封閉銷(xiāo)毀，避免逸出產(chǎn)物造成環(huán)境污染。
[0020] 所述寡核苷酸芯片檢測(cè)來(lái)數(shù)據(jù)采集和處理，其過(guò)程是將PCR產(chǎn)物通過(guò)移液器轉(zhuǎn)入 寡核苷酸芯片檢測(cè)體系內(nèi)全自動(dòng)化完成，其過(guò)程是全封閉的，無(wú)須進(jìn)行人工提純、分離、檢 測(cè)等步驟。
[0021] 所述全部檢測(cè)過(guò)程，包括：加樣、孵育、洗管、實(shí)時(shí)定量-PCR儀(或微陣芯片）的數(shù) 據(jù)檢測(cè)和數(shù)據(jù)處理、發(fā)報(bào)告等。
[0022] 本發(fā)明所述蛋白配體和基因同時(shí)檢測(cè)試劑盒及應(yīng)用，其有益效果在于：本發(fā)明的 檢測(cè)試劑盒是通過(guò)核酸信標(biāo)配基與靶分子結(jié)合將靶分子信號(hào)轉(zhuǎn)換成核酸信號(hào)，完成蛋白信 號(hào)與核酸信號(hào)的統(tǒng)一，再利用實(shí)時(shí)定量-PCR進(jìn)行定量檢測(cè)；該檢測(cè)方法可使多種非核酸配 體的信號(hào)通過(guò)核酸信標(biāo)配基轉(zhuǎn)換成核酸信號(hào)，具有快速、靈敏度高、特異性強(qiáng)、多配體微陣 檢測(cè)和可機(jī)械化完成等特點(diǎn)；本發(fā)明的檢測(cè)方法，檢測(cè)時(shí)使用器皿單一，即一次性PCR管； 操作過(guò)程簡(jiǎn)單，數(shù)據(jù)采集及處理可在全封閉的情況下完成，擴(kuò)增產(chǎn)物可封閉銷(xiāo)毀，有效保證 環(huán)境的潔凈；本發(fā)明的操作簡(jiǎn)單，易于普及應(yīng)用；利用本發(fā)明組裝的檢測(cè)試劑盒或構(gòu)建的 生物芯片能夠廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)研究與臨床檢測(cè)，具有較高的經(jīng)濟(jì)效益與社會(huì)效益。
【附圖說(shuō)明】
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